Name: utilization of grafix for the detection of transient interactors of saccharomyces cerevisiae spliceosome subcomplexes
Uploaded: 2020-11-09T15:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes at JoVE.com

Bu çalışma bir FAPESP hibesi (15/06477-9) tarafından desteklendi.

1. Maya toplam özü hazırlığı
<ol><li>1 L YNB-glu ortam (%2 m/v glikoz ile desteklenmiş Maya Nitrojen Temeli)9'da TAP etiketine kaynaşmış birleştirme faktörlerinden birini uygun amino asitler veya çekirdek bazlarla ifade eden maya hücrelerini büyütün, Bu durumda, adenin (20 μg/mL), lösin (30 μg/mL), triptofan (30 μg/mL), OD600 = 1.0'a kadar.</li>
	<li>1 L kültüründen hücreleri 17.000 x g'da üç adet 500 mL santrifüj şişesinde 4 °C'de 10 dakika san...

<ol>
	<li>Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., L&#252;hrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+nuclear+pre-mRNA+splicing+in+higher+eukaryotes.">Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417 (2019).</li><li>Yan, C., Wan, R., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+pre-mRNA+splicing+through+structural+biology+of+the+spliceosome.">Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409 (2019).</li><li>Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+regulation+of+spliceosomal+RNA+helicases.">Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).</li><li>Kastner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GraFix:+sample+preparation+for+single-particle+electron+cryomicroscopy.">GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy.</a> Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).</li><li>Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafix:+stabilization+of+fragile+macromolecular+complexes+for+single+particle+cryo-EM.">Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).</li><li>Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+yeast+activated+spliceosome+at+3.5+&#197;+resolution.">Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 &#197; resolution.</a> Science. 353 (6302), 895-904 (2016).</li><li>Ohi, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+revelas+stable+multiprotein+complexes+in+both+fission+and+budding+yeasts+containing+Myb-related+Cdc5p/Cef1p,+novel+pre-mRNA+splicing+factors,+and+snRNAs.">Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).</li><li>Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+yeast+mutant+RNA+exosome+complexes.">Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes.</a> Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).</li><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterizatioin+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).</li><li>Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+fractionation+of+yeast+splicing+extract.">Preparation and fractionation of yeast splicing extract.</a> Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).</li><li>Umen, J. G., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+a+U5+snRNP+protein+in+3'+splice+site+selection.">A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection.</a> Genes &amp; Development. 9, 855-868 (1995).</li><li>Dunn, E. A., Rader, S. D., Hertel, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+yeast+whole+cell+splicing+extract.">Preparation of yeast whole cell splicing extract.</a> Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 1126, 123-135 (2014).</li><li>Hill, H. D., Straka, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+determination+using+bicinchoninic+acid+in+the+presence+of+sulfhydryl+reagents.">Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents.</a> Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).</li><li>Cepeda, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+assembly+factor+Nop53+controls+association+of+the+RNA+exosome+with+pre-60S+particles+in+yeast.">The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).</li><li>Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mRNA+splicing+in+vitro.">Yeast mRNA splicing in vitro.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14780-14792 (1985).</li></ol>

Protein-protein ve ribonik asitler-protein etkileşimleri çapraz bağlama ajanları kullanılarak stabilize edilebilir. Elde eden kompleksin gliserol gradyanı üzerinde ultrasantrifüjasyona dayanacak şekilde kararlı olması önemlidir. Ayrıca, arabellek koşulları etkileşime izin vermeli, ancak belirli olmayan bağlamayı önlemek için yeterince katı olmalıdır. Burada gösterilen deneylerde, in vitro birleştirme reaksiyonları için önceden kurulmuş bir tampon çözeltisi kullandık15</su...

Birleştirme, çok sayıda faktörün koordineli bir şekilde bağlanmasını ve serbest bırakılmasını gerektiren son derece dinamik bir işlemdir. Bu birleştirme faktörleri arasında RNA bağlayıcı proteinler, ATPases, helicases, protein kinazları ve fosfatazlar, ubiquitin ligases, diğerleri arasında1,2,3; ve moleküler yeniden düzenlemelerin gerçekleşmesine izin vermek için, bu faktörlerin bazıları çok geçici olarak spliceosome alt komitelerine bağlanır ve bu RNP ara komplekslerinin izolasyonu ve tanımlanmasını çok zorlaştırır.
İşte, Grafix yöntemi4,5'i, maya birleştirme faktörü Cwc24'ün Bact complex6 ile etkileşimini stabilize etmek için kullandık, bu alt sıkıştırıcıya birlikte bağlı diğer faktörlerin tanımlanmasına izin vermek ve ubiquitin ligase Prp19, Cwc24'ün on dokuz (NTC) kompleksine bağlanmasında veya serbest bırakılmasında ve aktivasyondan önce intronun 5' ucuna kadar herhangi bir rol oynar ve ilk transesterifikasyon reaksiyonu alır yer. Makromolekülleri gliserol gradyanı boyunca artan bir çapraz bağlantı konsantrasyonuna maruz kalmanın avantajı, kompleksler arası çaprazbağlantılardan 4,5ve dolayısıyla agregaların oluşumunu önlemesidir.
Bu yöntem, büyük komplekslerin izolasyonuna izin vermesine rağmen, büyük dinamik kompleksler içinde geçici etkileşimleri sürdürmek için güvenilir olmayabileceği protein koimmunoprecipitation ve çekme tahlillerinin tamamlayıcısı olarak kullanılmıştır7,8. Gliserol gradyanındaki fiksasyon reaktiflerinin kullanımı, bu faktörlerin bağlanmasını stabilize ederek, belirli proteinlerin birleştirme altcomplexes ile etkileşimlerinin onaylanmasını sağlar. Seçilen çapraz bağlantı kimyasal olarak geri döndürülemez olduğundan, geri kazanılan fraksiyonlarda bulunan proteinler gradyan santrifüjlemeden sonra nokta lekesi ile analiz edildi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>07-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-Rabbit IgG</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EconoSystem</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1-800-424-6723</td>
			<td>Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction Recovery System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>270-331580</td>
			<td>Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient Master Model 107ip</td>
			<td>Biocomp</td>
			<td>107-201M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Mill MM 200</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>207460001</td>
			<td>Ball Mill device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor F12-6x500Lex</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>096-062375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36-101-0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging Bucket Rotor P40ST</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge CP 80 NX</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>901069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilization of grafix for the detection of transient interactors of saccharomyces cerevisiae spliceosome subcomplexes

