Name: stepwise cell seeding on tessellated scaffolds to study sprouting blood vessels
Uploaded: 2021-01-14T15:00:00
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この研究は、ミシガン大学- イスラエル研究パートナーシップからの資金によって支えられました。著者らは、ウリ・メルドラー、リオール・デビ、ガリア・ベン・デイビッドの大きな支援と支援、ミシガン大学ルーリー・ナノファブリケーション・ファシリティのナディーン・ワン博士とピラール・エレーラ・フィエロ博士、ルイス・ソロリオ博士のフォトリソグラフィー技術の議論に感謝したいと考えています。

1. テッセレーション足場製作
メモ:フォトリソグラフィは、ナノファブリケーション施設/研究室内に通常収容される特殊な機器を必要とする広範な技術です。このプロトコルでレイアウトされたメソッドは、聴衆のために可能な限り一般化されました。ただし、読者が利用できる機器によっては、手順を若干変更する必要があります。これらの手順は、ナノファブリケー?...

<ol>
	<li>Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+is+the+key+challenge+in+tissue+engineering.">Vascularization is the key challenge in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4), 300-311 (2011).</li><li>Landau, S., Guo, S., Levenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Engineered+Vasculature+within+3D+Tissue+Constructs.">Localization of Engineered Vasculature within 3D Tissue Constructs.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 2 (2018).</li><li>Griffith, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+Limits+of+an+in+Vitro+Thick+Prevascularized+Tissue.">Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue.</a> Tissue Engineering. 11 (12), (2005).</li><li>Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+and+therapeutic+aspects+of+angiogenesis.">Basic and therapeutic aspects of angiogenesis.</a> Cell. 146 (6), 873-887 (2011).</li><li>Landau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropoelastin+coated+PLLA-PLGA+scaffolds+promote+vascular+network+formation.">Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation.</a> Biomaterials. 122, 72-82 (2017).</li><li>Lesman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vessel-like+networks+within+multicellular+fibrin-based+constructs.">Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs.</a> Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).</li><li>Richards, D., Jia, J., Yost, M., Markwald, R., Mei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Bioprinting+for+Vascularized+Tissue+Fabrication.">3D Bioprinting for Vascularized Tissue Fabrication.</a> Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 132-147 (2017).</li><li>Levenberg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+skeletal+muscle+tissue.">Engineering vascularized skeletal muscle tissue.</a> Nature Biotechnology. 23 (7), 879-884 (2005).</li><li>Rouwkema, J., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+and+Angiogenesis+in+Tissue+Engineering:+Beyond+Creating+Static+Networks.">Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks.</a> Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+casting+of+patterned+vascular+networks+for+perfusable+engineered+three-dimensional+tissues.">Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues.</a> Nature Materials. 11, (2012).</li><li>Gariboldi, M. I., Butler, R., Best, S. M., Cameron, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vasculature+Architectural+effects+on+microcapillary-like+structure+self-assembly.">Engineering vasculature Architectural effects on microcapillary-like structure self-assembly.</a> PLOS ONE. 14 (1), 1-13 (2019).</li><li>Blache, U., Guerrero, J., G&#252;ven, S., Klar, A. S., Scherberich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+Networks+and+Models,+In+vitro+Formation.">Microvascular Networks and Models, In vitro Formation.</a> Vascularization for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. , 1-40 (2018).</li><li>Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Models+of+Vascular+Functions.">Microfluidic Models of Vascular Functions.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 14 (1), 205-230 (2012).</li><li>Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+the+vasculature+using+Organ-on-Chip+technology.">Recapitulating the vasculature using Organ-on-Chip technology.</a> Bioengineering. 7 (1), (2020).</li><li>Hasan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+techniques+for+development+of+3D+vascularized+tissue.">Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue.</a> Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).</li><li>Jordahl, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Jet+Writing:+Functional+Microtissues+Based+on+Tessellated+Scaffold+Architectures.">3D Jet Writing: Functional Microtissues Based on Tessellated Scaffold Architectures.</a> Advanced Materials. 30 (14), 1707196 (2018).</li><li>Gauvin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+complex+porous+tissue+engineering+scaffolds+using+3D+projection+stereolithography.">Microfabrication of complex porous tissue engineering scaffolds using 3D projection stereolithography.</a> Biomaterials. 33 (15), 3824-3834 (2012).