Name: stepwise cell seeding on tessellated scaffolds to study sprouting blood vessels
Uploaded: 2021-01-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door financiering van de University of Michigan - Israel Partnership for Research. De auteurs willen Uri Merdler, Lior Debbi en Galia Ben David bedanken voor hun grote hulp en steun, Nadine Wang, Ph.D. en Pilar Herrera-Fierro, Ph.D. van de Lurie Nanofabrication Facility aan de Universiteit van Michigan, evenals Luis Solorio, Ph.D. voor verhelderende discussies over fotolithografietechnieken.

1. Tessellated steigerfabricage
OPMERKING: Fotolithografie is een wijdverspreide techniek die gespecialiseerde apparatuur vereist die meestal is ondergebracht in een nanofabrication-faciliteit / laboratorium. De methode in dit protocol werd zoveel mogelijk gealdaliseerd voor het publiek; afhankelijk van de apparatuur waarover de lezer beschikt, kunnen echter kleine wijzigingen in de procedures nodig zijn. We raden aan om deze procedures uit te voeren in een schone ruimte in een nanofabrication-f...

<ol>
	<li>Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+is+the+key+challenge+in+tissue+engineering.">Vascularization is the key challenge in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4), 300-311 (2011).</li><li>Landau, S., Guo, S., Levenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Engineered+Vasculature+within+3D+Tissue+Constructs.">Localization of Engineered Vasculature within 3D Tissue Constructs.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 2 (2018).</li><li>Griffith, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+Limits+of+an+in+Vitro+Thick+Prevascularized+Tissue.">Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue.</a> Tissue Engineering. 11 (12), (2005).</li><li>Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+and+therapeutic+aspects+of+angiogenesis.">Basic and therapeutic aspects of angiogenesis.</a> Cell. 146 (6), 873-887 (2011).</li><li>Landau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropoelastin+coated+PLLA-PLGA+scaffolds+promote+vascular+network+formation.">Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation.</a> Biomaterials. 122, 72-82 (2017).</li><li>Lesman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vessel-like+networks+within+multicellular+fibrin-based+constructs.">Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs.</a> Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).</li><li>Richards, D., Jia, J., Yost, M., Markwald, R., Mei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Bioprinting+for+Vascularized+Tissue+Fabrication.">3D Bioprinting for Vascularized Tissue Fabrication.</a> Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 132-147 (2017).</li><li>Levenberg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+skeletal+muscle+tissue.">Engineering vascularized skeletal muscle tissue.</a> Nature Biotechnology. 23 (7), 879-884 (2005).</li><li>Rouwkema, J., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+and+Angiogenesis+in+Tissue+Engineering:+Beyond+Creating+Static+Networks.">Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks.</a> Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+casting+of+patterned+vascular+networks+for+perfusable+engineered+three-dimensional+tissues.">Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues.</a> Nature Materials. 11, (2012).</li><li>Gariboldi, M. I., Butler, R., Best, S. M., Cameron, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vasculature+Architectural+effects+on+microcapillary-like+structure+self-assembly.">Engineering vasculature Architectural effects on microcapillary-like structure self-assembly.</a> PLOS ONE. 14 (1), 1-13 (2019).</li><li>Blache, U., Guerrero, J., G&#252;ven, S., Klar, A. S., Scherberich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+Networks+and+Models,+In+vitro+Formation.">Microvascular Networks and Models, In vitro Formation.</a> Vascularization for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. , 1-40 (2018).</li><li>Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Models+of+Vascular+Functions.">Microfluidic Models of Vascular Functions.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 14 (1), 205-230 (2012).</li><li>Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+actively+stiffen+fibrin+networks+by+generating+contractile+stress.">Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress.</a> Biophysical Journal. 105 (10), 2240-2251 (2013).</li><li>Pollet, A. M. A. O., den Toonder, J. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+the+vasculature+using+Organ-on-Chip+technology.">Recapitulating the vasculature using Organ-on-Chip technology.</a> Bioengineering. 7 (1), (2020).</li><li>Hasan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+techniques+for+development+of+3D+vascularized+tissue.">Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue.</a> Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).</li><li>Jordahl, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Jet+Writing:+Functional+Microtissues+Based+on+Tessellated+Scaffold+Architectures.">3D Jet Writing: Functional Microtissues Based on Tessellated Scaffold Architectures.</a> Advanced Materials. 30 (14), 1707196 (2018).</li><li>Gauvin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+complex+porous+tissue+engineering+scaffolds+using+3D+projection+stereolithography.">Microfabrication of complex porous tissue engineering scaffolds using 3D projection stereolithography.</a> Biomaterials. 33 (15), 3824-3834 (2012).