Name: stepwise cell seeding on tessellated scaffolds to study sprouting blood vessels
Uploaded: 2021-01-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels at JoVE.com

Questa ricerca è stata sostenuta dai finanziamenti dell'Università del Michigan - Israel Partnership for Research. Gli autori ringraziano Uri Merdler, Lior Debbi e Galia Ben David per la loro grande assistenza e supporto, Nadine Wang, Ph.D. e Pilar Herrera-Fierro, Ph.D. del Lurie Nanofabrication Facility presso l'Università del Michigan, nonché Luis Solorio, Ph.D. per aver illuminato le discussioni sulle tecniche di fotolitografia.

1. Fabbricazione di impalcature tassellate
NOTA: La fotolitografia è una tecnica diffusa che richiede apparecchiature specializzate tipicamente alloggiate all'interno di un impianto /laboratorio di nanofabbricazione. Il metodo previsto da questo protocollo è stato generalizzato il più possibile per il pubblico; tuttavia, possono essere necessarie lievi modifiche alle procedure a seconda delle attrezzature a disposizione del lettore. Si consiglia di eseguire queste procedure in una stanza puli...

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	<li>Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+is+the+key+challenge+in+tissue+engineering.">Vascularization is the key challenge in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4), 300-311 (2011).</li><li>Landau, S., Guo, S., Levenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Engineered+Vasculature+within+3D+Tissue+Constructs.">Localization of Engineered Vasculature within 3D Tissue Constructs.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 2 (2018).</li><li>Griffith, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+Limits+of+an+in+Vitro+Thick+Prevascularized+Tissue.">Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue.</a> Tissue Engineering. 11 (12), (2005).</li><li>Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+and+therapeutic+aspects+of+angiogenesis.">Basic and therapeutic aspects of angiogenesis.</a> Cell. 146 (6), 873-887 (2011).</li><li>Landau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropoelastin+coated+PLLA-PLGA+scaffolds+promote+vascular+network+formation.">Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation.</a> Biomaterials. 122, 72-82 (2017).</li><li>Lesman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vessel-like+networks+within+multicellular+fibrin-based+constructs.">Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs.</a> Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).</li><li>Richards, D., Jia, J., Yost, M., Markwald, R., Mei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Bioprinting+for+Vascularized+Tissue+Fabrication.">3D Bioprinting for Vascularized Tissue Fabrication.</a> Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 132-147 (2017).</li><li>Levenberg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+skeletal+muscle+tissue.">Engineering vascularized skeletal muscle tissue.</a> Nature Biotechnology. 23 (7), 879-884 (2005).</li><li>Rouwkema, J., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+and+Angiogenesis+in+Tissue+Engineering:+Beyond+Creating+Static+Networks.">Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks.</a> Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+casting+of+patterned+vascular+networks+for+perfusable+engineered+three-dimensional+tissues.">Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues.</a> Nature Materials. 11, (2012).</li><li>Gariboldi, M. I., Butler, R., Best, S. M., Cameron, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vasculature+Architectural+effects+on+microcapillary-like+structure+self-assembly.">Engineering vasculature Architectural effects on microcapillary-like structure self-assembly.</a> PLOS ONE. 14 (1), 1-13 (2019).</li><li>Blache, U., Guerrero, J., G&#252;ven, S., Klar, A. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+the+vasculature+using+Organ-on-Chip+technology.">Recapitulating the vasculature using Organ-on-Chip technology.</a> Bioengineering. 7 (1), (2020).</li><li>Hasan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+techniques+for+development+of+3D+vascularized+tissue.">Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue.</a> Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).</li><li>Jordahl, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Jet+Writing:+Functional+Microtissues+Based+on+Tessellated+Scaffold+Architectures.">3D Jet Writing: Functional Microtissues Based on Tessellated Scaffold Architectures.</a> Advanced Materials. 30 (14), 1707196 (2018).</li><li>Gauvin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+complex+porous+tissue+engineering+scaffolds+using+3D+projection+stereolithography.">Microfabrication of complex porous tissue engineering scaffolds using 3D projection stereolithography.</a> Biomaterials. 33 (15), 3824-3834 (2012).</li><li>Coscoy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtopographies+control+the+development+of+basal+protrusions+in+epithelial+sheets.">Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets.</a> Biointerphases. 13 (4), 041003 (2018).</li><li>Kaplan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+prototyping+fabrication+of+soft+and+oriented+polyester+scaffolds+for+axonal+guidance.">Rapid prototyping fabrication of soft and oriented polyester scaffolds for axonal guidance.</a> Biomaterials. , (2020).</li><li>Steier, A., Mu&#241;iz, A., Neale, D., Lahann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Trends+in+Information-Driven+Engineering+of+Complex+Biological+Systems.">Emerging Trends in Information-Driven Engineering of Complex Biological Systems.</a> Advanced Materials. 31 (26), 11806898 (2019).</li><li>Szklanny, A. 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C, Materials for Biological Applications. 33 (7), 4453-4459 (2013).</li><li>Mathew, R., Ravi Sankar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+on+Surface+Stress-Based+Miniaturized+Piezoresistive+SU-8+Polymeric+Cantilever+Sensors.">A Review on Surface Stress-Based Miniaturized Piezoresistive SU-8 Polymeric Cantilever Sensors.</a> Nano-Micro Letters. 10 (2), 1-41 (2018).</li><li>Knowlton, S., Yenilmez, B., Anand, S., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocrosslinking-based+bioprinting:+Examining+crosslinking+schemes.">Photocrosslinking-based bioprinting: Examining crosslinking schemes.</a> Bioprinting. 5, 10-18 (2017).</li><li>Redd, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+human+microvascular+grafts+enable+rapid+vascularization+and+increase+perfusion+in+infarcted+rat+hearts.">Patterned human microvascular grafts enable rapid vascularization and increase perfusion in infarcted rat hearts.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).</li><li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SU-8+Photoresist.">SU-8 Photoresist.</a> Encyclopedia of Nanotechnology. , 2530-2543 (2012).</li><li>Zheng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-a-Chip+Systems:+Microengineering+to+Biomimic+Living+Systems.">Organ-on-a-Chip Systems: Microengineering to Biomimic Living Systems.</a> Small. 12 (17), 2253-2282 (2016).</li><li>Freiman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+endothelial+and+mesenchymal+stem+cells+enhance+vascular+network+formation+on+three-dimensional+constructs+in+vitro.">Adipose-derived endothelial and mesenchymal stem cells enhance vascular network formation on three-dimensional constructs in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 7 (1), 5 (2016).</li><li>van Duinen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfused+3D+angiogenic+sprouting+in+a+high-throughput+in+vitro+platform.">Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform.</a> Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).</li><li>Nguyen, D. -. H. 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La necessità di una ricca vascucolatura all'interno incorporata nei tessuti ingegnerizzati è fondamentale per costruire la sopravvivenza e la corretta funzione1. Sebbene l'ingegneria del sistema vascolare sia stata al centro di una grande quantità di ricerche, molto è rimasto da indagare e capire24. In particolare, quando si ricrea un tessuto specifico, la microvascolarizzazione dovrebbe comportarsi e organizzarsi di conseguenza12. L'approccio pi...