</li><li>Coscoy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtopographies+control+the+development+of+basal+protrusions+in+epithelial+sheets.">Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets.</a> Biointerphases. 13 (4), 041003 (2018).</li><li>Kaplan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+prototyping+fabrication+of+soft+and+oriented+polyester+scaffolds+for+axonal+guidance.">Rapid prototyping fabrication of soft and oriented polyester scaffolds for axonal guidance.</a> Biomaterials. , (2020).</li><li>Steier, A., Mu&#241;iz, A., Neale, D., Lahann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Trends+in+Information-Driven+Engineering+of+Complex+Biological+Systems.">Emerging Trends in Information-Driven Engineering of Complex Biological Systems.</a> Advanced Materials. 31 (26), 11806898 (2019).</li><li>Szklanny, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Scaffold+System+for+Studying+the+Effect+of+Local+Geometry+and+Topology+on+the+Development+and+Orientation+of+Sprouting+Blood+Vessels.">High-Throughput Scaffold System for Studying the Effect of Local Geometry and Topology on the Development and Orientation of Sprouting Blood Vessels.</a> Advanced Functional Materials. , 1901335 (2019).</li><li>Welti, J., Loges, S., Dimmeler, S., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+molecular+discoveries+in+angiogenesis+and+antiangiogenic+therapies+in+cancer.">Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3190-3200 (2013).</li><li>Gui, L., Niklason, L. 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V., Moodie, K. L., Brennick, J. B., Su, A., Gimi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+evaluation+of+SU-8+biocompatibility.">In vitro and in vivo evaluation of SU-8 biocompatibility.</a> Materials Science &amp; Engineering. C, Materials for Biological Applications. 33 (7), 4453-4459 (2013).</li><li>Mathew, R., Ravi Sankar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+on+Surface+Stress-Based+Miniaturized+Piezoresistive+SU-8+Polymeric+Cantilever+Sensors.">A Review on Surface Stress-Based Miniaturized Piezoresistive SU-8 Polymeric Cantilever Sensors.</a> Nano-Micro Letters. 10 (2), 1-41 (2018).</li><li>Knowlton, S., Yenilmez, B., Anand, S., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocrosslinking-based+bioprinting:+Examining+crosslinking+schemes.">Photocrosslinking-based bioprinting: Examining crosslinking schemes.</a> Bioprinting. 5, 10-18 (2017).</li><li>Redd, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+human+microvascular+grafts+enable+rapid+vascularization+and+increase+perfusion+in+infarcted+rat+hearts.">Patterned human microvascular grafts enable rapid vascularization and increase perfusion in infarcted rat hearts.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).</li><li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SU-8+Photoresist.">SU-8 Photoresist.</a> Encyclopedia of Nanotechnology. , 2530-2543 (2012).</li><li>Zheng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-a-Chip+Systems:+Microengineering+to+Biomimic+Living+Systems.">Organ-on-a-Chip Systems: Microengineering to Biomimic Living Systems.</a> Small. 12 (17), 2253-2282 (2016).</li><li>Freiman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+endothelial+and+mesenchymal+stem+cells+enhance+vascular+network+formation+on+three-dimensional+constructs+in+vitro.">Adipose-derived endothelial and mesenchymal stem cells enhance vascular network formation on three-dimensional constructs in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 7 (1), 5 (2016).</li><li>van Duinen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfused+3D+angiogenic+sprouting+in+a+high-throughput+in+vitro+platform.">Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform.</a> Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).</li><li>Nguyen, D. -. H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+model+to+reconstitute+angiogenic+sprouting+morphogenesis+in+vitro.">Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (17), 6712-6717 (2013).</li><li>Nashimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+perfusable+vascular+networks+with+a+three-dimensional+tissue+in+a+microfluidic+device.">Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device.</a> Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).</li><li>Rosenfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+3D+vascular+networks+is+regulated+by+tensile+forces.">Morphogenesis of 3D vascular networks is regulated by tensile forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3215-3220 (2016).</li><li>Neto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+TAZ+regulate+adherens+junction+dynamics+and+endothelial+cell+distribution+during+vascular+development.">and TAZ regulate adherens junction dynamics and endothelial cell distribution during vascular development.</a> bioRxiv. , 174185 (2017).</li></ol>