</li><li>Coscoy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtopographies+control+the+development+of+basal+protrusions+in+epithelial+sheets.">Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets.</a> Biointerphases. 13 (4), 041003 (2018).</li><li>Kaplan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+prototyping+fabrication+of+soft+and+oriented+polyester+scaffolds+for+axonal+guidance.">Rapid prototyping fabrication of soft and oriented polyester scaffolds for axonal guidance.</a> Biomaterials. , (2020).</li><li>Steier, A., Mu&#241;iz, A., Neale, D., Lahann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Trends+in+Information-Driven+Engineering+of+Complex+Biological+Systems.">Emerging Trends in Information-Driven Engineering of Complex Biological Systems.</a> Advanced Materials. 31 (26), 11806898 (2019).</li><li>Szklanny, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Scaffold+System+for+Studying+the+Effect+of+Local+Geometry+and+Topology+on+the+Development+and+Orientation+of+Sprouting+Blood+Vessels.">High-Throughput Scaffold System for Studying the Effect of Local Geometry and Topology on the Development and Orientation of Sprouting Blood Vessels.</a> Advanced Functional Materials. , 1901335 (2019).</li><li>Welti, J., Loges, S., Dimmeler, S., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+molecular+discoveries+in+angiogenesis+and+antiangiogenic+therapies+in+cancer.">Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3190-3200 (2013).</li><li>Gui, L., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Tissue+Engineering:+Building+Perfusable+Vasculature+for+Implantation.">Vascular Tissue Engineering: Building Perfusable Vasculature for Implantation.</a> Current Opinion in Chemical Engineering. 3, 68-74 (2014).</li><li>Blache, U., Ehrbar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inspired+by+nature:+Hydrogels+as+versatile+tools+for+vascular+engineering.">Inspired by nature: Hydrogels as versatile tools for vascular engineering.</a> Advances in Wound Care. 7 (7), 232-246 (2018).</li><li>Cochrane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+in+vitro+models+of+vascular+biology:+Human+induced+pluripotent+stem+cells+and+organ-on-chip+technology.">Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).</li><li>Nemani, K. V., Moodie, K. L., Brennick, J. B., Su, A., Gimi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+evaluation+of+SU-8+biocompatibility.">In vitro and in vivo evaluation of SU-8 biocompatibility.</a> Materials Science &amp; Engineering. C, Materials for Biological Applications. 33 (7), 4453-4459 (2013).</li><li>Mathew, R., Ravi Sankar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+on+Surface+Stress-Based+Miniaturized+Piezoresistive+SU-8+Polymeric+Cantilever+Sensors.">A Review on Surface Stress-Based Miniaturized Piezoresistive SU-8 Polymeric Cantilever Sensors.</a> Nano-Micro Letters. 10 (2), 1-41 (2018).</li><li>Knowlton, S., Yenilmez, B., Anand, S., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocrosslinking-based+bioprinting:+Examining+crosslinking+schemes.">Photocrosslinking-based bioprinting: Examining crosslinking schemes.</a> Bioprinting. 5, 10-18 (2017).</li><li>Redd, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+human+microvascular+grafts+enable+rapid+vascularization+and+increase+perfusion+in+infarcted+rat+hearts.">Patterned human microvascular grafts enable rapid vascularization and increase perfusion in infarcted rat hearts.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).</li><li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SU-8+Photoresist.">SU-8 Photoresist.</a> Encyclopedia of Nanotechnology. , 2530-2543 (2012).</li><li>Zheng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-a-Chip+Systems:+Microengineering+to+Biomimic+Living+Systems.">Organ-on-a-Chip Systems: Microengineering to Biomimic Living Systems.</a> Small. 12 (17), 2253-2282 (2016).</li><li>Freiman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+endothelial+and+mesenchymal+stem+cells+enhance+vascular+network+formation+on+three-dimensional+constructs+in+vitro.">Adipose-derived endothelial and mesenchymal stem cells enhance vascular network formation on three-dimensional constructs in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 7 (1), 5 (2016).</li><li>van Duinen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfused+3D+angiogenic+sprouting+in+a+high-throughput+in+vitro+platform.">Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform.</a> Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).</li><li>Nguyen, D. -. H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+model+to+reconstitute+angiogenic+sprouting+morphogenesis+in+vitro.">Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (17), 6712-6717 (2013).</li><li>Nashimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+perfusable+vascular+networks+with+a+three-dimensional+tissue+in+a+microfluidic+device.">Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device.</a> Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).</li><li>Rosenfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+3D+vascular+networks+is+regulated+by+tensile+forces.">Morphogenesis of 3D vascular networks is regulated by tensile forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3215-3220 (2016).</li><li>Neto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+TAZ+regulate+adherens+junction+dynamics+and+endothelial+cell+distribution+during+vascular+development.">and TAZ regulate adherens junction dynamics and endothelial cell distribution during vascular development.</a> bioRxiv. , 174185 (2017).</li></ol>

