Name: stepwise cell seeding on tessellated scaffolds to study sprouting blood vessels
Uploaded: 2021-01-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels at JoVE.com

이 연구는 미시간 대학에서 자금 지원 - 연구를위한 이스라엘 파트너십. 저자는 우리 머들러, 리어 데비, 갈리아 벤 데이비드의 큰 도움과 지원에 감사드립니다, 나딘 왕, 박사와 필라 헤레라 피에로, 미시간 대학의 루리 나노 패브릭 시설의 박사, 뿐만 아니라 루이스 솔로리오, 사진 촬영 기술의 계몽 에 대한 박사.

1. 테셀레이션 스캐폴드 제작
참고: 포토리스소그래피는 일반적으로 나노 제조 시설/실험실 내에 보관되는 특수 장비를 필요로 하는 광범위한 기술입니다. 이 프로토콜에 명시된 방법은 청중을 위해 가능한 한 일반화되었습니다. 그러나 독자가 사용할 수 있는 장비에 따라 절차에 약간의 변경이 필요할 수 있습니다. 최고 공정 품질을 보장하기 위해 나노 제조 시설의 클린 룸에...

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	<li>Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+is+the+key+challenge+in+tissue+engineering.">Vascularization is the key challenge in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4), 300-311 (2011).</li><li>Landau, S., Guo, S., Levenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Engineered+Vasculature+within+3D+Tissue+Constructs.">Localization of Engineered Vasculature within 3D Tissue Constructs.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 2 (2018).</li><li>Griffith, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+Limits+of+an+in+Vitro+Thick+Prevascularized+Tissue.">Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue.</a> Tissue Engineering. 11 (12), (2005).</li><li>Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+and+therapeutic+aspects+of+angiogenesis.">Basic and therapeutic aspects of angiogenesis.</a> Cell. 146 (6), 873-887 (2011).</li><li>Landau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropoelastin+coated+PLLA-PLGA+scaffolds+promote+vascular+network+formation.">Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation.</a> Biomaterials. 122, 72-82 (2017).</li><li>Lesman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vessel-like+networks+within+multicellular+fibrin-based+constructs.">Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs.</a> Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).</li><li>Richards, D., Jia, J., Yost, M., Markwald, R., Mei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Bioprinting+for+Vascularized+Tissue+Fabrication.">3D Bioprinting for Vascularized Tissue Fabrication.</a> Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 132-147 (2017).</li><li>Levenberg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+skeletal+muscle+tissue.">Engineering vascularized skeletal muscle tissue.</a> Nature Biotechnology. 23 (7), 879-884 (2005).</li><li>Rouwkema, J., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+and+Angiogenesis+in+Tissue+Engineering:+Beyond+Creating+Static+Networks.">Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks.</a> Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+casting+of+patterned+vascular+networks+for+perfusable+engineered+three-dimensional+tissues.">Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues.</a> Nature Materials. 11, (2012).</li><li>Gariboldi, M. I., Butler, R., Best, S. M., Cameron, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vasculature+Architectural+effects+on+microcapillary-like+structure+self-assembly.">Engineering vasculature Architectural effects on microcapillary-like structure self-assembly.</a> PLOS ONE. 14 (1), 1-13 (2019).</li><li>Blache, U., Guerrero, J., G&#252;ven, S., Klar, A. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Jet+Writing:+Functional+Microtissues+Based+on+Tessellated+Scaffold+Architectures.">3D Jet Writing: Functional Microtissues Based on Tessellated Scaffold Architectures.</a> Advanced Materials. 30 (14), 1707196 (2018).</li><li>Gauvin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+complex+porous+tissue+engineering+scaffolds+using+3D+projection+stereolithography.">Microfabrication of complex porous tissue engineering scaffolds using 3D projection stereolithography.</a> Biomaterials. 33 (15), 3824-3834 (2012).