Name: stepwise cell seeding on tessellated scaffolds to study sprouting blood vessels
Uploaded: 2021-01-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada por financiamento da Universidade de Michigan - Israel Partnership for Research. Os autores gostariam de agradecer a Uri Merdler, Lior Debbi e Galia Ben David por sua grande ajuda e apoio, Nadine Wang, Ph.D. e Pilar Herrera-Fierro, Ph.D. da Lurie Nanofabrication Facility na Universidade de Michigan, bem como Luis Solorio, Ph.D. para esclarecer discussões de técnicas de fotoliografia.

1. Fabricação de andaimes tesvendados
NOTA: A fotolitografia é uma técnica difundida que requer equipamentos especializados tipicamente alojados dentro de uma instalação/laboratório de nanofabização. O método estabelecido neste protocolo foi generalizado o máximo possível para o público; no entanto, pequenas alterações nos procedimentos podem ser necessárias dependendo do equipamento disponível ao leitor. Recomendamos a realização desses procedimentos em uma sala limpa em uma ...

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	<li>Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+is+the+key+challenge+in+tissue+engineering.">Vascularization is the key challenge in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4), 300-311 (2011).</li><li>Landau, S., Guo, S., Levenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Engineered+Vasculature+within+3D+Tissue+Constructs.">Localization of Engineered Vasculature within 3D Tissue Constructs.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 2 (2018).</li><li>Griffith, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+Limits+of+an+in+Vitro+Thick+Prevascularized+Tissue.">Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue.</a> Tissue Engineering. 11 (12), (2005).</li><li>Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+and+therapeutic+aspects+of+angiogenesis.">Basic and therapeutic aspects of angiogenesis.</a> Cell. 146 (6), 873-887 (2011).</li><li>Landau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropoelastin+coated+PLLA-PLGA+scaffolds+promote+vascular+network+formation.">Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation.</a> Biomaterials. 122, 72-82 (2017).</li><li>Lesman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vessel-like+networks+within+multicellular+fibrin-based+constructs.">Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs.</a> Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).</li><li>Richards, D., Jia, J., Yost, M., Markwald, R., Mei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Bioprinting+for+Vascularized+Tissue+Fabrication.">3D Bioprinting for Vascularized Tissue Fabrication.</a> Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 132-147 (2017).</li><li>Levenberg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+skeletal+muscle+tissue.">Engineering vascularized skeletal muscle tissue.</a> Nature Biotechnology. 23 (7), 879-884 (2005).</li><li>Rouwkema, J., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+and+Angiogenesis+in+Tissue+Engineering:+Beyond+Creating+Static+Networks.">Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks.</a> Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+casting+of+patterned+vascular+networks+for+perfusable+engineered+three-dimensional+tissues.">Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues.</a> Nature Materials. 11, (2012).</li><li>Gariboldi, M. I., Butler, R., Best, S. M., Cameron, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vasculature+Architectural+effects+on+microcapillary-like+structure+self-assembly.">Engineering vasculature Architectural effects on microcapillary-like structure self-assembly.</a> PLOS ONE. 14 (1), 1-13 (2019).</li><li>Blache, U., Guerrero, J., G&#252;ven, S., Klar, A. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+the+vasculature+using+Organ-on-Chip+technology.">Recapitulating the vasculature using Organ-on-Chip technology.</a> Bioengineering. 7 (1), (2020).</li><li>Hasan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+techniques+for+development+of+3D+vascularized+tissue.">Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue.</a> Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).</li><li>Jordahl, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Jet+Writing:+Functional+Microtissues+Based+on+Tessellated+Scaffold+Architectures.">3D Jet Writing: Functional Microtissues Based on Tessellated Scaffold Architectures.</a> Advanced Materials. 30 (14), 1707196 (2018).</li><li>Gauvin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+complex+porous+tissue+engineering+scaffolds+using+3D+projection+stereolithography.">Microfabrication of complex porous tissue engineering scaffolds using 3D projection stereolithography.</a> Biomaterials. 33 (15), 3824-3834 (2012).