De behoefte aan een rijke vasculatuur in ingebed in gemanipuleerde weefsels is van cruciaal belang voor de overleving van de constructie en de juiste functie1. Hoewel engineering van het vasculaire systeem de focus is geweest van een enorme hoeveelheid onderzoek, is er nog veel over om te onderzoeken en te begrijpen24. In het bijzonder moet de microvasculatuur zich bij het recreëren van een specifiek weefsel gedragen en dienovereenkomstig organiseren12</s...

Het gebied van weefseltechniek vordert snel in de richting van de fabricage van constructies om ontbrekende of beschadigde organen en weefsels te vervangen1. Volledig functionele constructies moeten echter nog worden bereikt, deels omdat het genereren van operationele vasculaire netwerken voor weefselvoeding een uitstekende uitdaging blijft. Zonder de juiste vascularisatie zijn gemanipuleerde weefsels beperkt tot een passief diffusietransport van zuurstof en voedingsstoffen, waardoor de maximale levensvatbare weefseldikte wordt beperkt tot de diffusielimiet, ongeveer 200 μm2. Dergelijke diktes zijn niet geschikt om grote weefseldefecten te herstellen of voor volledige orgaanfabricage, waardoor de aanwezigheid van functioneel vasculair netwerk een verplicht kenmerk is voor functionele en implanteerbare weefsels3.
Het vasculaire systeem bestaat uit een grote verscheidenheid aan bloedvaten, met verschillende groottes, fenotypes en organisatie, nauw verwant aan het gastheerweefsel. Inzicht in het gedrag, de respons en de migratiebeslissingen van de ontwikkelende en ontkiemende vaten kan hun integratie in gemanipuleerde weefsels instrueren4. Momenteel is de meest voorkomende aanpak voor het creëren van in vitro vasculaire netwerken het combineren van endotheelcellen (EC's) met ondersteunende cellen (SCs, met de mogelijkheid om te differentiëren in muurschilderingscellen), gezaaid in een driedimensionale micro-omgeving. Deze omgeving biedt chemische en fysische aanwijzingen om de cellen in staat te stellen zich te hechten, te verspreiden en zelf te assembleren in scheepsnetwerken2,5,6,7,8. Wanneer ze worden gekweekt, scheiden SCs extracellulaire matrix (ECM) eiwitten af en bieden ze mechanische ondersteuning aan de EC's, die de buisvormige structuren vormen. Bovendien bevordert een kruisinteractie tussen beide celtypen tubulogenese, het ontkiemen van vaten en migratie, naast de rijping en differentiatie van de SCs in α-gladde spier actine-expresserende (αSMA) mural cellen4. De ontwikkeling van scheepsnetwerk wordt meestal bestudeerd in 3D-omgevingen die zijn gemaakt met behulp van hydrogels, poreuze polymere steigers of een combinatie daarvan. De laatste optie biedt ook een celvriendelijke omgeving en de vereiste mechanische ondersteuning voor zowel de cellen als de ECM9.
Er is veel werk verricht om de vasculaire ontwikkeling te bestuderen, waaronder het co-cultiveren van de cellen op hydrogels10, hydrogels-steigercombinaties11,12, 2D-platforms en microfluïdische apparaten13. Hydrogels kunnen echter gemakkelijk worden vervormd door de door cellen uitgeoefende krachten14, terwijl 2D - en microfluïdische systemen er niet in slagen een dichter bij de natuur gebrachte omgeving te creëren om een meer extrapoleerbare respons te verkrijgen15,16. Inzicht in hoe vormende vaten reageren op hun omgeving kan kritisch inzicht geven dat het mogelijk maakt om ontworpen omgevingen te fabriceren met het vermogen om de ontwikkeling van het schip op een voorspelbare manier te begeleiden. Het begrijpen van vasculaire vormingsverschijnselen is vooral van cruciaal belang om gelijke tred te houden met de snelle opkomst van submicron-tot-micron schaal fabricagetechnieken, zoals stereolithografie, digitale projectielithografie, continue vloeibare interfaceproductie, 3D smelt-elektro jetwriting, oplossingsgebaseerd 3D-elektrojetschrift en opkomende bioprinttechnieken17,18,19,20,21. Het afstemmen van de controle van deze microproductietechnieken met een verdiept begrip van vasculaire biologie is de sleutel tot het creëren van een geschikte ontworpen vasculatuur voor een doelweefsel.
