Name: stepwise cell seeding on tessellated scaffolds to study sprouting blood vessels
Uploaded: 2021-01-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels at JoVE.com

Diese Forschung wurde durch Mittel der University of Michigan - Israel Partnership for Research unterstützt. Die Autoren danken Uri Merdler, Lior Debbi und Galia Ben David für ihre große Unterstützung und Unterstützung, Nadine Wang, Ph.D. und Pilar Herrera-Fierro, Ph.D. der Lurie Nanofabrication Facility an der University of Michigan, sowie Luis Solorio, Ph.D. für aufschlussreiche Diskussionen über Photolithographietechniken.

1. Tessellierte Gerüstherstellung
HINWEIS: Die Photolithographie ist eine weit verbreitete Technik, die spezielle Geräte erfordert, die typischerweise in einer Nanofabrikationseinrichtung / einem Labor untergebracht sind. Die in diesem Protokoll dargelegte Methode wurde für das Publikum so weit wie möglich verallgemeinert; Je nach der dem Lesegerät zur Verfügung stehenden Ausrüstung können jedoch geringfügige Änderungen der Verfahren erforderlich sein. Wir empfehlen, diese Verfahren in...

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	<li>Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+is+the+key+challenge+in+tissue+engineering.">Vascularization is the key challenge in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4), 300-311 (2011).</li><li>Landau, S., Guo, S., Levenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Engineered+Vasculature+within+3D+Tissue+Constructs.">Localization of Engineered Vasculature within 3D Tissue Constructs.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 2 (2018).</li><li>Griffith, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+Limits+of+an+in+Vitro+Thick+Prevascularized+Tissue.">Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue.</a> Tissue Engineering. 11 (12), (2005).</li><li>Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+and+therapeutic+aspects+of+angiogenesis.">Basic and therapeutic aspects of angiogenesis.</a> Cell. 146 (6), 873-887 (2011).</li><li>Landau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropoelastin+coated+PLLA-PLGA+scaffolds+promote+vascular+network+formation.">Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation.</a> Biomaterials. 122, 72-82 (2017).</li><li>Lesman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vessel-like+networks+within+multicellular+fibrin-based+constructs.">Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs.</a> Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).</li><li>Richards, D., Jia, J., Yost, M., Markwald, R., Mei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Bioprinting+for+Vascularized+Tissue+Fabrication.">3D Bioprinting for Vascularized Tissue Fabrication.</a> Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 132-147 (2017).</li><li>Levenberg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+skeletal+muscle+tissue.">Engineering vascularized skeletal muscle tissue.</a> Nature Biotechnology. 23 (7), 879-884 (2005).</li><li>Rouwkema, J., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+and+Angiogenesis+in+Tissue+Engineering:+Beyond+Creating+Static+Networks.">Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks.</a> Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).</li><li>Miller, J. 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Die Notwendigkeit eines reichen Gefäßes, das in künstliche Gewebe eingebettet ist, ist entscheidend für das Überleben des Konstrukts und die ordnungsgemäße Funktion1. Obwohl die Entwicklung des Gefäßsystems im Mittelpunkt einer großen Menge an Forschung stand, bleibt noch viel zu untersuchen und zu verstehen24. Insbesondere bei der Nachbildung eines bestimmten Gewebes sollte sich die Mikrovaskulatur entsprechend verhalten und organisieren12...

