Name: stepwise cell seeding on tessellated scaffolds to study sprouting blood vessels
Uploaded: 2021-01-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af midler fra University of Michigan - Israel Partnerskab for Forskning. Forfatterne vil gerne takke Uri Merdler, Lior Debbi og Galia Ben David for deres store hjælp og støtte, Nadine Wang, Ph.D. og Pilar Herrera-Fierro, Ph.D. af Lurie Nanofabrication Facility ved University of Michigan, samt Luis Solorio, Ph.D. for oplysende diskussioner af fotolitografi teknikker.

1. Tessellated stillads fabrikation
BEMÆRK: Fotolithografi er en udbredt teknik, der kræver specialiseret udstyr, der typisk er anbragt i et nanofabrik/laboratorium. Den metode, der er fastsat i denne protokol, blev generaliseret så meget som muligt for publikum; det kan dog være nødvendigt med mindre ændringer af procedurerne afhængigt af det udstyr, der er til rådighed for læseren. Vi anbefaler, at du udfører disse procedurer i et rent rum på et nanofabrik for at sikre den højeste ...

<ol>
	<li>Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+is+the+key+challenge+in+tissue+engineering.">Vascularization is the key challenge in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4), 300-311 (2011).</li><li>Landau, S., Guo, S., Levenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Engineered+Vasculature+within+3D+Tissue+Constructs.">Localization of Engineered Vasculature within 3D Tissue Constructs.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 2 (2018).</li><li>Griffith, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+Limits+of+an+in+Vitro+Thick+Prevascularized+Tissue.">Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue.</a> Tissue Engineering. 11 (12), (2005).</li><li>Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+and+therapeutic+aspects+of+angiogenesis.">Basic and therapeutic aspects of angiogenesis.</a> Cell. 146 (6), 873-887 (2011).</li><li>Landau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropoelastin+coated+PLLA-PLGA+scaffolds+promote+vascular+network+formation.">Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation.</a> Biomaterials. 122, 72-82 (2017).</li><li>Lesman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vessel-like+networks+within+multicellular+fibrin-based+constructs.">Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs.</a> Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).</li><li>Richards, D., Jia, J., Yost, M., Markwald, R., Mei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Bioprinting+for+Vascularized+Tissue+Fabrication.">3D Bioprinting for Vascularized Tissue Fabrication.</a> Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 132-147 (2017).</li><li>Levenberg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+skeletal+muscle+tissue.">Engineering vascularized skeletal muscle tissue.</a> Nature Biotechnology. 23 (7), 879-884 (2005).</li><li>Rouwkema, J., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+and+Angiogenesis+in+Tissue+Engineering:+Beyond+Creating+Static+Networks.">Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks.</a> Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+casting+of+patterned+vascular+networks+for+perfusable+engineered+three-dimensional+tissues.">Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues.</a> Nature Materials. 11, (2012).</li><li>Gariboldi, M. I., Butler, R., Best, S. M., Cameron, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vasculature+Architectural+effects+on+microcapillary-like+structure+self-assembly.">Engineering vasculature Architectural effects on microcapillary-like structure self-assembly.</a> PLOS ONE. 14 (1), 1-13 (2019).</li><li>Blache, U., Guerrero, J., G&#252;ven, S., Klar, A. S., Scherberich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+Networks+and+Models,+In+vitro+Formation.">Microvascular Networks and Models, In vitro Formation.</a> Vascularization for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. , 1-40 (2018).</li><li>Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Models+of+Vascular+Functions.">Microfluidic Models of Vascular Functions.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 14 (1), 205-230 (2012).</li><li>Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+actively+stiffen+fibrin+networks+by+generating+contractile+stress.">Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress.</a> Biophysical Journal. 105 (10), 2240-2251 (2013).</li><li>Pollet, A. M. A. O., den Toonder, J. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+the+vasculature+using+Organ-on-Chip+technology.">Recapitulating the vasculature using Organ-on-Chip technology.</a> Bioengineering. 7 (1), (2020).</li><li>Hasan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+techniques+for+development+of+3D+vascularized+tissue.">Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue.</a> Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).</li><li>Jordahl, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Jet+Writing:+Functional+Microtissues+Based+on+Tessellated+Scaffold+Architectures.">3D Jet Writing: Functional Microtissues Based on Tessellated Scaffold Architectures.</a> Advanced Materials. 30 (14), 1707196 (2018).</li><li>Gauvin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+complex+porous+tissue+engineering+scaffolds+using+3D+projection+stereolithography.">Microfabrication of complex porous tissue engineering scaffolds using 3D projection stereolithography.</a> Biomaterials. 33 (15), 3824-3834 (2012).