Hier presenteren we een 3D-systeem om de reactie van nieuwe vormende en ontspruitende vaten op de omringende steigergeometrie te bestuderen, waarbij ze hun kiemoorsprong en daaropvolgende migratie observeren22. Door gebruik te maken van 3D-steigers met gemeleerde compartimentgeometrieën en een tweestaps zaaitechniek, slaagden we erin om op een duidelijke en eenvoudig te analyseren manier zeer georganiseerde vasculaire netwerken te creëren. De tessellated geometrieën bieden een systeem met hoge doorvoer met afzonderlijke eenheden met vaten die reageren op hun lokale omgeving. Met behulp van veelkleurige EC's volgden we de oorsprong van de kiemvorming en de daaropvolgende migratiepatronen, gecorreleerd met de compartimentgeometrie en de SCs-locatie22.
Hoewel het voorgestelde protocol is voorbereid om de effecten van geometrische signalen op vascularisatiegedrag te analyseren, kan deze aanpak worden uitgebreid en toegepast op een verscheidenheid aan nieuwe toepassingen. De tessellated scaffold en de gemakkelijk te beeldbare netwerken maken een eenvoudige analyse van verschillende EC's en SCs-interactie mogelijk, de toevoeging van specifieke orgaancellen en hun interactie met de vasculaire netwerken, medicijneffect op vasculaire netwerken en meer. Ons voorgestelde systeem resulteert zeer veelzijdig en van eenvoudige fabricage en verwerking.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Angiotool freeware</td>
			<td>NIH-CCR</td>
			<td></td>
			<td>Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine albumin serum Probumin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>82-045-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental pulp stem cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM media + bullet kit</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>#1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>Gadot-Group</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evicel fibrin sealant</td>
			<td>Johnson&#38;Johnson</td>
			<td>EVB05IL</td>
			<td>Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Cy3 antibody</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>115-166-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488</td>
			<td>Thermo- Fisher Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human adipose microvascular cells</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>#7200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0895-5MG</td>
			<td>Stock concentration: 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Gadot-Group</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lift-off reagent</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td>
			<td>G112850</td>
			<td>Commercial name Omnicoat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-glucose DMEM</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-050-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SMA antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in PBS</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>SC-281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-032-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-vWF antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Silicon Valley Microelectronics (SVM)</td>
			<td></td>
			<td>Wafers 4&#34;, Type N-1-10, 500-550 microns thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050 photoresist</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td>
			<td>Y11058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryton-X 100</td>
			<td>BioLab LTD</td>
			<td>57836</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stepwise cell seeding on tessellated scaffolds to study sprouting blood vessels