Das Gebiet des Tissue Engineering schreitet schnell voran in Richtung der Herstellung von technischen Konstrukten, um fehlende oder beschädigte Organe und Gewebe zu ersetzen1. Voll funktionsfähige Konstrukte müssen jedoch teilweise noch erreicht werden, da die Erzeugung operativer vaskulärer Netzwerke für die Gewebeernährung eine herausragende Herausforderung bleibt. Ohne richtige Vaskularisierung sind künstliche Gewebe auf einen passiven Diffusionstransport von Sauerstoff und Nährstoffen beschränkt, wodurch die maximale lebensfähige Gewebedicke auf die Diffusionsgrenze von etwa 200 μm2beschränkt wird. Solche Dicken sind nicht geeignet, um große Gewebedefekte zu reparieren oder für die vollständige Organherstellung, was das Vorhandensein eines funktionellen Gefäßnetzwerks zu einem obligatorischen Merkmal für funktionelle und implantierbare Gewebe macht3.
Das Gefäßsystem besteht aus einer Vielzahl von Blutgefäßen mit unterschiedlichen Größen, Phänotypen und Organisationen, die eng mit dem Wirtsgewebe verbunden sind. Das Verständnis des Verhaltens, der Reaktion und der Migrationsentscheidungen, die von den sich entwickelnden und sprießenden Gefäßen getroffen werden, kann ihre Integration in künstliche Gewebe anweisen4. Derzeit ist der gebräuchlichste Ansatz zur Schaffung von In-vitro-Gefäßnetzwerken die Kombination von Endothelzellen (ECs) mit Unterstützungszellen (SCs, mit der Fähigkeit, sich zu Wandzellen zu differenzieren), die in einer dreidimensionalen Mikroumgebung ausgesät sind. Diese Umgebung liefert chemische und physikalische Hinweise, damit sich die Zellen an Gefäßnetzwerke anheften, vermehren und selbst zu Gefäßnetzwerken zusammensetzenkönnen 2,5,6,7,8. Wenn sie co-kultiviert werden, sezernieren SCs extrazelluläre Matrixproteine (ECM) und bieten gleichzeitig mechanische Unterstützung für die ECs, die die röhrenförmigen Strukturen bilden. Darüber hinaus fördert eine Kreuzinteraktion zwischen beiden Zelltypen tubulogenese, Gefäßkeimung und Migration, zusätzlich zur SCs Reifung und Differenzierung in α-glatte Muskel-Aktin-exprimierende (αSMA) Wandzellen4. Die Entwicklung von Gefäßnetzwerken wird am häufigsten in 3D-Umgebungen untersucht, die mit Hydrogelen, porösen polymeren Gerüsten oder einer Kombination davon erstellt wurden. Letztere Option bietet gleichermaßen eine zellfreundliche Umgebung und die erforderliche mechanische Unterstützung sowohl für die Zellen als auch für das ECM9.
Es wurde eine große Menge an Arbeiten durchgeführt, um die vaskuläre Entwicklung zu untersuchen, einschließlich der Co-Kultivierung der Zellen auf Hydrogelen10,Hydrogelen-Gerüst-Kombinationen11,12, 2D-Plattformen und mikrofluidischen Geräten13. Hydrogele können jedoch leicht durch die von der Zelle ausgeübten Kräfte14deformiert werden, während 2D- und Mikrofluidiksysteme es nicht schaffen, eine naturnähere Umgebung nachzubilden, um eine extrapolierbarere Antwort zu erhalten15,16. Zu verstehen, wie umformende Gefäße auf ihre Umgebung reagieren, kann wichtige Einblicke liefern, die die Herstellung von technischen Umgebungen mit der Fähigkeit ermöglichen, die Schiffsentwicklung auf vorhersehbare Weise zu leiten. Das Verständnis von Gefäßbildungsphänomenen ist besonders wichtig, um mit dem schnellen Aufkommen von Fertigungstechniken im Submikron-zu-Mikron-Maßstab Schritt zu halten, wie Stereolithographie, digitale Projektionslithographie, kontinuierliche Flüssigschnittstellenproduktion, 3D-Schmelzelektro-Jetwriting, lösungsbasiertes 3D-Elektrojet-Schreiben und aufkommende Bioprinting-Techniken17,18,19,20,21. Die Kontrolle dieser Mikroherstellungstechniken mit einem vertieften Verständnis der vaskulären Biologie in Einklang zu bringen, ist der Schlüssel zur Schaffung eines geeigneten künstlichen Gefäßsystems für ein Zielgewebe.
Hier stellen wir ein 3D-System vor, um die Reaktion neuer sich bildender und keimender Gefäße auf die umgebende Gerüstgeometrie zu untersuchen und deren Keimursprung und anschließende Migration zu beobachten22. Durch die Verwendung von 3D-Gerüsten mit tessellierten Kompartimentgeometrien und einer zweistufigen Seeding-Technik ist es uns gelungen, hochorganisierte vaskuläre Netzwerke auf klare und einfach zu analysierende Weise zu erstellen. Die tessellierten Geometrien bieten ein System mit hohem Durchsatz mit einzelnen Einheiten, die Behälter enthalten, die auf ihre lokale Umgebung reagieren. Mit mehrfarbigen ECs verfolgten wir die Ursprünge der Sprossenbildung und nachfolgende Migrationsmuster, korreliert mit der Kompartimentgeometrie und der SCs-Position22.
Obwohl das vorgeschlagene Protokoll vorbereitet wurde, um die Auswirkungen geometrischer Hinweise auf das Vaskularisierungsverhalten zu analysieren, kann dieser Ansatz erweitert und auf eine Vielzahl neuer Anwendungen angewendet werden. Das tessellierte Gerüst und die leicht abbildbaren Netzwerke ermöglichen die einfache Analyse verschiedener ECs- und SCs-Interaktionen, die Addition spezifischer Organzellen und deren Interaktion mit den vaskulären Netzwerken, die Arzneimittelwirkung auf vaskuläre Netzwerke und vieles mehr. Unser vorgeschlagenes System ist sehr vielseitig und einfach herzustellen und zu verarbeiten.