設計された組織に埋め込まれた中で豊かな血管系の必要性は、構築の生存と適切な機能1のために重要です。血管系のエンジニアリングは膨大な研究の焦点となってきましたが、24を調査して理解するために多くが残されています。特に、特定の組織を再作成する場合、マイクロバスキュアチュアは12に応じて動作し、整理する必要があり?...

組織工学の分野は、欠損または損傷した器官および組織を置き換えるために設計された構造の製造に向けて急速に進んでいる1.しかし、組織の栄養のための運用血管ネットワークを生成することは依然として顕著な課題であるため、完全に機能する構造はまだ達成されていません。適切な血管化がなければ、工学的組織は酸素および栄養素の受動的拡散輸送に限定され、最大生存可能な組織厚さを拡散限界まで拘束し、約200μm2。このような厚みは、大きな組織欠損を修復したり、機能的および埋め込み型組織に必須の特性を機能的な血管ネットワークの存在をレンダリングする全臓器製造のためには適していない。
血管系は、多種多様な血管から構成され、サイズ、型、組織が異なり、宿主組織と密接に関連している。開発船と発芽船によって行われた行動、応答および移行の決定を理解することは、設計された組織4におけるそれらの統合を指示することができる。現在、インビトロ血管ネットワークを作成するための最も一般的なアプローチは、3次元のマイクロ環境内に播種された内皮細胞(EC)と支持細胞(SC、壁画細胞に分化する能力)を組み合わせることです。この環境は、細胞が血管ネットワーク2、5、6、7、8に接続し、増殖し、自己組み立てできるように、化学的および物理的な手がかりを提供します。共同培養すると、SCは細胞外マトリックス(ECM)タンパク質を分泌すると同時に、管状構造を形成するECsに機械的なサポートを提供します。さらに、両細胞型間の交差相互作用は、管切垂、血管発芽および遊走を促進し、SCの成熟およびα平滑筋アクチン発現(αSMA)壁画細胞への分化に加えて4。血管ネットワークの開発は、ヒドロゲル、多孔質ポリマー足場、またはその組み合わせを使用して作成された3D環境で最も一般的に研究されています。後者のオプションは、セルに優しい環境と、セルと ECM9の両方に必要な機械的サポートを提供します。
ヒドロゲル10上の細胞を共培養する、ヒドロゲルス足場の組み合わせ11、12、2Dプラットフォーム、およびマイクロ流体デバイス13を含む血管発達を研究するために多量の作業が行われている。しかし、ヒドロゲルは細胞力14によって容易に変形することができるが、2Dおよびマイクロ流体システムは、より近い自然環境を再現できず、より外界的な応答15、16を得る。形成容器が周囲の環境にどのように反応するかを理解することは、予測可能な方法で血管の開発を導く能力を備えたエンジニアリングされた環境の製造を可能にする重要な洞察を提供することができます。血管形成現象を理解することは、ステレオリソグラフィ、デジタル投影リソグラフィ、連続液体界面生産、3Dメルトエレクトロジェットライティング、ソリューションベースの3Dエレクトロジェット書き、および新しいバイオプリンティング技術17、18、19、20、21などのサブミクロンからミクロンへのスケール製造技術の急速な出現に追いつくために特に重要である。これらのマイクロマニュファクチャリング技術の制御を血管生物学の深い理解と整合させることは、標的組織に対する適切な工学的血管構造の作成の鍵となる。
ここでは、周囲の足場幾何学に対する新しい形成および発芽容器の応答を研究し、その芽発生とその後の移行22を観察する3Dシステムを提示する。テッセレーションコンパートメントの形状を持つ3Dスキャフォールドと2段階のシード技術を駆使し、明確で簡単に解析できる血管ネットワークを作り出すことに成功しました。テッセレーションされたジオメトリは、ローカル環境に応答する容器を含む個々のユニットで高スループットシステムを提供します。多色の IC を使用して、スプラウトの形成の原点とその後の移行パターンを追跡し、コンパートメント ジオメトリと SC 位置22と相関しました。
提案されたプロトコルは、幾何学的手がかりが血管化行動に及ぼす影響を分析するために準備されているが、このアプローチは拡大され、様々な新しいアプリケーションに適用することができる。テッセレーションされた足場と容易にイメージ可能なネットワークは、異なるICおよびSC相互作用の簡単な分析、特定の器官細胞の追加および血管ネットワークとの相互作用、血管ネットワークへの薬物効果などを可能にする。私たちの提案されたシステムの結果は非常に多目的で、簡単な製造および処理の。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Angiotool freeware</td>
			<td>NIH-CCR</td>
			<td></td>
			<td>Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine albumin serum Probumin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>82-045-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental pulp stem cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM media + bullet kit</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>#1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>Gadot-Group</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evicel fibrin sealant</td>
			<td>Johnson&#38;Johnson</td>
			<td>EVB05IL</td>
			<td>Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Cy3 antibody</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>115-166-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488</td>
			<td>Thermo- Fisher Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human adipose microvascular cells</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>#7200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0895-5MG</td>
			<td>Stock concentration: 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Gadot-Group</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lift-off reagent</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td>
			<td>G112850</td>
			<td>Commercial name Omnicoat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-glucose DMEM</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-050-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SMA antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in PBS</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>SC-281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-032-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-vWF antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Silicon Valley Microelectronics (SVM)</td>
			<td></td>
			<td>Wafers 4&#34;, Type N-1-10, 500-550 microns thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050 photoresist</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td>
			<td>Y11058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryton-X 100</td>
			<td>BioLab LTD</td>
			<td>57836</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stepwise cell seeding on tessellated scaffolds to study sprouting blood vessels