Het cardiovasculaire systeem is een belangrijke speler in de menselijke fysiologie en biedt voeding aan de meeste weefsels in het lichaam; vaten zijn aanwezig in verschillende maten, structuren, fenotypes en prestaties, afhankelijk van elk specifiek doordrenkt weefsel. Het gebied van weefseltechniek, dat tot doel heeft beschadigde of ontbrekende lichaamsweefsels te herstellen of te vervangen, vertrouwt op gecontroleerde angiogenese om een goede vascularisatie binnen de gemanipuleerde weefsels te creëren. Zonder een vasculair systeem kunnen dik ontworpen constructies niet voldoende worden gevoed, wat kan leiden tot celdood, slechte engraftment en uiteindelijk falen. Het begrijpen en beheersen van het gedrag van gemanipuleerde bloedvaten is dus een uitstekende uitdaging in het veld. Dit werk presenteert een systeem met hoge doorvoer dat het mogelijk maakt om georganiseerde en herhaalbare scheepsnetwerken te creëren voor het bestuderen van scheepsgedrag in een 3D-steigeromgeving. Dit tweestaps zaaiprotocol laat zien dat vaten binnen het systeem reageren op de steigertopografie en onderscheidend kiemgedrag vertonen, afhankelijk van de geometrie van het compartiment waarin de vaten zich bevinden. De verkregen resultaten en het begrip van dit hoge doorvoersysteem kunnen worden toegepast om betere 3D-bioprinted steigerconstructieontwerpen te informeren, waarbij de fabricage van verschillende 3D-geometrieën niet snel kan worden beoordeeld bij het gebruik van 3D-printen als basis voor cellulaire biologische omgevingen. Bovendien kan het begrip van dit systeem met hoge doorvoer worden gebruikt voor de verbetering van snelle geneesmiddelenscreening, de snelle ontwikkeling van coculturenmodellen en het onderzoek van mechanische stimuli op de vorming van bloedvaten om de kennis van het vasculaire systeem te verdiepen.

Het gepresenteerde protocol, met behulp van stereolithografietechnieken, maakt het mogelijk om mozaïeksteigers van SU-8 fotoresist te fabriceren. Steigers met verschillende compartimentgeometrieën (vierkanten, zeshoeken en cirkels) en zeer nauwkeurige en herhaalbare kenmerken werden verkregen (figuur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61995/61995fig01.jpg"> <strong c...

Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels at JoVE.com

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

Gemanipuleerde weefsels zijn sterk afhankelijk van de juiste vasculaire netwerken om vitale voedingsstoffen en gassen te leveren en metabolisch afval te verwijderen. In dit werk creëert een stapsgewijs zaaiprotocol van endotheelcellen en ondersteunende cellen sterk georganiseerde vasculaire netwerken in een platform met hoge doorvoer voor het bestuderen van het ontwikkelen van vesselgedrag in een gecontroleerde 3D-omgeving.

Stapsgewijs cel zaaien opssellated steigers om ontkiemende bloedvaten te bestuderen

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...