Il campo dell'ingegneria tissutale sta rapidamente progredendo verso la fabbricazione di costrutti ingegnerizzati per sostituire organi e tessuti mancanti odanneggiati 1. Tuttavia, i costrutti pienamente funzionali devono ancora essere raggiunti, in parte, poiché generare reti vascolari operative per il nutrimento dei tessuti rimane una sfida eccezionale. Senza un'adeguata vascolarizzazione, i tessuti ingegnerizzati sono limitati a un trasporto passivo di diffusione di ossigeno e sostanze nutritive, vincolando lo spessore massimo vitale del tessuto al limite di diffusione, circa 200 μm2. Tali spessori non sono adatti a riparare grandi difetti tissutali o per la fabbricazione completa di organi, il che rende la presenza di rete vascolare funzionale una caratteristica obbligatoria per i tessuti funzionali e impiantabili3.
Il sistema vascolare è composto da un'ampia varietà di vasi sanguigni, con diverse dimensioni, fenotipi e organizzazione, strettamente correlati al tessuto ospite. Comprendere il comportamento, la risposta e le decisioni di migrazione prese dai vasi in via di sviluppo e germogliazione può istruire la loro integrazione nei tessutiingegnerizzati 4. Attualmente, l'approccio più comune per la creazione di reti vascolari in vitro è la combinazione di cellule endoteliali (EC) con cellule di supporto (SC, con la capacità di differenziarsi in cellule murali), sementi all'interno di un micro-ambiente tridimensionale. Questo ambiente fornisce segnali chimici e fisici per consentire alle cellule di attaccarsi, proliferare e auto-assemblarsi nelle retidi recipienti 2,5,6,7,8. Quando co-coltivati, i SCs secernono proteine della matrice extracellulare (ECM) fornendo al contempo supporto meccanico agli EC, che formano le strutture tubolari. Inoltre, un'interazione incrociata tra entrambi i tipi di cellule promuove la tubulogenesi, la germogliazione e la migrazione dei vasi, oltre alla maturazione e differenziazione delle SCs in cellule murali ad azione muscolare α lisce (αSMA)4. Lo sviluppo della rete di navi è più comunemente studiato in ambienti 3D creati utilizzando idrogel, impalcature polimeriche porose o una loro combinazione. Quest'ultima opzione fornisce allo stesso modo un ambiente adatto alle celle e il supporto meccanico richiesto sia per le celle che per l'ECM9.
È stato svolto un grande lavoro per studiare lo sviluppo vascolare, tra cui la co-ristrutturazione delle cellule su idrogel10,combinazioni idrogel-impalcature11,12,piattaforme 2D e dispositivi microfluidici13. Tuttavia, gli idrogel possono essere facilmente deformati dalle forze esercitate dalle cellule14, mentre i sistemi 2D e microfluidica non riescono a ricreare un ambiente più vicino alla natura per ottenere una risposta più estrapolabile15,16. Comprendere come i vasi di formatura reagiscono all'ambiente circostante può fornire informazioni critiche che potrebbero consentire la fabbricazione di ambienti ingegnerizzati con la capacità di guidare lo sviluppo della nave in modo prevedibile. Comprendere i fenomeni di formazione vascolare è particolarmente fondamentale per tenere il passo con la rapida comparsa di tecniche di fabbricazione su scala submicron-a-micron, come stereolitografia, litografia a proiezione digitale, produzione di interfaccia liquida continua, fusione-elettro jetwriting 3D, scrittura elettro getto 3D basata su soluzione e tecniche di biostampa emergenti17,18,19,20,21. Allineare il controllo di queste tecniche di microproduttore con una comprensione approfondita della biologia vascolare è fondamentale per la creazione di una vascolarizzazione ingegnerizzata appropriata per un tessuto bersaglio.
Qui presentiamo un sistema 3D per studiare la risposta dei nuovi vasi di formatura e germogliazione alla geometria circostante dell'impalcatura, osservandone l'origine del germoglio e la successivamigrazione 22. Utilizzando impalcature 3D con geometrie di compartimenti tassellati e una tecnica di semina in due fase, siamo riusciti a creare reti vascolari altamente organizzate in modo chiaro e facile da analizzare. Le geometrie tassellate forniscono un sistema ad alta produttività con singole unità contenenti vasi che rispondono al loro ambiente locale. Utilizzando ec multicolori, abbiamo monitorato le origini di formazione del germoglio e i successivi modelli di migrazione, correlati alla geometria del compartimento e alla posizione dei SCs22.
Sebbene il protocollo proposto sia stato preparato per analizzare gli effetti dei segnali geometrici sul comportamento di vascolarizzazione, questo approccio può essere ampliato e applicato a una varietà di nuove applicazioni. L'impalcatura tassellata e le reti facilmente identificabili consentono l'analisi diretta delle diverse interazioni di ECs e SCs, l'aggiunta di cellule d'organo specifiche e la loro interazione con le reti vascolari, l'effetto farmaco sulle reti vascolari e altro ancora. Il nostro sistema suggerito risulta molto versatile e di semplice fabbricazione e lavorazione.