</li><li>Coscoy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtopographies+control+the+development+of+basal+protrusions+in+epithelial+sheets.">Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets.</a> Biointerphases. 13 (4), 041003 (2018).</li><li>Kaplan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+prototyping+fabrication+of+soft+and+oriented+polyester+scaffolds+for+axonal+guidance.">Rapid prototyping fabrication of soft and oriented polyester scaffolds for axonal guidance.</a> Biomaterials. , (2020).</li><li>Steier, A., Mu&#241;iz, A., Neale, D., Lahann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Trends+in+Information-Driven+Engineering+of+Complex+Biological+Systems.">Emerging Trends in Information-Driven Engineering of Complex Biological Systems.</a> Advanced Materials. 31 (26), 11806898 (2019).</li><li>Szklanny, A. 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C, Materials for Biological Applications. 33 (7), 4453-4459 (2013).</li><li>Mathew, R., Ravi Sankar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+on+Surface+Stress-Based+Miniaturized+Piezoresistive+SU-8+Polymeric+Cantilever+Sensors.">A Review on Surface Stress-Based Miniaturized Piezoresistive SU-8 Polymeric Cantilever Sensors.</a> Nano-Micro Letters. 10 (2), 1-41 (2018).</li><li>Knowlton, S., Yenilmez, B., Anand, S., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocrosslinking-based+bioprinting:+Examining+crosslinking+schemes.">Photocrosslinking-based bioprinting: Examining crosslinking schemes.</a> Bioprinting. 5, 10-18 (2017).</li><li>Redd, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+human+microvascular+grafts+enable+rapid+vascularization+and+increase+perfusion+in+infarcted+rat+hearts.">Patterned human microvascular grafts enable rapid vascularization and increase perfusion in infarcted rat hearts.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).</li><li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SU-8+Photoresist.">SU-8 Photoresist.</a> Encyclopedia of Nanotechnology. , 2530-2543 (2012).</li><li>Zheng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-a-Chip+Systems:+Microengineering+to+Biomimic+Living+Systems.">Organ-on-a-Chip Systems: Microengineering to Biomimic Living Systems.</a> Small. 12 (17), 2253-2282 (2016).</li><li>Freiman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+endothelial+and+mesenchymal+stem+cells+enhance+vascular+network+formation+on+three-dimensional+constructs+in+vitro.">Adipose-derived endothelial and mesenchymal stem cells enhance vascular network formation on three-dimensional constructs in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 7 (1), 5 (2016).</li><li>van Duinen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfused+3D+angiogenic+sprouting+in+a+high-throughput+in+vitro+platform.">Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform.</a> Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).</li><li>Nguyen, D. -. H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+model+to+reconstitute+angiogenic+sprouting+morphogenesis+in+vitro.">Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (17), 6712-6717 (2013).</li><li>Nashimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+perfusable+vascular+networks+with+a+three-dimensional+tissue+in+a+microfluidic+device.">Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device.</a> Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).</li><li>Rosenfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+3D+vascular+networks+is+regulated+by+tensile+forces.">Morphogenesis of 3D vascular networks is regulated by tensile forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3215-3220 (2016).</li><li>Neto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+TAZ+regulate+adherens+junction+dynamics+and+endothelial+cell+distribution+during+vascular+development.">and TAZ regulate adherens junction dynamics and endothelial cell distribution during vascular development.</a> bioRxiv. , 174185 (2017).</li></ol>