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		<tr>
			<td>Angiotool freeware</td>
			<td>NIH-CCR</td>
			<td></td>
			<td>Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine albumin serum Probumin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>82-045-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental pulp stem cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM media + bullet kit</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>#1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>Gadot-Group</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evicel fibrin sealant</td>
			<td>Johnson&#38;Johnson</td>
			<td>EVB05IL</td>
			<td>Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Cy3 antibody</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>115-166-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488</td>
			<td>Thermo- Fisher Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human adipose microvascular cells</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>#7200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0895-5MG</td>
			<td>Stock concentration: 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Gadot-Group</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lift-off reagent</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td>
			<td>G112850</td>
			<td>Commercial name Omnicoat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-glucose DMEM</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-050-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SMA antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in PBS</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>SC-281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-032-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-vWF antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Silicon Valley Microelectronics (SVM)</td>
			<td></td>
			<td>Wafers 4&#34;, Type N-1-10, 500-550 microns thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050 photoresist</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td>
			<td>Y11058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryton-X 100</td>
			<td>BioLab LTD</td>
			<td>57836</td>
		</tr>
	</tbody>
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stepwise cell seeding on tessellated scaffolds to study sprouting blood vessels

Das Herz-Kreislauf-System ist ein Wichtiger Akteur in der menschlichen Physiologie und versorgt die meisten Gewebe im Körper mit Nahrung. Gefäße sind in verschiedenen Größen, Strukturen, Phänotypen und Leistung vorhanden, abhängig von jedem spezifischen durchbluteten Gewebe. Das Gebiet des Tissue Engineering, das darauf abzielt, beschädigtes oder fehlendes Körpergewebe zu reparieren oder zu ersetzen, stützt sich auf eine kontrollierte Angiogenese, um eine ordnungsgemäße Vaskularisierung innerhalb der künstlichen Gewebe zu schaffen. Ohne ein Gefäßsystem können dicke konstruierte Konstrukte nicht ausreichend genährt werden, was zu Zelltod, schlechter Transplantation und letztendlich zum Versagen führen kann. Daher ist das Verständnis und die Kontrolle des Verhaltens von künstlichen Blutgefäßen eine herausragende Herausforderung auf diesem Gebiet. Diese Arbeit stellt ein Hochdurchsatzsystem vor, das die Erstellung organisierter und wiederholbarer Schiffsnetzwerke zur Untersuchung des Schiffsverhaltens in einer 3D-Gerüstumgebung ermöglicht. Dieses zweistufige Seeding-Protokoll zeigt, dass Gefäße innerhalb des Systems auf die Gerüsttopographie reagieren und je nach Kompartimentgeometrie, in der sich die Gefäße befinden, ein ausgeprägtes Keimverhalten aufweisen. Die erhaltenen Ergebnisse und das Verständnis dieses Hochdurchsatzsystems können angewendet werden, um bessere 3D-biogedruckte Gerüstkonstruktionsentwürfe zu erstellen, wobei die Herstellung verschiedener 3D-Geometrien nicht schnell bewertet werden kann, wenn der 3D-Druck als Grundlage für zellularisierte biologische Umgebungen verwendet wird. Darüber hinaus kann das Verständnis dieses Hochdurchsatzsystems für die Verbesserung des schnellen Wirkstoffscreenings, die schnelle Entwicklung von Co-Cultures-Modellen und die Untersuchung mechanischer Reize auf die Blutgefäßbildung genutzt werden, um das Wissen über das Gefäßsystem zu vertiefen.