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		<tr>
			<td>Angiotool freeware</td>
			<td>NIH-CCR</td>
			<td></td>
			<td>Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine albumin serum Probumin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>82-045-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental pulp stem cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM media + bullet kit</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>#1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>Gadot-Group</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evicel fibrin sealant</td>
			<td>Johnson&#38;Johnson</td>
			<td>EVB05IL</td>
			<td>Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Cy3 antibody</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>115-166-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488</td>
			<td>Thermo- Fisher Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human adipose microvascular cells</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>#7200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0895-5MG</td>
			<td>Stock concentration: 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Gadot-Group</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lift-off reagent</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td>
			<td>G112850</td>
			<td>Commercial name Omnicoat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-glucose DMEM</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-050-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SMA antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in PBS</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>SC-281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-032-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-vWF antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Silicon Valley Microelectronics (SVM)</td>
			<td></td>
			<td>Wafers 4&#34;, Type N-1-10, 500-550 microns thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050 photoresist</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td>
			<td>Y11058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryton-X 100</td>
			<td>BioLab LTD</td>
			<td>57836</td>
		</tr>
	</tbody>
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stepwise cell seeding on tessellated scaffolds to study sprouting blood vessels

Il sistema cardiovascolare è un attore chiave nella fisiologia umana, fornendo nutrimento alla maggior parte dei tessuti del corpo; i vasi sono presenti in diverse dimensioni, strutture, fenotipi e prestazioni a seconda di ogni tessuto perfuso specifico. Il campo dell'ingegneria tissutale, che mira a riparare o sostituire i tessuti corporei danneggiati o mancanti, si basa sull'angiogenesi controllata per creare una corretta vascolarizzazione all'interno dei tessuti ingegnerizzati. Senza un sistema vascolare, i costrutti ingegnerizzati spessi non possono essere sufficientemente nutriti, il che può causare morte cellulare, scarso innesto e, in ultima analisi, fallimento. Pertanto, comprendere e controllare il comportamento dei vasi sanguigni ingegnerizzati è una sfida eccezionale sul campo. Questo lavoro presenta un sistema ad alta produttività che consente la creazione di reti di navi organizzate e ripetibili per lo studio del comportamento della nave in un ambiente di impalcature 3D. Questo protocollo di semina in due fase mostra che i vasi all'interno del sistema reagiscono alla topografia dell'impalcatura, presentando comportamenti di germogliatura distintivi a seconda della geometria del compartimento in cui risiedono i vasi. I risultati ottenuti e la comprensione da questo sistema ad alta produttività possono essere applicati al fine di informare meglio i progetti di costrutti di impalcature biostampate 3D, in cui la fabbricazione di varie geometrie 3D non può essere rapidamente valutata quando si utilizza la stampa 3D come base per ambienti biologici cellularizzati. Inoltre, la comprensione da questo sistema ad alta produttività può essere utilizzata per il miglioramento dello screening rapido dei farmaci, il rapido sviluppo di modelli di co-colture e lo studio di stimoli meccanici sulla formazione dei vasi sanguigni per approfondire la conoscenza del sistema vascolare.