心血管系は、人間の生理学の重要なプレーヤーであり、体内のほとんどの組織に栄養を提供します。血管は、各特定の浸透組織に応じて異なるサイズ、構造、フェノタイプ、および性能で存在する。損傷または欠けている身体組織の修復または置き換えを目的とする組織工学の分野は、制御された血管新生に依存して、設計された組織内で適切な血管導入を生み出す。血管系がなければ、厚い工学的な構造は十分に栄養を与えられず、細胞死、生着不良、そして最終的には失敗を引き起こし得る。このように、操作された血管の挙動を理解し、制御することは、この分野における顕著な課題です。この研究は、3D足場環境における船舶行動を研究するための組織的かつ繰り返し可能な船舶ネットワークの作成を可能にするハイスループットシステムを提示する。この2段階のシーディングプロトコルは、システム内の血管が足場地形に反応し、血管が存在する区画形状に応じて独特の発芽動作を示すことを示しています。この高スループットシステムから得られた結果と理解は、より良い3Dバイオプリント足場構築設計を知らせるために適用することができ、細胞化された生物学的環境の基礎として3Dプリンティングを使用する場合、様々な3Dジオメトリの製造を迅速に評価することはできません。さらに、この高スループットシステムからの理解は、迅速な薬物スクリーニングの改善、共培養モデルの急速な開発、血管形成に関する機械的刺激の検討を行い、血管系の知識を深めるために利用することができる。