Das vorgestellte Protokoll, das Stereolithographie-Techniken verwendet, ermöglicht die Herstellung von tessellierten Gerüsten aus SU-8 Fotolack. Gerüste mit unterschiedlichen Kompartimentgeometrien (Quadrate, Sechsecke und Kreise) und hochgenauen und wiederholbaren Merkmalen wurden erhalten (Abbildung 1).
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Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

Künstliche Gewebe sind stark auf geeignete vaskuläre Netzwerke angewiesen, um lebenswichtige Nährstoffe und Gase bereitzustellen und Stoffwechselabfälle zu entfernen. In dieser Arbeit erstellt ein schrittweises Seeding-Protokoll von Endothelzellen und Stützzellen hochorganisierte vaskuläre Netzwerke in einer Hochdurchsatzplattform, um das Entwicklung des Gefäßverhaltens in einer kontrollierten 3D-Umgebung zu untersuchen.

Schrittweise Zellaussaat auf tessellierten Gerüsten zur Untersuchung keimender Blutgefäße

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...

Unser Protokoll ermöglicht es Forschern, den Prozess der Bildung des Gefäßnetzwerks auf klare und leicht nachvollzugbare Weise zu untersuchen, die Türen für neue Studien zu öffnen und das Verhalten der Blutgefäße zu beleuchten. Diese Technik bietet die Möglichkeit, hochorganisierte und wiederholbare vaskuläre Netzwerke zu erzeugen, die auf die Umgebung reagieren. Endothelzellen von Patienten, die an einer Gefäßerkrankung leiden, können mit diesem System entnommen werden, wodurch es möglich ist, die Gefäßerkrankung nachzubilden und eine geeignete Behandlung zu finden.Die vorgeschlagene Methode kann erweitert werden, um das Verhalten von vaskulären Netzwerken zu untersuchen, wenn sie mit verschiedenen Zelltypen gepaart wird, so dass die Interaktion von sich entwickelnden Gefäßen mit einem bestimmten Gewebetyp beobachtet werden kann. Beginnen Sie, indem Sie die Gerüste für mindestens 15 Minuten in 70% Ethanol tauchen und dann zweimal in PBS waschen. Mischen Sie 1,5 Mikroliter Fibronektin-Stammlösung mit 28,5 Mikrolitern PBS pro zu säendem Gerüst.Bereiten Sie eine Fibronektinverdünnung vor, die für alle Gerüste verwendet wird, um Pipettierfehler zu vermeiden. Stellen Sie die Gerüste spärlich auf eine hydrophobe Oberfläche und bedecken Sie jedes Gerüst mit 30 Mikrolitern der Fibronektinverdünnung. Ersetzen Sie den Deckel der Platte und legen Sie die mit Fibronektin bedeckten Gerüste für mindestens eine Stunde in einen Inkubator, der auf 37 Grad Celsius und 100% Luftfeuchtigkeit eingestellt ist.Nach der Inkubation die Gerüste in PBS leicht ausspülen, um Fibronektinreste zu entfernen. Die Gerüste können bis zu einer Woche in PBS bei vier Grad Celsius gehalten werden. Bereiten Sie Endothelzellen oder EC-Medium vor, indem Sie das Basalmedium mit den entsprechenden Medium-Kit-Komponenten mischen, einschließlich einer Antibiotikalösung, FBS und Endothelzellwachstumspräparaten, wie vom Hersteller angegeben.Machen Sie die humane fette mikrovaskuläre Endothelzellsuspension in EC-Medium mit einer Konzentration von vier Millionen Zellen pro Milliliter. Legen Sie mit einer Zette ein fibronektinbeschichtetes Gerüst pro Vertiefung in eine Nicht-TC 24-Well-Platte. Decken Sie jedes Gerüst mit 25 Mikrolitertröpfchen der Zellsuspension ab und achten Sie darauf, dass die Suspension nicht vom Gerüst abfließt.Legen Sie den Deckel auf die Platte und legen Sie ihn für 60 bis 90 Minuten in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 100% Luftfeuchtigkeit. Nach der Inkubation jede Vertiefung mit 700 Mikrolitern EC-Medium füllen. Inkubieren Sie die endothelialisierten Gerüste, bis der EC-Zusammenfluss mit Fluoreszenzmikroskopie oder für drei Tage beobachtet werden kann.Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag. Bereiten Sie DPSC-Medium vor, indem Sie 500 Milliliter DMEM mit niedrigem Glukosegehalt, 57,5 Milliliter FBS, 5,75 Milliliter nicht essentielle Aminosäuren, 5,75 Milliliter GlutaMAX und 5,75 Milliliter Penicillin-Streptomycin-Nystatin-Lösung mischen. Übertragen Sie die endothelialisierten Gerüste in eine neue Nicht-TC 24-Well-Platte.Entsorgen Sie alle Medien von der aktuellen Platte mit einer Pipette oder Vakuumabsaugung und achten Sie darauf, kein Vakuum direkt auf das Gerüst anzuwenden. Stellen Sie ein Gerüst in die Mitte jedes Brunnens und trocknen Sie dann die Umgebung mit leichtem Vakuum. Thrombin- und Fibrinogen-Stammlösungen mit PBS auf eine Endkonzentration von fünf Einheiten pro Milliliter bzw. 15 Milligramm pro Milliliter verdünnen.Bereiten Sie eine acht Millionen DPSC pro Milliliter Suspension in der Thrombinverdünnung vor und verteilen Sie 12,5 Mikroliter der Suspension in einzelne Mikroröhrchen pro Gerüst, um ausgesät zu werden. Stellen Sie eine Pipette mit fünf bis 50 Mikrolitern auf 12,5 Mikroliter und füllen Sie sie mit Fibrinogenlösung. Ohne die Spitze zu entfernen, stellen Sie die Pipette auf 25 Mikroliter ein.Das Material in der Spitze sollte aufsteigen und ein leeres Volumen hinterlassen. Drücken Sie langsam den Kolbenknopf, bis die Flüssigkeit die Spitzenöffnung erreicht, aber nicht austritt. Halten Sie den Kolben in dieser Position und stecken Sie die Spitze in eine der Mikrozentrifugenröhrchen, die die Zellen in Thrombinsuspension enthalten, um sicherzustellen, dass die Spitze mit der Flüssigkeit in Kontakt kommt.Lösen Sie vorsichtig den Kolbenknopf und ziehen Sie die Zellaufhängung in die Spitze. Mischen Sie beide Materialien gründlich und vermeiden Sie Blasenbildung. Dosieren Sie die gemischten Materialien schnell auf einem endothelialisierten Gerüst.Wiederholen Sie die vorherigen Schritte für jedes Gerüst und stellen Sie sicher, dass Sie die Spitzen zwischen den Anwendungen wechseln, um unerwartete Fibringelbildung innerhalb der Spitze zu vermeiden. Ersetzen Sie den Plattendeckel und inkubieren Sie die Gerüste bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 100% Luftfeuchtigkeit für 30 Minuten. Füllen Sie nach der Inkubation jede Vertiefung mit einem Milliliter EINS-zu-Eins-DPSC- und EC-Medium.Kultur für eine Woche, wechselt das Medium jeden zweiten Tag. Entfernen Sie zu verschiedenen Zeitpunkten während der Kultur das Medium aus dem Brunnen und stellen Sie die Konstrukte mit einem konfokalen Mikroskop dar, um die vaskuläre Entwicklung oder einen anderen interessierenden Parameter zu untersuchen. Dieses Protokoll ermöglicht die Herstellung von tessellierten Gerüsten aus SU-8 Fotolack.Gerüste mit unterschiedlichen Kompartimentgeometrien und hochgenauen und wiederholbaren Merkmalen wurden erhalten. Bei der traditionellen gleichzeitigen Aussaat von Endothelzellen