Il protocollo presentato, utilizzando tecniche stereolitografiche, consente la fabbricazione di impalcature tassellate realizzate in fotoresist SU-8. Sono state ottenute impalcature con geometrie distinte del compartimento (quadrati, esagoni e cerchi) e caratteristiche altamente accurate e ripetibili (Figura 1).
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Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

I tessuti ingegnerizzati si affidano fortemente a reti vascolari adeguate per fornire nutrienti e gas vitali e rimuovere i rifiuti metabolici. In questo lavoro, un protocollo di semina graduale di cellule endoteliali e cellule di supporto crea reti vascolari altamente organizzate in una piattaforma ad alta produttività per lo studio dello sviluppo del comportamento dei vasi in un ambiente 3D controllato.

Semina cellulare graduale su impalcature tassellate per studiare i vasi sanguigni germogliati

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...

Il nostro protocollo consente ai ricercatori di studiare il processo di formazione della rete dei vasi in modo chiaro e facilmente tracciabile, aprendo le porte a nuovi studi e facendo luce sul comportamento dei vasi sanguigni. Questa tecnica presenta la possibilità di creare reti vascolari altamente organizzate e ripetibili con risposta all'ambiente circostante. Le cellule endoteliali di pazienti affetti da una malattia vascolare possono essere recuperate utilizzando questo sistema, rendendo possibile ricreare la malattia vascolare e trovare un trattamento appropriato.Il metodo proposto può essere esteso per lo studio del comportamento della rete vascolare se abbinato a diversi tipi di cellule, consentendo di osservare l'interazione dei vasi in via di sviluppo con un tipo di tessuto specifico. Iniziare immergendo le impalcature in 70%etanolo per un minimo di 15 minuti, quindi lavarle due volte in PBS. Mescolare 1,5 microlitri di soluzione di fibronectina stock con 28,5 microlitri di PBS per impalcatura da seminare.Preparare una diluizione di fibronectina da utilizzare per tutte le impalcature per evitare errori di pipettaggio. Posizionare le impalcature in modo sparso sopra una superficie idrofobica e coprire ogni impalcatura con 30 microlitri della diluizione della fibronectina. Sostituire il coperchio della piastra e mettere le impalcature coperte di fibronectina in un'incubatrice impostata su 37 gradi Celsius e umidità al 100% per un minimo di un'ora.Dopo l'incubazione, sciacquare leggermente le impalcature in PBS per rimuovere i resti di fibronectina. Le impalcature possono essere conservate in PBS a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana. Preparare la cellula endoteliale o il mezzo EC mescolando il mezzo basale con i corrispondenti componenti del kit medio, tra cui una soluzione antibiotica, FBS e integratori per la crescita delle cellule endoteliali come indicato dal produttore.Effettuare la sospensione cellulare endoteliale microvascolare adiposa umana in mezzo CE con una concentrazione di quattro milioni di cellule per millilitro. Utilizzando le forcep, posizionare un'impalcatura rivestita con fibronectina per pozzo in una piastra non TC da 24. Coprire ogni impalcatura con 25 goccioline di microliter della sospensione cellulare, assicurandosi di non lasciare che la sospensione fluisca lontano dall'impalcatura.Metti il coperchio sul piatto e posizionalo in un'incubatrice a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e umidità del 100% per 60-90 minuti. Dopo l'incubazione, riempire ogni bene con 700 microlitri di mezzo CE. Incubare le impalcature endotelializzate fino a quando non si può osservare la confluenza EC usando la microscopia fluorescente o per tre giorni.Cambia il mezzo a giorni dall'altra. Preparare il mezzo DPSC mescolando 500 millilitri di DMEM a basso glucosio, 57,5 millilitri di FBS, 5,75 millilitri di amminoacidi non essenziali, 5,75 millilitri di GlutaMAX e 5,75 millilitri di soluzione di penicillina-streptomicina-nystatina. Trasferire le impalcature endotelializzate in una nuova piastra non TC a 24 pozza.Scartare tutti i supporti dalla piastra corrente utilizzando una pipetta o un'aspirazione sottovuoto, facendo attenzione a non applicare il vuoto direttamente