Pre-mRNA birleştirme, karmaşık bileşenlerin montajı, RNA işlemesi ve serbest bırakılması sırasında spliceosome alt komkomplexlerinin birçok moleküler yeniden düzenlenmesini içeren çok dinamik bir süreçtir. Gliserol gradyan santrifüjleme fonksiyonel ve yapısal çalışmalar için protein veya RNP (RiboNucleoProtein) komplekslerinin ayrılması için kullanılmıştır. Burada, ilk olarak tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskopisi için makromoleküler kompleksleri arındırmak ve stabilize etmek, spliceosome kompleksine geçici olarak bağlanan birleştirme faktörleri arasındaki etkileşimleri tanımlamak için geliştirilen Grafix'in (Gradyan Fiksasyonu) kullanımını açıklıyoruz. Bu yöntem, kompleksleri stabilize etmek için numunelerin artan bir sabitleme reaktif konsantrasyonuna santrifüjlenmesine dayanmaktadır. Gliserol gradyanlarına yüklenen maya toplam özlerinin santrifüjlenmesinden sonra, geri kazanılan fraksiyonlar spliceosome alt komplekslerinin tanımlanması ve bireysel birleştirme faktörlerinin varlığının belirlenmesi için nokta lekesi ile analiz edilir.

Cwc24-TAP'ın sedimantasyon profilini analiz etmek ve Grafix yönteminin birleştirme altkompanlarına bağlanmasını stabilize etmek için etkili olup olmadığını belirlemek için, Cwc24-TAP'ı ifade eden hücrelerin toplam maya özlerini gliserol gradyanları üzerinde santrifüjleme yoluyla, çapraz bağlama ajanı olarak glutaraldehitin varlığında veya yokluğunda ayırdık. Yirmi dört 500 μL fraksiyon örnekleri daha sonra TAP etiketinin CBP kısmına karşı antikor içeren yuva lekesi ile analiz edildi. S...

Watch this Scientific Journal Video about Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes at JoVE.com

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Burada, bir çapraz bağlayıcı varlığında gliserol gradyan santrifüjleme olan Grafix'in (Gradyan Fiksasyonu), spliceosome kompleksine geçici olarak bağlanan birleştirme faktörleri arasındaki etkileşimleri tanımlamak için kullanımını açıklıyoruz.

Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes Geçici Interactors Tespiti için Grafix kullanımı

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

RNA Interactors Protein kinaz memeli hücre döngüsü sırasında RNA-harekete geçirmek, eğitim

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Çay (Camellia sinensis L.) türetilmiştir yeni kurulan hücre süspansiyon kültürü altı sistemik Böcek Ilacı metabolizması üzerinde çalışma Yaprak -ları

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Fırıncı Maya saccharomyces cerevisiae Mitokondriyal Genom İfade Ürünlerinin Etiketlenmesi ve Görselleştirilmesi

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Sıvı KromatografiSi Kullanan Saccharomyces Cerevisiae'nin Nicel Metabolomikleri Tandem Kütle Spektrometresi ile Birleştiğinde

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Metabolik Etiketleme ve İnce Tabaka Kromatografisi ile Saccharomyces serevizisinde Nötr Lipid Sentezinin Analizi

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Kriyo-Elektron Tomografisi için Saccharomyces cerevisiae'nin Hazırlanması ve Kriyo-FIB mikromakinesi

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Tomurcuklanan Maya Sakkaromices cerevisiae'de Submitochondrial Protein Lokalizasyonunun Değerlendirilmesi

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Endojen Drosophila Geçici Reseptör Potansiyel Kanallarının Saflaştırılması

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

Tek Moleküllerin Motilitesi ve S. cerevisiae Hücrelerinden Saflaştırılmış Çift Yönlü Kinesin-5 Cin8 Kümeleri

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...