</li><li>Coscoy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtopographies+control+the+development+of+basal+protrusions+in+epithelial+sheets.">Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets.</a> Biointerphases. 13 (4), 041003 (2018).</li><li>Kaplan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+prototyping+fabrication+of+soft+and+oriented+polyester+scaffolds+for+axonal+guidance.">Rapid prototyping fabrication of soft and oriented polyester scaffolds for axonal guidance.</a> Biomaterials. , (2020).</li><li>Steier, A., Mu&#241;iz, A., Neale, D., Lahann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Trends+in+Information-Driven+Engineering+of+Complex+Biological+Systems.">Emerging Trends in Information-Driven Engineering of Complex Biological Systems.</a> Advanced Materials. 31 (26), 11806898 (2019).</li><li>Szklanny, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Scaffold+System+for+Studying+the+Effect+of+Local+Geometry+and+Topology+on+the+Development+and+Orientation+of+Sprouting+Blood+Vessels.">High-Throughput Scaffold System for Studying the Effect of Local Geometry and Topology on the Development and Orientation of Sprouting Blood Vessels.</a> Advanced Functional Materials. , 1901335 (2019).</li><li>Welti, J., Loges, S., Dimmeler, S., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+molecular+discoveries+in+angiogenesis+and+antiangiogenic+therapies+in+cancer.">Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3190-3200 (2013).</li><li>Gui, L., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Tissue+Engineering:+Building+Perfusable+Vasculature+for+Implantation.">Vascular Tissue Engineering: Building Perfusable Vasculature for Implantation.</a> Current Opinion in Chemical Engineering. 3, 68-74 (2014).</li><li>Blache, U., Ehrbar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inspired+by+nature:+Hydrogels+as+versatile+tools+for+vascular+engineering.">Inspired by nature: Hydrogels as versatile tools for vascular engineering.</a> Advances in Wound Care. 7 (7), 232-246 (2018).</li><li>Cochrane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+in+vitro+models+of+vascular+biology:+Human+induced+pluripotent+stem+cells+and+organ-on-chip+technology.">Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).</li><li>Nemani, K. V., Moodie, K. L., Brennick, J. B., Su, A., Gimi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+evaluation+of+SU-8+biocompatibility.">In vitro and in vivo evaluation of SU-8 biocompatibility.</a> Materials Science &amp; Engineering. C, Materials for Biological Applications. 33 (7), 4453-4459 (2013).</li><li>Mathew, R., Ravi Sankar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+on+Surface+Stress-Based+Miniaturized+Piezoresistive+SU-8+Polymeric+Cantilever+Sensors.">A Review on Surface Stress-Based Miniaturized Piezoresistive SU-8 Polymeric Cantilever Sensors.</a> Nano-Micro Letters. 10 (2), 1-41 (2018).</li><li>Knowlton, S., Yenilmez, B., Anand, S., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocrosslinking-based+bioprinting:+Examining+crosslinking+schemes.">Photocrosslinking-based bioprinting: Examining crosslinking schemes.</a> Bioprinting. 5, 10-18 (2017).</li><li>Redd, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+human+microvascular+grafts+enable+rapid+vascularization+and+increase+perfusion+in+infarcted+rat+hearts.">Patterned human microvascular grafts enable rapid vascularization and increase perfusion in infarcted rat hearts.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).</li><li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SU-8+Photoresist.">SU-8 Photoresist.</a> Encyclopedia of Nanotechnology. , 2530-2543 (2012).</li><li>Zheng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-a-Chip+Systems:+Microengineering+to+Biomimic+Living+Systems.">Organ-on-a-Chip Systems: Microengineering to Biomimic Living Systems.</a> Small. 12 (17), 2253-2282 (2016).</li><li>Freiman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+endothelial+and+mesenchymal+stem+cells+enhance+vascular+network+formation+on+three-dimensional+constructs+in+vitro.">Adipose-derived endothelial and mesenchymal stem cells enhance vascular network formation on three-dimensional constructs in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 7 (1), 5 (2016).</li><li>van Duinen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfused+3D+angiogenic+sprouting+in+a+high-throughput+in+vitro+platform.">Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform.</a> Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).</li><li>Nguyen, D. -. H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+model+to+reconstitute+angiogenic+sprouting+morphogenesis+in+vitro.">Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (17), 6712-6717 (2013).</li><li>Nashimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+perfusable+vascular+networks+with+a+three-dimensional+tissue+in+a+microfluidic+device.">Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device.</a> Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).</li><li>Rosenfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+3D+vascular+networks+is+regulated+by+tensile+forces.">Morphogenesis of 3D vascular networks is regulated by tensile forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3215-3220 (2016).</li><li>Neto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+TAZ+regulate+adherens+junction+dynamics+and+endothelial+cell+distribution+during+vascular+development.">and TAZ regulate adherens junction dynamics and endothelial cell distribution during vascular development.</a> bioRxiv. , 174185 (2017).</li></ol>