sull'impalcatura. Posizionare un'impalcatura al centro di ogni pozzo, quindi asciugare l'area circostante con un leggero vuoto. Diluire le soluzioni stock di trombina e fibrinogeno con PBS ad una concentrazione finale rispettivamente di cinque unità per millilitro e 15 milligrammi per millilitro.Preparare un otto milioni di DPSC per sospensione millilitro nella diluizione della trombina e distribuire 12,5 microlitri della sospensione in singoli microtubi per impalcatura da seminare. Impostare una pipetta da cinque a 50 microlitri su 12,5 microlitri e riempirla con una soluzione di fibrinogeno. Senza rimuovere la punta, impostare la pipetta su 25 microlitri.Il materiale nella punta dovrebbe alzarsi e lasciare un volume vuoto. Premere lentamente il pulsante dello stantuffo fino a quando il liquido non raggiunge l'apertura della punta, ma non fuoriesci. Tenere lo stantuffo in questa posizione e mettere la punta in uno dei tubi di microcentrifugo contenenti le celle in sospensione trombina, assicurandosi che la punta sia a contatto con il liquido.Rilasciare delicatamente il pulsante dello stantuffo e disegnare la sospensione cellulare nella punta. Mescolare accuratamente entrambi i materiali, evitando la formazione di bolle. Erogare rapidamente i materiali misti sopra un'impalcatura endoteliale.Ripetere i passaggi precedenti per ogni impalcatura, assicurandosi di cambiare le punte tra gli usi per evitare una formazione imprevista di gel di fibrina all'interno della punta. Sostituire il coperchio della piastra e incubare le impalcature a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 100% di umidità per 30 minuti. Dopo l'incubazione, riempire ogni bene con un millilitro di DPSC uno a uno e mezzo EC.Cultura per una settimana, cambiando il mezzo a giorni nostri. In diversi punti di tempo durante la coltura, rimuovere il mezzo dal pozzo e immagini i costrutti usando un microscopio confocale per studiare lo sviluppo vascolare o qualsiasi altro parametro di interesse. Questo protocollo consente la fabbricazione di impalcature tassellate realizzate in fotoresist SU-8.Sono state ottenute impalcature con geometrie distinte del compartimento e caratteristiche altamente accurate e ripetibili. Con la tradizionale semina simultanea di cellule endoteliali e cellule di supporto, le cellule erano distribuite in modo omogeneo sull'impalcatura con conseguente reti vascolari imprevedibili e disorganizzate. Al contrario, la semina graduale delle cellule ha portato a reti vascolari altamente organizzate.Quando si utilizzano cellule endoteliali fluorescenti, i vasi possono essere immagini in tempo reale. Le proteine fluorescenti rosse che esprimono cellule endoteliali sono state coltivate su impalcature esagonali e immagini. Le cellule di supporto sono state aggiunte al primo giorno e le reti vascolari sono state immagini a giorni nostri per quantificare lo sviluppo delle navi.Per ogni punto di tempo sono state scattate ampie immagini dell'intera impalcatura. La crescita delle navi è stata quantificata come lunghezza e superficie totali delle navi. È stato eseguito un time-lapse di imaging confocale per consentire il tracciamento di singoli vasi utilizzando cellule endoteliali multicolori.Il percorso della nave è stato generato dal time-lapse, rendendo possibile osservare la migrazione delle navi. La maturazione dei vasi è stata osservata dalla presenza di actina muscolare liscia e cellule di supporto. Per i compartimenti circolari, esagonali e quadrati, le cellule si moltiplicano e si organizzano in strutture.Al settimo giorno, tutte le forme mostravano una rete vascolare ricca e complessa. Immagini di ingrandimento più elevate hanno rivelato un actina muscolare più denso e liscio e supportano la presenza cellulare co-localizzata con vasi formati, evidenziando il reclutamento cellulare di supporto e la differenziazione che circonda le strutture vascolari. Questa tecnica può essere utilizzata per studiare il comportamento delle reti vascolari tridimensionali quando esposte a condizioni diverse, come specifici inibitori cellulari o in presenza di tipi di cellule aggiuntive.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Bioingegneria

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