</li><li>Coscoy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtopographies+control+the+development+of+basal+protrusions+in+epithelial+sheets.">Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets.</a> Biointerphases. 13 (4), 041003 (2018).</li><li>Kaplan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+prototyping+fabrication+of+soft+and+oriented+polyester+scaffolds+for+axonal+guidance.">Rapid prototyping fabrication of soft and oriented polyester scaffolds for axonal guidance.</a> Biomaterials. , (2020).</li><li>Steier, A., Mu&#241;iz, A., Neale, D., Lahann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Trends+in+Information-Driven+Engineering+of+Complex+Biological+Systems.">Emerging Trends in Information-Driven Engineering of Complex Biological Systems.</a> Advanced Materials. 31 (26), 11806898 (2019).</li><li>Szklanny, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Scaffold+System+for+Studying+the+Effect+of+Local+Geometry+and+Topology+on+the+Development+and+Orientation+of+Sprouting+Blood+Vessels.">High-Throughput Scaffold System for Studying the Effect of Local Geometry and Topology on the Development and Orientation of Sprouting Blood Vessels.</a> Advanced Functional Materials. , 1901335 (2019).</li><li>Welti, J., Loges, S., Dimmeler, S., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+molecular+discoveries+in+angiogenesis+and+antiangiogenic+therapies+in+cancer.">Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3190-3200 (2013).</li><li>Gui, L., Niklason, L. 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V., Moodie, K. L., Brennick, J. B., Su, A., Gimi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+evaluation+of+SU-8+biocompatibility.">In vitro and in vivo evaluation of SU-8 biocompatibility.</a> Materials Science &amp; Engineering. C, Materials for Biological Applications. 33 (7), 4453-4459 (2013).</li><li>Mathew, R., Ravi Sankar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+on+Surface+Stress-Based+Miniaturized+Piezoresistive+SU-8+Polymeric+Cantilever+Sensors.">A Review on Surface Stress-Based Miniaturized Piezoresistive SU-8 Polymeric Cantilever Sensors.</a> Nano-Micro Letters. 10 (2), 1-41 (2018).</li><li>Knowlton, S., Yenilmez, B., Anand, S., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocrosslinking-based+bioprinting:+Examining+crosslinking+schemes.">Photocrosslinking-based bioprinting: Examining crosslinking schemes.</a> Bioprinting. 5, 10-18 (2017).</li><li>Redd, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+human+microvascular+grafts+enable+rapid+vascularization+and+increase+perfusion+in+infarcted+rat+hearts.">Patterned human microvascular grafts enable rapid vascularization and increase perfusion in infarcted rat hearts.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).</li><li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SU-8+Photoresist.">SU-8 Photoresist.</a> Encyclopedia of Nanotechnology. , 2530-2543 (2012).</li><li>Zheng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-a-Chip+Systems:+Microengineering+to+Biomimic+Living+Systems.">Organ-on-a-Chip Systems: Microengineering to Biomimic Living Systems.</a> Small. 12 (17), 2253-2282 (2016).</li><li>Freiman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+endothelial+and+mesenchymal+stem+cells+enhance+vascular+network+formation+on+three-dimensional+constructs+in+vitro.">Adipose-derived endothelial and mesenchymal stem cells enhance vascular network formation on three-dimensional constructs in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 7 (1), 5 (2016).</li><li>van Duinen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfused+3D+angiogenic+sprouting+in+a+high-throughput+in+vitro+platform.">Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform.</a> Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).</li><li>Nguyen, D. -. H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+model+to+reconstitute+angiogenic+sprouting+morphogenesis+in+vitro.">Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (17), 6712-6717 (2013).</li><li>Nashimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+perfusable+vascular+networks+with+a+three-dimensional+tissue+in+a+microfluidic+device.">Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device.</a> Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).</li><li>Rosenfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+3D+vascular+networks+is+regulated+by+tensile+forces.">Morphogenesis of 3D vascular networks is regulated by tensile forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3215-3220 (2016).</li><li>Neto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+TAZ+regulate+adherens+junction+dynamics+and+endothelial+cell+distribution+during+vascular+development.">and TAZ regulate adherens junction dynamics and endothelial cell distribution during vascular development.</a> bioRxiv. , 174185 (2017).</li></ol>