Behovet for en rig vaskulatur i indlejret i manipuleret væv er afgørende for konstruere overlevelse og korrekt funktion1. Selvom teknik det vaskulære system har været i fokus for en enorm mængde forskning, er der meget tilbage at undersøge og forstå24. Især ved genskabelse af et bestemt væv skal mikrovasculaturen opføre sig og organisere i overensstemmelse hermed12. Den mest almindelige tilgang til generation af mikrovessels er co-seeding e...

Vævsteknikken udvikler sig hurtigt i retning af fremstilling af konstruerede konstruktioner til erstatning for manglende eller beskadigede organer og væv1. Der er dog endnu ikke opnået fuldt funktionelle konstruktioner, da det fortsat er en enestående udfordring at generere operationelle vaskulære netværk til vævsernæring. Uden korrekt vaskularisering er manipuleret væv begrænset til en passiv diffusionstransport af ilt og næringsstoffer, der begrænser den maksimale levedygtige vævstykkelse til diffusionsgrænsen, ca. 200 μm2. Sådanne tykkelser er ikke egnede til at reparere store vævsdefekter eller til fuld organfremstilling, hvilket gør tilstedeværelsen af funktionelt vaskulært netværk til en obligatorisk egenskab for funktionelle og implantable væv3.
Det vaskulære system består af en bred vifte af blodkar, med forskellige størrelser, fænotyper og organisation, tæt relateret til værtsvævet. Forståelse af adfærd, reaktion og migration beslutninger truffet af udviklingslandene og spirende fartøjer kan instruere deres integration i manipuleret væv4. I øjeblikket er den mest almindelige tilgang til oprettelse af in vitro vaskulære netværk at kombinere endotelceller (ECs) med støtteceller (SCs, med evnen til at differentiere sig til vægmalericeller), seedet i et tredimensionelt mikromiljø. Dette miljø giver kemiske og fysiske signaler, så cellerne kan fastgøres, formere sig og samle sig i fartøjsnetværk2,5,6,7,8. Når SCs er medkulturerede, udskiller de ekstracellulære matrixproteiner (ECM), samtidig med at de yder mekanisk støtte til EC'erne, som danner de rørformede strukturer. Desuden fremmer en krydsinteraktion mellem begge celletyper tubulogenese, karspiring og migration ud over SCs modning og differentiering i α glatte muskelaktilkende (αSMA) vægmalericeller4. Udvikling af fartøjsnetværk studeres oftest i 3D-miljøer, der er skabt ved hjælp af hydrogeler, porøse polymere stilladser eller en kombination heraf. Sidstnævnte mulighed giver ligeledes et cellevenligt miljø og den nødvendige mekaniske støtte til både cellerne og ECM9.
Der er udført en stor mængde arbejde for at undersøge vaskulær udvikling, herunder fælles dyrkning af cellerne på hydrogels10, hydrogels-stilladskombinationer11,12, 2D-platforme og mikrofluidiske anordninger13. Hydrogels kan dog let deformeres af de celleudførte kræfter14, mens 2D- og mikrofluidics-systemer ikke genskaber et tættere på naturen-miljø for at opnå en mere ekstrapolatablerespons 15,16. At forstå, hvordan dannende fartøjer reagerer på deres omgivende miljø, kan give kritisk indsigt, der kan give mulighed for fremstilling af konstruerede miljøer med evnen til at styre skibets udvikling på en forudsigelig måde. Forståelse vaskulære dannelse fænomener er især afgørende for at holde trit med den hurtige fremkomsten af submicron-til-mikron skala fabrikation teknikker, såsom stereolitografi, digital projektion litografi, kontinuerlig flydende interface produktion, 3D smelte-elektro jetwriting, løsning baseret 3D elektro jet skriftligt, og nye bioprint teknikker17,18,19,20,21. Tilpasning af kontrollen af disse mikrofabrikationsteknikker med en uddybet forståelse af vaskulær biologi er nøglen til skabelsen af en passende manipuleret vaskulatur til et målvæv.
Her præsenterer vi et 3D-system til at studere reaktionen fra nye dannende og spirende fartøjer på den omgivende stilladsgeometri, observere deres spire oprindelse og efterfølgende migration22. Ved at bruge 3D stilladser med tessellated rum geometrier, og en to-trins såning teknik, lykkedes det os at skabe højt organiserede vaskulære netværk i en klar og nem at analysere mode. De tessellerede geometrier giver et højgennemstrømningssystem med individuelle enheder, der indeholder fartøjer, der reagerer på deres lokale miljø. Ved hjælp af flerfarvede ECs sporede vi spiredannelsesoprindelse og efterfølgende migrationsmønstre, korreleret med rumgeometrien og SCs-placeringen22.
Selvom den foreslåede protokol er blevet forberedt til at analysere virkningerne af geometriske signaler på vaskulæriseringsadfærd, kan denne tilgang udvides og anvendes på en række nye applikationer. Det tessellerede stillads og de let billedlige netværk giver mulighed for en enkel analyse af forskellige ECs og SCs interaktion, tilføjelse af specifikke organceller og deres interaktion med de vaskulære netværk, lægemiddeleffekt på vaskulære netværk og meget mere. Vores foreslåede systemresultater er meget alsidige og af enkel fabrikation og forarbejdning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Angiotool freeware</td>
			<td>NIH-CCR</td>
			<td></td>
			<td>Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine albumin serum Probumin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>82-045-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental pulp stem cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM media + bullet kit</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>#1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>Gadot-Group</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evicel fibrin sealant</td>
			<td>Johnson&#38;Johnson</td>
			<td>EVB05IL</td>
			<td>Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Cy3 antibody</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>115-166-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488</td>
			<td>Thermo- Fisher Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human adipose microvascular cells</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>#7200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0895-5MG</td>
			<td>Stock concentration: 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Gadot-Group</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lift-off reagent</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td>
			<td>G112850</td>
			<td>Commercial name Omnicoat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-glucose DMEM</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-050-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SMA antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in PBS</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>SC-281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-032-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-vWF antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Silicon Valley Microelectronics (SVM)</td>
			<td></td>
			<td>Wafers 4&#34;, Type N-1-10, 500-550 microns thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050 photoresist</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td>
			<td>Y11058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryton-X 100</td>
			<td>BioLab LTD</td>
			<td>57836</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stepwise cell seeding on tessellated scaffolds to study sprouting blood vessels