Ons protocol stelt onderzoekers in staat om het vormingsproces van het vatennetwerk op een duidelijke en gemakkelijk traceerbare manier te bestuderen, de deuren te openen voor nieuwe studies en licht te werpen op het gedrag van bloedvaten. Deze techniek biedt de mogelijkheid om zeer georganiseerde en herhaalbare vasculaire netwerken te creëren die reageren op de omgeving. Endotheelcellen van patiënten die lijden aan een vasculaire ziekte kunnen worden teruggewonnen in het gebruik van dit systeem, waardoor het mogelijk is om de vasculaire ziekte opnieuw te creëren en een geschikte behandeling te vinden.De voorgestelde methode kan worden uitgebreid voor het bestuderen van vasculair netwerkgedrag in combinatie met verschillende celtypen, waardoor de interactie van ontwikkelende vaten met een specifiek weefseltype kan worden waargenomen. Begin met het onderdompelen van de steigers in 70% ethanol gedurende minimaal 15 minuten en was ze vervolgens twee keer in PBS. Meng 1,5 microliter fibronectine stamoplossing met 28,5 microliter PBS per te zaaien steiger.Bereid één fibronectineverdunning voor die voor alle steigers moet worden gebruikt om pipetfouten te voorkomen. Plaats de steigers schaars op een hydrofoob oppervlak en bedek elke steiger met 30 microliters van de fibronectineverdunning. Vervang het deksel van de plaat en plaats de met fibronectine bedekte steigers minimaal een uur in een incubatorset op 37 graden Celsius en 100% vochtigheid.Spoel na incubatie de steigers lichtjes af in PBS om fibronectineresten te verwijderen. De steigers kunnen maximaal een week in PBS op vier graden Celsius worden gehouden. Bereid endotheelcel of EC-medium voor door het basale medium te mengen met de bijbehorende mediumkitcomponenten, waaronder een antibioticumoplossing, FBS en endotheelcelgroeisupplementen zoals aangegeven door de fabrikant.Maak de menselijke vet microvasculaire endotheelcelsuspensie in EC-medium met een concentratie van vier miljoen cellen per milliliter. Plaats met behulp van een tang één met fibronectine beklede steiger per put in een niet-TC 24-put plaat. Bedek elke steiger met 25 microliterdruppels van de celophanging en zorg ervoor dat de ophanging niet van de steiger wegstroomt.Doe het deksel op de plaat en plaats het in een incubator op 37 graden Celsius, 5% kooldioxide en 100% vochtigheid gedurende 60 tot 90 minuten. Vul na de incubatie elke put met 700 microliter EC-medium. Incubeer de endotheelsteigers totdat EG-samenvloeiing kan worden waargenomen met behulp van fluorescerende microscopie of gedurende drie dagen.Verander het medium om de andere dag. Bereid DPSC medium door 500 milliliter dmem met lage glucose, 57,5 milliliter FBS, 5,75 milliliter niet-essentiële aminozuren, 5,75 milliliter GlutaMAX en 5,75 milliliter penicilline-streptomycine-nystatineoplossing te mengen. Breng de endotheelsteigers over in een nieuwe niet-TC 24-put plaat.Gooi alle media van de huidige plaat met behulp van een pipet of vacuümzuiging en zorg ervoor dat u het vacuüm niet rechtstreeks op de steiger aanbrengt. Plaats een steiger in het midden van elke put en droog de omgeving vervolgens met lichtvacuüm. Verdun trombine- en fibrinogeenvoorraadoplossingen met PBS tot een eindconcentratie van respectievelijk vijf eenheden per milliliter en 15 milligram per milliliter.Bereid een suspensie van acht miljoen DPSC per milliliter voor in de trombineverdunning en verdeel 12,5 microliter van de suspensie in afzonderlijke microtubes per te zaaien steiger. Zet een pipet van vijf tot 50 microliter op 12,5 microliter en vul deze met fibrinogeenoplossing. Zonder de punt te verwijderen, zet u de pipet op 25 microliter.Het materiaal in de punt moet stijgen en een leeg volume achterlaten. Druk langzaam op de zuigerknop totdat de vloeistof de tipopening bereikt, maar niet uitlekt. Houd de zuiger in deze positie en plaats de tip in een van de microcentrifugebuizen met de cellen in trombinesuspensie en zorg ervoor dat de tip in contact komt met de vloeistof.Laat de zuigerknop voorzichtig los en trek de celsuspensie in de punt. Meng beide materialen grondig en vermijd bubbelvorming. Verdeel de gemengde materialen snel over een endotheelsteiger.Herhaal de vorige stappen voor elke steiger en zorg ervoor dat u tussen het gebruik door van uiteinde wisselt om onverwachte vorming van fibrinegel in de