A necessidade de uma vasculatura rica dentro de tecidos projetados é fundamental para a sobrevivência da construção e função adequada1. Embora a engenharia do sistema vascular tenha sido o foco de uma vasta quantidade de pesquisas, muito resta investigar e entender24. Em particular, ao recriar um tecido específico, a microvasculatura deve se comportar e organizar-se nesse ponto12. A abordagem mais comum para a geração de microvessels é a co...

O campo da engenharia de tecidos está progredindo rapidamente para a fabricação de construtos projetados para substituir órgãos e tecidos perdidos ou danificados1. No entanto, construções totalmente funcionais ainda não foram alcançadas, em parte, uma vez que a geração de redes vasculares operacionais para nutrição tecidual continua sendo um desafio notável. Sem a vascularização adequada, os tecidos projetados limitam-se a um transporte passivo de difusão de oxigênio e nutrientes, restringindo a espessura máxima do tecido viável ao limite de difusão, aproximadamente 200 μm2. Tais espessuras não são adequadas para reparar grandes defeitos teciduais ou para a fabricação completa de órgãos, o que torna a presença da rede vascular funcional uma característica obrigatória para tecidos funcionais e implantáveis3.
O sistema vascular é composto por uma grande variedade de vasos sanguíneos, com diferentes tamanhos, fenótipos e organização, fortemente relacionados ao tecido hospedeiro. Compreender o comportamento, a resposta e as decisões migratórias tomadas pelos vasos em desenvolvimento e brotação pode instruir sua integração nos tecidos projetados4. Atualmente, a abordagem mais comum para a criação de redes vasculares in vitro é combinar células endoteliais (CE) com células de suporte (SCs, com a capacidade de diferenciar-se em células murais), semeadas dentro de um microambique tridimensional. Este ambiente fornece pistas químicas e físicas para permitir que as células se conectem, proliferem e se auto-reúnam nas redes de vasos2,5,6,7,8. Quando co-cultivados, os SCs secretam proteínas de matriz extracelular (ECM) ao mesmo tempo em que fornecem suporte mecânico às CES, que formam as estruturas tubulares. Além disso, uma interação cruzada entre ambos os tipos de células promove a tubulogênese, o broto de vasos e a migração, além da maturação e diferenciação dos SCs em células murais de α-suave actin-expressing (αSMA)4. O desenvolvimento da rede de navios é mais comumente estudado em ambientes 3D criados com hidrogel, andaimes poliméricos porosos ou uma combinação disso. Esta última opção também fornece um ambiente amigável às células e o suporte mecânico necessário tanto para as células quanto para o ECM9.
Uma grande quantidade de trabalho tem sido realizada para estudar o desenvolvimento vascular, incluindo co-cultivo das células em hidrogéis10,combinações de hidrogels-andaimes11,12,plataformas 2D e dispositivos microfluidos13. No entanto, os hidrogéis podem ser facilmente deformados pelas forças14,enquanto os sistemas 2D e microfluidos não conseguem recriar um ambiente mais próximo da natureza para obter uma resposta mais extrapolada15,16. Entender como os navios formadores reagem ao seu ambiente circundante pode fornecer uma visão crítica que pode permitir a fabricação de ambientes projetados com a capacidade de orientar o desenvolvimento da embarcação de forma previsível. Compreender fenômenos de formação vascular é especialmente fundamental para acompanhar o rápido surgimento de técnicas de fabricação em escala submicron-micron, como estereografografia, litografia de projeção digital, produção contínua de interface líquida, jetwriting 3D, escrita de jato eletro 3D baseada em solução e técnicas emergentes de bioimpressão17,18,19,20,21. Alinhar o controle dessas técnicas de micromanufatura com uma compreensão aprofundada da biologia vascular é fundamental para a criação de uma vasculatura projetada adequada para um tecido alvo.
Aqui, apresentamos um sistema 3D para estudar a resposta de novos vasos formadores e brotantes à geometria do andaime circundante, observando sua origem do broto e migração subsequente22. Utilizando andaimes 3D com geometrias de compartimento tesvendadas, e uma técnica de semeadura em duas etapas, conseguimos criar redes vasculares altamente organizadas de forma clara e fácil de analisar. As geometrias tessellated fornecem um sistema de alta produção com unidades individuais contendo embarcações que respondem ao seu ambiente local. Utilizando ECs multicoloridos, rastreamos origens de formação de brotos e padrões de migração subsequentes, correlacionados à geometria do compartimento e à localização22dos SCs .
Embora o protocolo proposto tenha sido preparado para analisar os efeitos das pistas geométricas sobre o comportamento vascularização, essa abordagem pode ser expandida e aplicada a uma variedade de novas aplicações. O andaime tessellado e as redes facilmente inflamáveis permitem a análise direta de diferentes CEs e interação de SCs, a adição de células específicas de órgãos e sua interação com as redes vasculares, efeito medicamentoso nas redes vasculares e muito mais. Nosso sistema sugerido resulta muito versátil e de simples fabricação e processamento.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Angiotool freeware</td>
			<td>NIH-CCR</td>
			<td></td>
			<td>Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine albumin serum Probumin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>82-045-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental pulp stem cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM media + bullet kit</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>#1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>Gadot-Group</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evicel fibrin sealant</td>
			<td>Johnson&#38;Johnson</td>
			<td>EVB05IL</td>
			<td>Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Cy3 antibody</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>115-166-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488</td>
			<td>Thermo- Fisher Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human adipose microvascular cells</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>#7200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0895-5MG</td>
			<td>Stock concentration: 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Gadot-Group</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lift-off reagent</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td>
			<td>G112850</td>
			<td>Commercial name Omnicoat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-glucose DMEM</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-050-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SMA antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in PBS</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>SC-281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-032-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-vWF antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Silicon Valley Microelectronics (SVM)</td>
			<td></td>
			<td>Wafers 4&#34;, Type N-1-10, 500-550 microns thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050 photoresist</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td>
			<td>Y11058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryton-X 100</td>
			<td>BioLab LTD</td>
			<td>57836</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stepwise cell seeding on tessellated scaffolds to study sprouting blood vessels