엔지니어링 된 조직에 내장 된 내에 풍부한 혈관에 대한 필요성은 생존과 적절한 기능1을구성하는 데 중요합니다. 혈관 시스템을 엔지니어링하는 것은 방대한 양의 연구의 초점이었지만, 많은 사람들이조사하고 24를이해하기 위해 남아 있습니다. 특히, 특정 조직을 재현할 때, 마이크로혈관은12에따라 행동하고 구성해야 한다. 마이크로혈관 ?...

조직 공학 분야는 누락되거나 손상된 장기 및 조직1을대체하기 위해 엔지니어링 된 구조의 제조로 빠르게 진행되고 있습니다. 그러나 조직 영양을 위한 작동 혈관 네트워크를 생성하는 것은 여전히 뛰어난 과제로 남아 있기 때문에 완전한 기능 구조는 아직 달성되지 못했습니다. 적절한 혈관화없이, 엔지니어링 된 조직은 산소와 영양소의 수동 확산 수송에 제한, 확산 한계에 최대 실행 가능한 조직 두께를 제한, 약 200 μm2. 이러한 두께는 기능성 혈관 네트워크의 존재를 기능적 및 이식형 조직에 대한 필수 특성으로 만드는 대형 조직 결함을 복구하거나 전체 장기 제조에 적합하지 않습니다3.
혈관 계통은 다양한 혈관으로 구성되어 있으며, 다양한 크기, 표현형 및 조직으로 숙주 조직과 밀접한 관련이 있습니다. 개발 및 발아 선박에 의해 수행 된 행동, 응답 및 마이그레이션 결정을 이해하면 엔지니어링 조직에 통합을 지시 할 수 있습니다4. 현재, 체외 혈관 네트워크를 만들기위한 가장 일반적인 접근 방식은 내피 세포 (EC)와 지원 세포 (SC, 벽화 세포로 분화 할 수있는 능력)를 결합하는 것입니다. 이 환경은 세포가 혈관 네트워크2,5,6,7,8에부착, 증식 및 자가 조립할 수 있도록 화학적및물리적 신호를 제공한다. 공동 배양시, SC는 세포 외 매트릭스 (ECM) 단백질을 분비하면서 관 구조를 형성하는 IC에 기계적 지원을 제공합니다. 더욱이, 두 세포 유형 간의 상호 작용은 관형성, 혈관 발아 및 이주를 촉진하며, SC 성숙 및 분화 이외에 α-부드러운 근육 액틴 발현(αSMA) 벽화 세포4로의기양양하게 된다. 선박 네트워크 개발은 하이드로겔, 다공성 폴리머 스캐폴드 또는 이들의 조합을 사용하여 생성된 3D 환경에서 가장 일반적으로 연구된다. 후자의 옵션은 셀 친화적 인 환경과 세포와 ECM9모두에 필요한 기계적 지원을 동일하게 제공합니다.
하이드로겔(10),하이드로겔스-스캐폴드 조합11,12,2D 플랫폼, 미세유체장치(13)에세포를 공동 배양하는 등 혈관 발달을 연구하기 위해 많은 양의 작업이 수행되었다. 그러나, 하이드로겔은 세포가 가해지는힘(14)에의해 용이하게 변형될 수 있고, 2D 및 미세유체시스템은 보다 추정가능한반응(15,16)을얻기 위해 자연에 가까운 환경을 재현하지 못한다. 형성 선박이 주변 환경에 어떻게 반응하는지 이해하면 선박 개발을 예측 가능한 방식으로 안내할 수 있는 엔지니어링 환경을 제작할 수 있는 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 혈관 형성 현상을 이해하는 것은 스테레오리소그래피, 디지털 프로젝션 리소그래피, 연속 액체 인터페이스 생산, 3D 용융 전자 제트 라이팅, 솔루션 기반 3D 일렉트로젯 쓰기, 그리고 신흥 바이오 프린팅기술17,18,19,20, 20,21과같은 서브미칸 -미크로닌 스케일 제조 기술의 급속한 출현과 보조를 맞추기 위해 특히 중요합니다. 혈관 생물학의 심화된 이해와 이러한 미세 제조 기술의 제어를 조정하는 것은 표적 조직에 적합한 엔지니어링 혈관의 생성에 핵심입니다.
여기서, 우리는 주변 비계 기하학에 새로운 형성 및 발아 선박의 반응을 연구하는 3D 시스템을 제시, 그들의 새싹 기원과 후속 마이그레이션(22)를관찰. 테셀레이트 구획 지오메트리와 2단계 파종 기술이 있는 3D 스캐폴드를 활용하여 명확하고 쉽게 분석할 수 있는 고도로 조직화된 혈관 네트워크를 만드는 데 성공했습니다. 테셀레이션 된 형상은 로컬 환경에 반응하는 선박을 포함하는 개별 유닛을 갖춘 높은 처리량 시스템을 제공합니다. 다색 EC를 사용하여, 우리는 구획 형상 및 SC위치(22)와상관관계가 있는 새싹 형성 기원 및 후속 마이그레이션 패턴을 추적하였다.
제안된 프로토콜은 혈관화 동작에 대한 기하학적 단서의 영향을 분석할 준비가 되어 있지만, 이 방법은 다양한 새로운 응용 분야에 확장및 적용할 수 있습니다. 테셀레이션 스캐폴드와 쉽게 이미지할 수 있는 네트워크는 다양한 IC 및 SCs 상호 작용, 특정 장기 세포의 추가 및 혈관 네트워크와의 상호 작용, 혈관 네트워크에 대한 약물 효과 등을 간단하게 분석할 수 있게 해주었습니다. 우리의 제안 된 시스템은 매우 다양하고 간단한 제작 및 처리의 결과.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Angiotool freeware</td>
			<td>NIH-CCR</td>
			<td></td>
			<td>Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine albumin serum Probumin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>82-045-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental pulp stem cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM media + bullet kit</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>#1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>Gadot-Group</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evicel fibrin sealant</td>
			<td>Johnson&#38;Johnson</td>
			<td>EVB05IL</td>
			<td>Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Cy3 antibody</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>115-166-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488</td>
			<td>Thermo- Fisher Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human adipose microvascular cells</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>#7200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0895-5MG</td>
			<td>Stock concentration: 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Gadot-Group</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lift-off reagent</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td>
			<td>G112850</td>
			<td>Commercial name Omnicoat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-glucose DMEM</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-050-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SMA antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in PBS</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>SC-281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-032-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-vWF antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Silicon Valley Microelectronics (SVM)</td>
			<td></td>
			<td>Wafers 4&#34;, Type N-1-10, 500-550 microns thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050 photoresist</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td>
			<td>Y11058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryton-X 100</td>
			<td>BioLab LTD</td>
			<td>57836</td>
		</tr>
	</tbody>
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stepwise cell seeding on tessellated scaffolds to study sprouting blood vessels