Det kardiovaskulære system er en central aktør i menneskets fysiologi, der giver næring til de fleste væv i kroppen; forskellige størrelser, strukturer, fænotyper og ydeevne afhængigt af hvert enkelt perfunderet væv. Området for vævsteknik, som har til formål at reparere eller erstatte beskadigede eller manglende kropsvæv, er afhængig af kontrolleret angiogenese for at skabe en ordentlig vaskularisering inden for de manipulerede væv. Uden et vaskulært system kan tykke konstruerede konstruktioner ikke næres tilstrækkeligt, hvilket kan resultere i celledød, dårlig engraftment og i sidste ende fiasko. Således, forståelse og kontrol af adfærd manipuleret blodkar er en enestående udfordring på området. Dette arbejde præsenterer et højoverførselssystem, der giver mulighed for oprettelse af organiserede og repeterbare fartøjsnetværk til at studere fartøjsadfærd i et 3D-stilladsmiljø. Denne totrins såningsprotokol viser, at fartøjer i systemet reagerer på stilladstopografien og udviser karakteristisk spiringsadfærd afhængigt af rumgeometrien, hvor fartøjerne bor. De opnåede resultater og forståelse fra dette højoverførselssystem kan anvendes til at informere bedre 3D bioprintede stilladskonstruktionsdesign, hvor fremstilling af forskellige 3D-geometrier ikke hurtigt kan vurderes, når der anvendes 3D-udskrivning som grundlag for cellulære biologiske miljøer. Desuden kan forståelsen fra dette høje gennemløbssystem anvendes til forbedring af hurtig lægemiddelscreening, den hurtige udvikling af samkulturmodeller og undersøgelse af mekaniske stimuli på blodkardannelse for at uddybe kendskabet til det vaskulære system.