O sistema cardiovascular é um ator-chave na fisiologia humana, proporcionando nutrição à maioria dos tecidos do corpo; os vasos estão presentes em diferentes tamanhos, estruturas, fenótipos e desempenho, dependendo de cada tecido perfumado específico. O campo da engenharia de tecidos, que visa reparar ou substituir tecidos corporais danificados ou ausentes, conta com angiogênese controlada para criar uma vascularização adequada dentro dos tecidos projetados. Sem um sistema vascular, construções grossas projetadas não podem ser suficientemente nutridas, o que pode resultar em morte celular, má engrafia e, finalmente, falha. Assim, compreender e controlar o comportamento dos vasos sanguíneos projetados é um desafio marcante no campo. Este trabalho apresenta um sistema de alta produtividade que permite a criação de redes de embarcações organizadas e repetíveis para estudar o comportamento dos navios em um ambiente de andaime 3D. Este protocolo de semeadura em duas etapas mostra que os vasos dentro do sistema reagem à topografia do andaime, apresentando comportamentos distintos de brotação dependendo da geometria do compartimento em que os vasos residem. Os resultados obtidos e a compreensão deste sistema de alto rendimento podem ser aplicados a fim de informar melhores projetos de construção de andaimes bioimpressos 3D, onde a fabricação de várias geometrias 3D não pode ser rapidamente avaliada ao usar a impressão 3D como base para ambientes biológicos celularizados. Além disso, o entendimento deste sistema de alto rendimento pode ser utilizado para a melhoria do rastreamento rápido de medicamentos, o rápido desenvolvimento de modelos de co-culturas e a investigação de estímulos mecânicos na formação de vasos sanguíneos para aprofundar o conhecimento do sistema vascular.