심장 혈관 시스템은 인간의 생리학의 핵심 선수, 본문에 대부분의 조직에 영양을 제공; 혈관은 각 특정 perfused 조직에 따라 다른 크기, 구조, 표현형 및 성능에 존재합니다. 손상되거나 누락된 신체 조직을 수리하거나 대체하는 것을 목표로 하는 조직 공학 분야는 통제된 혈관신생에 의존하여 엔지니어링된 조직 내에서 적절한 혈관화를 만듭니다. 혈관 시스템이 없으면 두꺼운 엔지니어링 구조가 충분히 영양을 공급할 수 없으므로 세포 사멸, 이식 불량 및 궁극적으로 실패가 발생할 수 있습니다. 따라서, 엔지니어링 된 혈관의 행동을 이해하고 제어하는 것은 분야에서 뛰어난 도전이다. 이 작업은 3D 스캐폴드 환경에서 선박 동작을 연구하기 위한 조직적이고 반복 가능한 선박 네트워크를 생성할 수 있는 높은 처리량 시스템을 제공합니다. 이 2단계 파종 프로토콜은 시스템 내의 선박이 스캐폴드 지형에 반응한다는 것을 보여 주며, 선박이 거주하는 구획 형상에 따라 독특한 발아 동작을 제시합니다. 이러한 높은 처리량 시스템에서 얻은 결과와 이해는 더 나은 3D 생체 인쇄 스캐폴드 구조 설계를 알리기 위해 적용될 수 있으며, 이를 통해 3D 프린팅을 세포화된 생물학적 환경의 기초로 사용할 때 다양한 3D 형상의 제조를 신속하게 평가할 수 없다. 더욱이, 이러한 높은 처리량 시스템에서의 이해는 급속한 약물 스크리닝의 개선, 공동 배양 모델의 급속한 발전, 혈관 시스템의 지식을 심화시키기 위해 혈관 형성에 대한 기계적 자극의 조사를 위해 활용될 수 있다.

제시 된 프로토콜, 스테레오 소그래피 기술을 사용하여, SU-8 포토 레지스트로 만든 테셀레이션 스캐폴드의 제조를 허용합니다. 뚜렷한 구획 형상(사각형, 육각형 및 원)을 가진 스캐폴드를 획득했으며 매우 정확하고 반복 가능한 특징이 얻어졌다(그림1).
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Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

엔지니어링 된 조직은 중요한 영양소와 가스를 제공하고 신진 대사 폐기물을 제거하기 위해 적절한 혈관 네트워크에 크게 의존합니다. 이 작업에서는 내피 세포 및 지지 세포의 단계별 파종 프로토콜이 제어된 3D 환경에서 혈관 거동을 연구하기 위한 고도로 조직된 혈관 네트워크를 생성합니다.

스테셀레이트 비계에 단계별 세포 파종하여 발아 혈관을 연구합니다.

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...