Den præsenterede protokol, ved hjælp af stereolitografi teknikker, giver mulighed for fremstilling af tessellated stilladser lavet af SU-8 fotoresist. Stilladser med tydelige rumgeometrier (firkanter, sekskanter og cirkler) og meget nøjagtige og repeterbare egenskaber blev opnået (Figur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61995/61995fig01.jpg"> ...

Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels at JoVE.com

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

Manipuleret væv er stærkt afhængige af ordentlige vaskulære netværk til at levere vitale næringsstoffer og gasser og fjerne metabolisk affald. I dette arbejde skaber en trinvis såningsprotokol af endotelceller og støtteceller højt organiserede vaskulære netværk i en højoverførselshastighedsplatform til undersøgelse af udvikling af fartøjsadfærd i et kontrolleret 3D-miljø.

Trinvis celle såning på Tessellated stilladser til undersøgelse spirende blodkar

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...

Vores protokol giver forskere mulighed for at studere skibets netværksdannelsesproces på en klar og let sporbar måde, åbne dørene for nye undersøgelser og kaste lys over blodkaradfærd. Denne teknik giver mulighed for at skabe velorganiserede og repeterbare vaskulære netværk med reagere på det omgivende miljø. Endotelceller fra patienter, der lider af en vaskulær sygdom, kan hentes ved hjælp af dette system, hvilket gør det muligt at genskabe den vaskulære sygdom og finde en passende behandling.Den foreslåede metode kan udvides til at studere vaskulær netværksadfærd, når den er parret med forskellige celletyper, hvilket gør det muligt at observere samspillet mellem at udvikle fartøjer med en bestemt vævstype. Begynd med at nedsænke stilladserne i 70% ethanol i mindst 15 minutter, og vask dem derefter to gange i PBS. Bland 1,5 mikroliter fibronectin lageropløsning med 28,5 mikroliter PBS per stillads, der skal sås.Forbered en fibronectin fortynding, der skal anvendes til alle stilladser for at undgå pipettering fejl. Sæt stilladserne sparsomt oven på en hydrofobisk overflade og dæk hvert stillads med 30 mikroliter af fibronectinfortyndingen. Udskift pladens låg og læg de fibronectindækkede stilladser i en inkubator, der er indstillet til 37 grader Celsius og 100% fugtighed i mindst en time.Efter inkubation skylles stilladserne i PBS let for at fjerne fibronectinrester. Stilladserne kan opbevares i PBS ved fire grader Celsius i op til en uge. Forbered endotelcelle eller EF-medium ved at blande basalmediet med de tilsvarende medium kit-komponenter, herunder en antibiotisk opløsning, FBS og endotelcellevæksttilskud som angivet af producenten.Gør den menneskelige fedt mikrovaskulære endotelcelle suspension i EF-medium med en koncentration på fire millioner celler pr milliliter. Brug pincet, placere en fibronectin-belagt stillads per brønd i en ikke-TC 24-brønd plade. Dæk hvert stillads med 25 mikroliterdråber af celleaffjedringen, og sørg for ikke at lade suspensionen flyde væk fra stilladset.Læg låget på pladen og læg det i en inkubator ved 37 grader Celsius, 5% kuldioxid og 100% fugtighed i 60 til 90 minutter. Efter inkubationen fyldes hver brønd med 700 mikroliter EF-medium. Inkubat de endoteliserede stilladser, indtil EF-sammenløbet kan observeres ved hjælp af fluorescerende mikroskopi eller i tre dage.Skift mediet hver anden dag. Forbered DPSC medium ved at blande 500 milliliter lav glukose DMEM, 57,5 milliliter FBS, 5,75 milliliter ikke-essentielle aminosyrer, 5,75 milliliter GlutaMAX og 5,75 milliliter penicillin-streptomycin-nystatin opløsning. Overfør de endoteliserede stilladser til en ny ikke-TC 24-brønds plade.Kassér alle medier fra den aktuelle plade ved hjælp af en pipette eller vakuumsugning, og pas på ikke at påføre vakuum direkte på stilladset. Placer et stillads i midten af hver brønd, og tør derefter det omkringliggende område med let vakuum. Der fortyndes thrombin- og fibrinogenbestandsopløsninger med PBS til en endelig koncentration på henholdsvis fem enheder pr. milliliter og 15 mg/milliliter.Forbered en otte millioner DPSC per milliliter suspension i thrombin fortynding og distribuere 12,5 mikroliter af suspensionen i de enkelte mikrorør per stillads, der skal seedede. Sæt en fem til 50 mikroliter pipette til 12,5 mikroliter og fyld den med fibrinogenopløsning. Uden at fjerne spidsen skal du indstille pipetten til 25 mikroliter.Materialet