O protocolo apresentado, utilizando técnicas de estereotipografia, permite a fabricação de andaimes tesvendados feitos de fotoresist SU-8. Andaimes com geometrias de compartimento distintas (quadrados, hexágonos e círculos) e características altamente precisas e repetíveis foram obtidas(Figura 1).
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Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

Os tecidos projetados dependem fortemente de redes vasculares adequadas para fornecer nutrientes e gases vitais e remover resíduos metabólicos. Neste trabalho, um protocolo de semeadura passo a passo de células endoteliais e células de suporte cria redes vasculares altamente organizadas em uma plataforma de alta produtividade para estudar o desenvolvimento do comportamento da embarcação em um ambiente 3D controlado.

Semeadura de células stepwise em andaimes tesavendados para estudar vasos sanguíneos brotando

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...

Nosso protocolo permite que os pesquisadores estudem o processo de formação da rede de vasos de forma clara e facilmente rastreável, abrindo as portas para novos estudos e lançando luz sobre o comportamento dos vasos sanguíneos. Esta técnica apresenta a possibilidade de criar redes vasculares altamente organizadas e repetíveis com resposta ao ambiente circundante. As células endoteliais de pacientes que sofrem de uma doença vascular podem ser recuperadas no uso desse sistema, possibilitando recriar a doença vascular e encontrar um tratamento adequado.O método proposto pode ser estendido para estudar o comportamento da rede vascular quando emparelhado com diferentes tipos de células, permitindo observar a interação dos vasos em desenvolvimento com um tipo específico de tecido. Comece submergindo os andaimes em 70% de etanol por um mínimo de 15 minutos, depois lave-os duas vezes na PBS. Misture 1,5 microliters de solução de estoque de fibronectina com 28,5 microliters de PBS por andaime a ser semeado.Prepare uma diluição de fibronectina para ser usada para todos os andaimes para evitar erros de pipetação. Coloque os andaimes escassamente em cima de uma superfície hidrofóbica e cubra cada andaime com 30 microlitres da diluição da fibronectina. Substitua a tampa da placa e coloque os andaimes cobertos de fibronectina em uma incubadora fixada a 37 graus Celsius e 100% de umidade por um mínimo de uma hora.Após a incubação, enxágue levemente os andaimes em PBS para remover os remanescentes de fibronectina. Os andaimes podem ser mantidos na PBS a quatro graus Celsius por até uma semana. Prepare a célula endotelial ou o meio EC misturando o meio basal com os componentes correspondentes do kit médio, incluindo uma solução antibiótica, FBS e suplementos de crescimento de células endoteliais, conforme indicado pelo fabricante.Faça a suspensão da célula endotelial microvascular de adiposa humana em meio ce com uma concentração de quatro milhões de células por mililitro. Usando fórceps, coloque um andaime revestido de fibronectina por poço em uma placa não TC 24-well. Cubra cada andaime com 25 gotículas de microliter da suspensão da célula, certificando-se de não deixar a suspensão fluir para longe do andaime.Coloque a tampa na placa e coloque-a em uma incubadora a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 100% umidade por 60 a 90 minutos. Após a incubação, encha cada poço com 700 microliters de meio CE. Incubar os andaimes endotelializados até que a confluência ce possa ser observada usando microscopia fluorescente ou por três dias.Mude o meio dia não. Prepare o meio DPSC misturando 500 mililitros de DMEM de baixa glicose, 57,5 mililitros de FBS, 5,75 mililitros de aminoácidos não essenciais, 5,75 mililitros de GlutaMAX e 5,75 mililitros de solução penicilina-estreptomicina-nystatin. Transfira os andaimes endotelializados para uma nova placa não-TC 24-well.Descarte todas as mídias da placa atual usando uma pipeta ou sucção a vácuo, tomando cuidado para não aplicar vácuo diretamente no andaime. Coloque um andaime no centro de cada poço e seque a área circundante com vácuo leve. Diluir as soluções de trombina e fibrinogênio com PBS para uma concentração final de cinco unidades por mililitro e 