우리의 프로토콜은 연구원이 명확하고 쉽게 추적 할 수있는 방식으로 혈관 네트워크 형성 과정을 연구 할 수 있습니다, 새로운 연구에 문을 열고 혈관 행동에 빛을 흘리. 이 기술은 주변 환경에 반응하여 고도로 조직되고 반복 가능한 혈관 네트워크를 만들 수 있는 가능성을 제시합니다. 혈관 질환을 앓고있는 환자로부터내피 세포는이 시스템을 사용하여 회수 할 수 있으므로 혈관 질환을 재현하고 적절한 치료를 찾을 수 있습니다.제안된 방법은 다른 세포 모형과 결합될 때 혈관 네트워크 행동을 공부하기 위한 확장될 수 있고, 특정 조직 모형을 가진 발전 선박의 상호 작용을 관찰하는 것을 허용합니다. 비계를 70%에 잠은 것으로 시작하여 최소 15분 동안 비계를 잠은 다음 PBS에서 두 번 세척합니다. 1.5 마이크로리터의 fibronectin 스톡 용액을 스캐폴드 당 PBS 28.5 마이크로리터와 혼합하여 시드를 드시면 됩니다.파이펫팅 오류를 피하기 위해 모든 스캐폴드에 사용할 하나의 fibronectin 희석을 준비합니다. 스캐폴드를 소수성 표면 위에 희소하게 놓고 각 비계를 섬유넥틴 희석의 30 마이크로리터로 덮습니다. 플레이트뚜껑을 교체하고 섬유네틴으로 덮인 비계를 섭씨 37도, 습도 100%로 설정된 인큐베이터에 최소 1시간 동안 넣습니다.잠복 후 PBS에서 비계를 가볍게 헹구어 섬유네틴 잔재를 제거합니다. 비계는 PBS에서 최대 1주일 동안 섭씨 4도에서 보관할 수 있습니다. 제조업체에 의해 표시된 바와 같이 항생제 용액, FBS 및 내피 세포 성장 보충제를 포함하는 해당 배지 키트 성분과 기저 배지를 혼합하여 내피 세포 또는 EC 배지를 준비한다.밀리리터 당 4백만 개의 세포 농도로 EC 배지에서 인간 지방 미세 혈관 내피 세포 현탁액을 만듭니다. 집게를 사용하여 TC 24웰이 아닌 플레이트에 잘 1개의 섬유네틴 코팅 비계를 놓습니다. 각 스캐폴드를 셀 서스펜션의 25 마이크로리터 방울로 덮어 서스펜션이 스캐폴드에서 흘러나가지 않도록 하십시오.뚜껑을 접시에 놓고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 습도 100%로 60~90분간 인큐베이터에 넣습니다. 인큐베이션 후, EC 배지의 700 마이크로리터로 각 우물을 채웁니다. EC 합류가 형광 현미경 검사를 사용하거나 3 일 동안 관찰 될 때까지 내피 비계를 배양하십시오.격일로 매체를 변경합니다. 낮은 포도당 DMEM의 500 밀리리터, FBS의 57.5 밀리리터, 비필수 아미노산의 5.75 밀리리터, 글루타맥스의 5.75 밀리리터, 5.75 밀리리터의 페니실린-연쇄절제술-니스타틴 용액을 혼합하여 DPSC 배지를 준비하십시오. 내피비슬리드 비계를 새로운 비TC 24웰 플레이트로 옮킨다.스캐폴드에 진공을 직접 바르지 않도록 주의하여 파이펫 또는 진공 흡입을 사용하여 현재 플레이트의 모든 미디어를 폐기하십시오. 각 우물의 중앙에 비계 1개를 넣은 다음 가벼운 진공으로 주변 지역을 건조시다. PBS로 혈소및 피브리노겐 스톡 솔루션을 밀리리터당 5단위, 밀리리터당 15밀리그램의 최종 농도로 희석합니다.혈소판 희석에서 밀리리터 서스펜션당 800만 DPSC를 준비하고 12.5마이크로리터의 현탁액을 스캐폴드 당 개별 마이크로튜브에 분배하여 종자를 한다. 5-50 마이크로리터 파이펫을 12.5 마이크로리터로 설정하고 피브리노겐 용액으로 채웁니다. 팁을 제거하지 않고 파이펫을 25 마이크로리터로 설정합니다.팁의 재질은 상승하여 빈 볼륨을 남겨두어야 합니다. 액체가 팁 개구부에 도달할 때까지 플런저 버튼을 천천히 누르지만 누출되지 않습니다. 플런저를 이 위치에 놓고 팁을 혈전 현탁액에 있는 세포를 포함하는 마이크로센트심분리기 튜브 중 하나에 넣어 팁이 액체와 접촉하고 있는지 확인합니다.플런저 버튼을 부드럽게 풀어 서 셀 서스펜션을 팁에 그립니다. 두 재료를 철저히 혼합하여 거품 형성을 피하십시오. 내피비폴드 위에 혼합 재료를 신속하게 분배합니다.각 스캐폴드에 대한 이전 단계를 반복하여 팁 내에서 예기치 않은 피브린 젤 형성을 피하기 위해 사용 간에 팁을 변경해야 합니다. 