und Stützzellen wurden die Zellen homogen über das Gerüst verteilt, was zu unvorhersehbaren und unorganisierten vaskulären Netzwerken führte. Im Gegensatz dazu führte die schrittweise Zellaussaat zu hochorganisierten vaskulären Netzwerken.Bei Verwendung fluoreszierender Endothelzellen können die Gefäße in Echtzeit abgebildet werden. Rot fluoreszierende Protein-exprimierende Endothelzellen wurden auf hexagonalen Gerüsten kultiviert und abgebildet. Die Stützzellen wurden am ersten Tag hinzugefügt und die vaskulären Netzwerke wurden jeden zweiten Tag abgebildet, um die Gefäßentwicklung zu quantifizieren.Für jeden Zeitpunkt wurden breite Bilder des gesamten Gerüsts aufgenommen. Das Schiffswachstum wurde als Gesamtschiffslänge und -fläche quantifiziert. Ein konfokale Bildgebungszeitraffer wurde durchgeführt, um die Verfolgung einzelner Gefäße mit mehrfarbigen Endothelzellen zu ermöglichen.Der Schiffspfad wurde aus dem Zeitraffer generiert, so dass die Schiffsmigration beobachtet werden konnte. Die Gefäßreifung wurde durch das Vorhandensein von Aktin- und Stützzellen der glatten Muskulatur beobachtet. Für die kreisförmigen, sechseckigen und quadratischen Kompartimente vermehren sich die Zellen und organisieren sich zu Strukturen.Am siebten Tag zeigten alle Formen ein reiches und komplexes vaskuläres Netzwerk. Bilder mit höherer Vergrößerung zeigten ein dichteres Aktin der glatten Muskulatur und eine Unterstützungszellpräsenz, die mit gebildeten Gefäßen kollokalisiert ist, was die Rekrutierung und Differenzierung von Unterstützungszellen um vaskuläre Strukturen zeigt. Diese Technik kann verwendet werden, um das Verhalten dreidimensionaler vaskulärer Netzwerke zu untersuchen, wenn sie verschiedenen Bedingungen ausgesetzt sind, z. B. spezifischen Zellinhibitoren oder in Gegenwart zusätzlicher Zelltypen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Entwurf eines zyklischen Druck Bioreaktor für die Ex Vivo Studium der Aorten-Herzklappen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Forschung

Biotechnik

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Erstellung von 3D-Fibrin-Gerüste für Stem Cell Culture Anwendungen

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Selbstberichts Gerüste für 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Helical Organisation der Blutgerinnungsfaktor VIII auf Lipid-Nanotubes

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

Concentric Gel-System, um die biophysikalische Rolle der Matrix Mikromilieu auf 3D-Zellmigration Studieren

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds &#8212; Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

Imaging Zelllebensfähigkeit auf Undurchsichtige Scaffolds - am Beispiel eines neuartigen Strick-Titan-Implantat

Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Elektrospinnen Schreiben von dreidimensionalen Poly(ε-caprolactone) Gerüste mit steuerbaren Morphologien für Tissue Engineering Anwendungen zu schmelzen

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Standardisierter und skalierbarer Assay zur Untersuchung perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

Kennzeichnung von Blutgefäßen im Teleost Gehirn und Pituitary mit Herz-Perfusion mit einem DiI-Fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...