15 miligramas por mililitro, respectivamente.Prepare uma suspensão de oito milhões de DPSC por mililitro na diluição da trombina e distribua 12,5 microliters da suspensão em microtubos individuais por andaime a ser semeado. Defina uma pipeta de 5 a 50 microlitres para 12,5 microliters e encha-a com solução fibrinogênio. Sem remover a ponta, coloque a pipeta em 25 microliters.O material na ponta deve subir e deixar um volume vazio. Pressione lentamente o botão do êmbolo até que o líquido atinja a abertura da ponta, mas não vaze. Segure o êmbolo nesta posição e coloque a ponta em um dos tubos de microcentrifuuge contendo as células em suspensão de trombina, certificando-se de que a ponta esteja em contato com o líquido.Solte suavemente o botão do êmbolo e puxe a suspensão da célula para a ponta. Misture bem os dois materiais, evitando a formação de bolhas. Dispense rapidamente os materiais mistos em cima de um andaime endotelializado.Repita as etapas anteriores para cada andaime, certificando-se de alterar dicas entre os usos para evitar a formação inesperada de gel fibrin dentro da ponta. Substitua a tampa da placa e incuba os andaimes a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 100% de umidade por 30 minutos. Após a incubação, encha cada poço com um mililitro de dpsc e meio EC.Cultura por uma semana, mudando o meio a cada dois dias. Em diferentes pontos de tempo durante a cultura, remova o meio do poço e imagem dos construtos usando um microscópio confocal para estudar o desenvolvimento vascular ou qualquer outro parâmetro de interesse. Este protocolo permite a fabricação de andaimes tesvendados feitos de fotoresist SU-8.Foram obtidos andaimes com geometrias de compartimento distintas e características altamente precisas e repetíveis. Com a tradicional semeadura simultânea de células endoteliais e células de suporte, as células foram distribuídas de forma homogênea sobre o andaime, resultando em redes vasculares imprevisíveis e desorganizadas. Ao contrário, a semeadura de células stepwise resultou em redes vasculares altamente organizadas.Ao usar células endoteliais fluorescentes, os vasos podem ser imagens em tempo real. Proteína fluorescente vermelha expressando células endoteliais foram cultivadas em andaimes hexagonais e imagens. As células de suporte foram adicionadas no primeiro dia e as redes vasculares foram imagens a cada dois dias para quantificar o desenvolvimento dos vasos.Para cada ponto de tempo, imagens largas de todo o andaime foram tiradas. O crescimento da embarcação foi quantificado como comprimento total do vaso e área. Um lapso de tempo de imagem confocal foi realizado para permitir o rastreamento de um único vaso usando células endoteliais multicoloridas.O caminho da embarcação foi gerado a partir do lapso de tempo, possibilitando observar a migração da embarcação. A maturação do vaso foi observada pela presença de actina muscular lisa e células de apoio. Para os compartimentos circulares, hexagonais e quadrados, as células se multiplicam e se organizam em estruturas.No sétimo dia, todas as formas mostravam uma rede vascular rica e complexa. Imagens de ampliação mais altas revelaram uma actina muscular suave mais densa e presença celular de suporte co-localizada com vasos formados, evidenciando recrutamento de células de apoio e diferenciação em torno de estruturas vasculares. Essa técnica pode ser usada para estudar o comportamento de redes vasculares tridimensionais quando expostas a diferentes condições, como inibidores celulares específicos ou na presença de tipos celulares adicionais.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

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Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

Viabilidade imagens de células em Scaffolds não-transparentes - usando o exemplo de um Titanium Implant Novel malha

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Derreter a eletrofiação escrita de andaimes Poly(ε-caprolactone) tridimensional com morfologias controláveis para aplicações de engenharia de tecidos

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Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

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