i spidsen skal stige og efterlade et tomt volumen. Tryk langsomt på stemplet, indtil væsken når spidsens åbning, men siver ikke ud. Hold stemplet i denne position, og sæt spidsen i et af de mikrocentrifugerør, der indeholder cellerne i thrombinaffjedring, og sørg for, at spidsen er i kontakt med væsken.Slip forsigtigt stemplets knap, og træk celleaffjedringen ind i spidsen. Bland begge materialer grundigt, så bobledannelsen undgås. Pak hurtigt de blandede materialer oven på et endoteliseret stillads.Gentag de foregående trin for hvert stillads, og sørg for at ændre spidser mellem anvendelser for at undgå uventet fibrin geldannelse i spidsen. Udskift pladelåget og inkubter stilladserne ved 37 grader Celsius, 5%kuldioxid og 100% fugtighed i 30 minutter. Efter inkubation fyldes hver brønd med en milliliter en-til-en DPSC og EF-medium.Kultur i en uge, ændre mediet hver anden dag. På forskellige tidspunkter i kulturen skal du fjerne mediet fra brønden og billedet konstruererne ved hjælp af et konfokalt mikroskop for at studere den vaskulære udvikling eller enhver anden parameter af interesse. Denne protokol giver mulighed for fremstilling af tessellated stilladser lavet af SU-8 fotoresist.Stilladser med forskellige rumgeometrier og meget nøjagtige og repeterbare funktioner blev opnået. Med traditionel samtidig såning af både endotelceller og støtteceller blev cellerne homogent fordelt over stilladset, hvilket resulterede i uforudsigelige og uorganiserede vaskulære netværk. Modsat, trinvis celle såning resulterede i velorganiserede vaskulære netværk.Når du bruger fluorescerende endotelceller, kan fartøjerne afbildes i realtid. Rødt fluorescerende protein, der udtrykker endotelceller, blev dyrket på sekskantede stilladser og afbildet. Støttecellerne blev tilføjet på dag ét, og de vaskulære netværk blev afbildet hver anden dag for at kvantificere fartøjsudvikling.For hvert tidspunkt blev der taget brede billeder af hele stilladset. Fartøjsvæksten blev kvantificeret som fartøjets samlede længde og areal. Der blev udført en konfokal billeddannelsestid for at tillade sporing af enkelte fartøjer ved hjælp af flerfarvede endotelceller.Fartøjsstien blev genereret fra tidsforskydningen, hvilket gjorde det muligt at observere fartøjets migration. Karmodning blev observeret ved tilstedeværelsen af glatte muskelhandlinger og støtteceller. For de cirkulære, sekskantede og firkantede rum formere cellerne sig og organisere sig i strukturer.På dag syv viste alle former et rigt og komplekst vaskulært netværk. Højere forstørrelse billeder afslørede en tættere glat muskel actin og støtte celle tilstedeværelse co-lokaliseret med dannede fartøjer, evidencing støtte celle rekruttering og differentiering omkring vaskulære strukturer. Denne teknik kan bruges til at studere adfærden af tredimensionelle vaskulære netværk, når de udsættes for forskellige forhold, såsom specifikke cellehæmmere eller i nærværelse af yderligere celletyper.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Udarbejdelse af 3D Fibrin stilladser til Stem celledyrkningsapplikationer

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Selvrapportering Stilladser for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Forbedret metode til forberedelse af en menneskelig celle-baseret, Contact Model af blod-hjerne barrieren

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Tandhjulsgear Organization of Blood koagulationsfaktor VIII på Lipid Nanorør

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

Koncentrisk Gel System til Undersøgelse den biofysiske rolle Matrix mikromiljø på 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds &#8212; Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

Imaging Cell levedygtighed på uigennemsigtige Stilladser - Brug af Eksempel på en roman Strikkede Titanium Implant

Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Smelte Electrospinning skrivning af tre-dimensionelle Poly(ε-caprolactone) stilladser med kontrollerbare morfologier for Tissue Engineering applikationer

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Standardiseret og skalerbar analyse til undersøgelse af Perfuserende 3D Angiogen spiring af iPSC-afledte endotelceller in vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

Mærkning af blodkar i Teleost hjernen og hypofysen ved hjælp af kardiel perfusion med en DiI-fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...