플레이트 뚜껑을 교체하고 비계를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 습도 100%로 30분간 인큐베이션합니다. 인큐베이션 후 일대일 DPSC 및 EC 배지의 1밀리리터로 각 웰을 채웁니다.1 주일 동안 문화, 격일로 매체를 변경합니다. 배양 시 상이한 시점에서, 혈관 발달 또는 기타 관심 있는 파라미터를 연구하기 위해 공초점 현미경을 이용하여 우물에서 배지를 제거하고 구문들을 이미지한다. 이 프로토콜은 SU-8 포토레지스트로 만든 테셀레이션 스캐폴드를 제조할 수 있습니다.뚜렷한 구획 형상과 매우 정확하고 반복 가능한 피쳐가 있는 스캐폴드를 획득했습니다. 내피 세포와 지지 세포 모두의 전통적인 동시 파종으로 세포는 스캐폴드에 균질적으로 분포되어 예측할 수 없는 조직화된 혈관 네트워크를 생성했습니다. 반대로, 단계별 세포 파종은 고도로 조직화된 혈관 네트워크를 초래했습니다.형광 내피 세포를 사용하는 경우 혈관을 실시간으로 배분 할 수 있습니다. 내피 세포를 발현하는 적색 형광 단백질은 육각형 비계에서 배양되고 이미지되었다. 지원 세포는 첫날에 추가되었고 혈관 네트워크는 선박 개발을 정량화하기 위해 격일로 이미지화되었습니다.매 시간 마다 전체 비계의 넓은 이미지가 촬영되었습니다. 선박의 성장은 총 선박 길이 및 면적으로 정량화되었다. 공초점 이미징 시간 경과는 다색 내피 세포를 사용하여 단일 혈관 추적을 허용하기 위해 수행되었다.선박 경로는 시간 경과에서 생성되어 선박 이주를 관찰할 수 있게 되었습니다. 혈관 성숙은 부드러운 근육 액틴 및 지지 세포의 존재에 의해 관찰되었다. 원형, 육각형 및 제곱 구획의 경우 세포가 번식하여 구조로 구성됩니다.7일째가 되면 모든 모양이 풍부하고 복잡한 혈관 네트워크를 보였습니다. 배율상상에서는 형성된 혈관과 공동국화된 조밀한 원평근육 액틴 및 지지 세포 존재, 혈관 구조를 둘러싼 지지세포 모집 및 분화를 공고하게 하였다. 이 기술은 특정 세포 억제제와 같은 다른 조건에 노출될 때 또는 추가 세포 모형의 존재에서 3차원 혈관 네트워크의 동작을 연구하기 위하여 이용될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

연구

생체공학

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

3D 섬유소의 준비는 줄기 세포 배양 용도 공사장 공중 발판

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

방법 혈액 - 뇌 장벽의 인간 세포 기반의 연락 모델의 준비를 위해 개선

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

지질 나노 튜브에 혈액 응고 인자 VIII의 나선형 조직

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

동심 젤 시스템은 3 차원 세포의 이동에 매트릭스 미세 환경의 생물 물리학 역할을 연구하는

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds &#8212; Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

비 투명 공사장 공중 발판에 이미징 세포 생존 - 소설 니트 티타늄 임플란트의 예를 사용하여

Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

조직 공학 응용 프로그램에 대 한 제어 형태학과 3 차원 Poly(ε-caprolactone) 장비의 전기 글 녹아

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

iPSC 유래 내피 세포의 퍼퓨비드 3D 혈관신생 발아연구를 위한 표준화 및 확장 성 분석

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

텔 레 Ost 뇌와 뇌 하 수 체에 있는 혈관의 라벨링은 DiI와 함께 심장 관류를 사용 하 여

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...