punt te voorkomen. Vervang het deksel van de plaat en incubeer de steigers gedurende 30 minuten op 37 graden Celsius, 5% kooldioxide en 100% vochtigheid. Vul na incubatie elke put met één milliliter een-op-een DPSC en EC-medium.Cultuur voor een week, het veranderen van het medium om de andere dag. Verwijder op verschillende tijdstippen tijdens de kweek het medium uit de put en beeld de constructies in met behulp van een confocale microscoop om de vasculaire ontwikkeling of een andere parameter van belang te bestuderen. Dit protocol maakt het mogelijk om tessellated steigers gemaakt van SU-8 fotoresist te fabriceren.Steigers met verschillende compartimentgeometrieën en zeer nauwkeurige en herhaalbare functies werden verkregen. Met traditionele gelijktijdige seeding van zowel endotheelcellen als ondersteunende cellen, werden de cellen homogeen verdeeld over de steiger, wat resulteerde in onvoorspelbare en ongeorganiseerde vasculaire netwerken. Integendeel, stapsgewijs cel zaaien resulteerde in zeer georganiseerde vasculaire netwerken.Bij gebruik van fluorescerende endotheelcellen kunnen de vaten in realtime worden afgebeeld. Rode fluorescerende eiwit uitdrukken endotheelcellen werden gekweekt op zeshoekige steigers en afgebeeld. De ondersteunende cellen werden op dag één toegevoegd en de vasculaire netwerken werden om de dag afgebeeld om de ontwikkeling van de bloedvaten te kwantificeren.Voor elk keerpunt werden brede beelden van de hele steiger gemaakt. De groei van het vaartuig werd gekwantificeerd als totale lengte en oppervlakte van het vaartuig. Een confocale imaging time-lapse werd uitgevoerd om tracking van één vat mogelijk te maken met behulp van veelkleurige endotheelcellen.Het scheepspad is gegenereerd uit de time-lapse, waardoor het mogelijk is om de migratie van schepen te observeren. De rijping van de bloedvaten werd waargenomen door de aanwezigheid van gladde spieractine en ondersteunende cellen. Voor de cirkelvormige, zeshoekige en kwadraatcompartimenten vermenigvuldigen en organiseren de cellen zich in structuren.Op dag zeven vertoonden alle vormen een rijk en complex vasculair netwerk. Hogere vergroting beelden onthulden een dichtere gladde spier actine en ondersteuning cel aanwezigheid co-gelokaliseerd met gevormde vaten, evidencing ondersteuning cel rekrutering en differentiatie rond vasculaire structuren. Deze techniek kan worden gebruikt om het gedrag van driedimensionale vasculaire netwerken te bestuderen wanneer ze worden blootgesteld aan verschillende omstandigheden, zoals specifieke celremmers of in aanwezigheid van extra celtypen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Ontwerp van een Cyclic Pressure Bioreactor voor de Ex Vivo Studie van Aorta hartkleppen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Voorbereiding van de 3D-fibrine steigers voor Stem Cell Cultuur Toepassingen

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Zelfrapportage Stellingen voor 3-dimensionale Cultuur van de Cel

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Verbeterde werkwijze voor de bereiding van een Human-Cell gebaseerde, Contact Model van de bloed-hersenbarrière

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Spiraalvormige Organisatie van Blood stollingsfactor VIII op Lipid nanobuisjes

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

Concentrische Gel Systeem om de biofysische rol van matrix Microenvironment op 3D-Cell Migratie Bestudeer

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds &#8212; Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

Imaging levensvatbaarheid van de cellen op niet-transparante Steigers - Met behulp van het voorbeeld van een Novel Gebreide Titanium Implant

Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Electrospinning schrijven van driedimensionale Poly(ε-caprolactone) steigers met controleerbare Morphologies voor Tissue Engineering toepassingen smelten

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Gestandaardiseerde en schaalbare assay voor het bestuderen van Perfused 3D-angiogene kiemen van door iPSC afgeleide endotheliale cellen in vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

Etikettering van bloedvaten in de Teleost hersenen en de hypofyse met behulp van cardiale transfusie met een DiI-fixatief

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...