提示されたプロトコルは、ステレオリソグラフィー技術を使用して、SU-8フォトレジストで作られたテッセレーション足場の製作を可能にする。異なるコンパートメントジオメトリ(正方形、六角形、円)を持つ足場と、精度の高い再現性の高い特徴が得られました(図1)。
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Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

設計された組織は、重要な栄養素やガスを提供し、代謝廃棄物を除去するために適切な血管ネットワークに大きく依存しています。この研究では、内皮細胞と支持細胞の段階的な播種プロトコルにより、制御された3D環境における血管挙動の開発を研究するための高スループットプラットフォームで、高度に組織化された血管ネットワークを作成する。

発芽血管を研究するためのテッセレーション足場の段階的な細胞播種

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...

私たちのプロトコルは、研究者が明確かつ簡単に追跡可能な方法で血管ネットワーク形成プロセスを研究することを可能にし、新しい研究への扉を開き、血管の行動に光を当てることができます。この技術は、周囲の環境に応答して、高度に組織化され、反復可能な血管ネットワークを作成する可能性を提示します。血管疾患を患う患者由来の内皮細胞をこのシステムを用いて回収することができ、血管疾患を再現し、適切な治療法を見つけることを可能にする。提案された方法は、異なる細胞タイプと組み合わせたときに血管ネットワークの挙動を研究するために拡張することができ、特定の組織タイプとの発達血管の相互作用を観察することを可能にする。スキャフォールドを最低15分間70%エタノールに浸し、PBSで2回洗います。フィブロネクチンストック溶液1.5マイクロリットルを、スキャフォールドあたり28.5マイクロリットルのPBSと混合して播種する。ピペットのエラーを避けるために、すべての足場に使用される1フィブロネクチン希釈液を準備します。疎水性表面の上にスキャフォールドをまばらに置き、フィブロネクチン希釈液の30マイクロリットルで各足場を覆います。プレートの蓋を交換し、フィブロネクチンで覆われた足場を摂氏37度、湿度100%に設定したインキュベーターに1時間以上入れます。インキュベーション後、PBSでスキャフォールドを軽くすすいでフィブロネクチン残骸を除去する。足場は、最大1週間、摂氏4度でPBSに保管することができます。製造者が示す抗生物質溶液、FBS、および内皮細胞増殖サプリメントを含む、対応する培地キット成分と基底培地を混合して、内皮細胞またはEC培地を調製する。ヒト脂肪微小血管内皮細胞懸濁液を、1ミリリットル当たり400万個の細胞濃度でEC培地に含めます。鉗子を使用して、非TC 24ウェルプレートにウェルあたり1フィブロネクチンコーティング足場を1つ置きます。各足場を細胞懸濁液の25マイクロリットルの液滴で覆い、サスペンションが足場から流れ落ちないようにします。蓋をプレートに置き、60〜90分間、摂氏37度、二酸化炭素5%、湿度100%のインキュベーターに入れます。インキュベーション後、各々に700マイクロリットルのEC培地を充填します。蛍光顕微鏡を用いて、または3日間、EC合流を観察できるまで、内皮化足場をインキュベートする。1 日おきにメディアを変更します。低グルコースDMEMの500ミリリットル、FBSの57.5ミリリットル、非必須アミノ酸の5.75ミリリットル、グルタマックス5.75ミリリットル、ペニシリンストレプマイシン-ナイスタチン溶液5.75ミリリットルを混合することによってDPSC培地を調製する。内皮化された足場を新しい非TC 24ウェルプレートに移します。現在のプレートからすべての媒体を、ピペットまたは真空吸引を使用して廃棄し、足場に真空を直接適用しないように注意してください。各井戸の中央に足場を1つ置き、周囲を軽い真空で乾燥させます。PBSを用いた希釈トロンビンおよびフィブリノーゲンストック溶液を、それぞれ1ミリリットル当たり5単位、15ミリグラムの最終濃度にします。トロンビン希釈で1ミリリットルの懸濁液あたり800万DPSCを調製し、播種する足場あたり個々のマイクロチューブに懸濁液の12.5マイクロリットルを配布します。5~50マイクロリットルのピペットを12.5マイクロリットルにセットし、フィブリノーゲン溶液で満たします。チップを取り外さずに、ピペットを25マイクロリットルにセットします。先端の材料が上昇し、空のボリュームを残す必要があります。液体が先端の開口部に届くまで、プランジャーボタンをゆっくりと押しますが、漏れません。プランジャーをこの位置に持ち、トロンビン懸濁液中の細胞を含むマイクロ遠心分離管の1つにチップを入れ、先端が液体に接触していることを確認します。プランジャーボタンをそっと放し、セルサスペンションを先端に引き込みます。両方の材料を十分に混合し、泡の形成を避けます。内皮化足場の上に混合材料を素早く分配する。各スキャフォールドに対して上記の手順を繰り返し、チップ内の予期しないフィブリンゲル形成を避けるために、用途間のチップを変更してください。プレート蓋を交換し、スキャフォールドを摂氏37度、炭酸ガス5%、湿度100%で30分間インキュベートします。インキュベーション後、1対1のDPSCおよびEC培地を1ミリリットルずつ充填します。1週間の培養、一日おきに培地を交換する。培養中の異なる時点で、ウェルから培地を取り出し、共焦点顕微鏡を使用して構築物を画像化し、血管の発達または他の目的のパラメータを研究する。このプロトコルはSU-8のフォトレジストから成っているテセレーション足場の製造を可能にする。明確なコンパートメント形状と非常に正確で再現可能な特徴を備えた足場が得られました。従来の内皮細胞と支持細胞の両方の同時播種により、細胞は足場上に均一に分散し、予測不可能で組織化されていない血管ネットワークを生じた。それどころか、段階的な細胞播種は、高度に組織化された血管ネットワークをもたらした。蛍光内皮細胞を使用する場合、血管をリアルタイムで画像化することができます。内皮細胞を発現する赤色蛍光タンパク質を六角足場上で培養し、画像化した。支持細胞を1日目に添加し、血管ネットワークを1日おきに画像化して血管の発達を定量化した。各時点について、足場全体の広い画像が撮影されました。容器の成長は、容器の全長および面積として定量化した。多色の内皮細胞を用いた単一の血管追跡を可能にするために、共焦点イメージングタイムラプスを行った。船路はタイムラプスから発生し、船舶の移動を観察することが可能です。血管成熟は平滑筋アクチンおよび支持細胞の存在によって観察された。円形、六角形、および二乗コンパートメントの場合、細胞は増殖し、構造に編成されます。7日目までに、すべての形状は豊かで複雑な血管ネットワークを示した。より高い倍率画像は、形成された血管と共局化した高密度平滑筋アクチンおよび支持細胞存在を明らかにし、支持細胞の採用および血管構造を取り巻く分化を促進した。この技術は、特定の細胞阻害剤や追加の細胞タイプの存在下で異なる条件にさらされたときの三次元血管ネットワークの挙動を研究するために使用することができる。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

のための周期的圧力のバイオリアクターの設計生体外で</em大動脈心臓弁の>研究

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

幹細胞培養アプリケーションのための3Dフィブリン足場の調製

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

3次元細胞培養のための自己申告足場

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

脂質ナノチューブ上血液凝固第VIII因子の螺旋組織

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

同心円状のゲルシステムは、3D細胞移動に対するマトリックスの微小環境の生物物理役割を研究する

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds &#8212; Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

非透明の足場上のイメージング細胞の生存率 - 小説ニットチタンインプラントの使用例

Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

組織工学的応用の制御可能な形態の三次元 Poly(ε-caprolactone) 足場のエレクトロスピニング記述を溶かす

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

iPSC由来内皮細胞の浸透した3D血管新生発芽をインビトロで研究するための標準化およびスケーラブルなアッセイ

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

DiI による心灌流を用いた Teleost 脳および下垂体の血管の標識

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...