Name: stepwise cell seeding on tessellated scaffolds to study sprouting blood vessels
Uploaded: 2021-01-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels at JoVE.com

Esta investigación fue apoyada por fondos de la Asociación para la Investigación universidad de Michigan - Israel. Los autores desean agradecer a Uri Merdler, Lior Debbi y Galia Ben David por su gran ayuda y apoyo, a Nadine Wang, Ph.D. y Pilar Herrera-Fierro, Ph.D. de la Lurie Nanofabrication Facility en la Universidad de Michigan, así como a Luis Solorio, Ph.D. por sus esclarecedoras discusiones sobre técnicas de fotolitografía.

1. Fabricación de andamios teselados
NOTA: La fotolitografía es una técnica generalizada que requiere equipos especializados que normalmente se encuentran dentro de una instalación de nanofabricación / laboratorio. El método establecido en este protocolo se generalizó tanto como fue posible para la audiencia; sin embargo, pueden ser necesarios ligeros cambios en los procedimientos dependiendo del equipo disponible para el lector. Recomendamos realizar estos procedimientos en una sala limp...

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	<li>Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+is+the+key+challenge+in+tissue+engineering.">Vascularization is the key challenge in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4), 300-311 (2011).</li><li>Landau, S., Guo, S., Levenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Engineered+Vasculature+within+3D+Tissue+Constructs.">Localization of Engineered Vasculature within 3D Tissue Constructs.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 2 (2018).</li><li>Griffith, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+Limits+of+an+in+Vitro+Thick+Prevascularized+Tissue.">Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue.</a> Tissue Engineering. 11 (12), (2005).</li><li>Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+and+therapeutic+aspects+of+angiogenesis.">Basic and therapeutic aspects of angiogenesis.</a> Cell. 146 (6), 873-887 (2011).</li><li>Landau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropoelastin+coated+PLLA-PLGA+scaffolds+promote+vascular+network+formation.">Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation.</a> Biomaterials. 122, 72-82 (2017).</li><li>Lesman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vessel-like+networks+within+multicellular+fibrin-based+constructs.">Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs.</a> Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).</li><li>Richards, D., Jia, J., Yost, M., Markwald, R., Mei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Bioprinting+for+Vascularized+Tissue+Fabrication.">3D Bioprinting for Vascularized Tissue Fabrication.</a> Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 132-147 (2017).</li><li>Levenberg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+skeletal+muscle+tissue.">Engineering vascularized skeletal muscle tissue.</a> Nature Biotechnology. 23 (7), 879-884 (2005).</li><li>Rouwkema, J., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+and+Angiogenesis+in+Tissue+Engineering:+Beyond+Creating+Static+Networks.">Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks.</a> Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+casting+of+patterned+vascular+networks+for+perfusable+engineered+three-dimensional+tissues.">Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues.</a> Nature Materials. 11, (2012).</li><li>Gariboldi, M. I., Butler, R., Best, S. M., Cameron, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vasculature+Architectural+effects+on+microcapillary-like+structure+self-assembly.">Engineering vasculature Architectural effects on microcapillary-like structure self-assembly.</a> PLOS ONE. 14 (1), 1-13 (2019).</li><li>Blache, U., Guerrero, J., G&#252;ven, S., Klar, A. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+the+vasculature+using+Organ-on-Chip+technology.">Recapitulating the vasculature using Organ-on-Chip technology.</a> Bioengineering. 7 (1), (2020).</li><li>Hasan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+techniques+for+development+of+3D+vascularized+tissue.">Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue.</a> Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).</li><li>Jordahl, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Jet+Writing:+Functional+Microtissues+Based+on+Tessellated+Scaffold+Architectures.">3D Jet Writing: Functional Microtissues Based on Tessellated Scaffold Architectures.</a> Advanced Materials. 30 (14), 1707196 (2018).</li><li>Gauvin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+complex+porous+tissue+engineering+scaffolds+using+3D+projection+stereolithography.">Microfabrication of complex porous tissue engineering scaffolds using 3D projection stereolithography.</a> Biomaterials. 33 (15), 3824-3834 (2012).</li><li>Coscoy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtopographies+control+the+development+of+basal+protrusions+in+epithelial+sheets.">Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets.</a> Biointerphases. 13 (4), 041003 (2018).</li><li>Kaplan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+prototyping+fabrication+of+soft+and+oriented+polyester+scaffolds+for+axonal+guidance.">Rapid prototyping fabrication of soft and oriented polyester scaffolds for axonal guidance.</a> Biomaterials. , (2020).</li><li>Steier, A., Mu&#241;iz, A., Neale, D., Lahann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Trends+in+Information-Driven+Engineering+of+Complex+Biological+Systems.">Emerging Trends in Information-Driven Engineering of Complex Biological Systems.</a> Advanced Materials. 31 (26), 11806898 (2019).</li><li>Szklanny, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Scaffold+System+for+Studying+the+Effect+of+Local+Geometry+and+Topology+on+the+Development+and+Orientation+of+Sprouting+Blood+Vessels.">High-Throughput Scaffold System for Studying the Effect of Local Geometry and Topology on the Development and Orientation of Sprouting Blood Vessels.</a> Advanced Functional Materials. , 1901335 (2019).</li><li>Welti, J., Loges, S., Dimmeler, S., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+molecular+discoveries+in+angiogenesis+and+antiangiogenic+therapies+in+cancer.">Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3190-3200 (2013).</li><li>Gui, L., Niklason, L. 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V., Moodie, K. L., Brennick, J. B., Su, A., Gimi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+evaluation+of+SU-8+biocompatibility.">In vitro and in vivo evaluation of SU-8 biocompatibility.</a> Materials Science &amp; Engineering. C, Materials for Biological Applications. 33 (7), 4453-4459 (2013).</li><li>Mathew, R., Ravi Sankar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+on+Surface+Stress-Based+Miniaturized+Piezoresistive+SU-8+Polymeric+Cantilever+Sensors.">A Review on Surface Stress-Based Miniaturized Piezoresistive SU-8 Polymeric Cantilever Sensors.</a> Nano-Micro Letters. 10 (2), 1-41 (2018).</li><li>Knowlton, S., Yenilmez, B., Anand, S., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocrosslinking-based+bioprinting:+Examining+crosslinking+schemes.">Photocrosslinking-based bioprinting: Examining crosslinking schemes.</a> Bioprinting. 5, 10-18 (2017).</li><li>Redd, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+human+microvascular+grafts+enable+rapid+vascularization+and+increase+perfusion+in+infarcted+rat+hearts.">Patterned human microvascular grafts enable rapid vascularization and increase perfusion in infarcted rat hearts.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).</li><li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SU-8+Photoresist.">SU-8 Photoresist.</a> Encyclopedia of Nanotechnology. , 2530-2543 (2012).</li><li>Zheng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-a-Chip+Systems:+Microengineering+to+Biomimic+Living+Systems.">Organ-on-a-Chip Systems: Microengineering to Biomimic Living Systems.</a> Small. 12 (17), 2253-2282 (2016).</li><li>Freiman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+endothelial+and+mesenchymal+stem+cells+enhance+vascular+network+formation+on+three-dimensional+constructs+in+vitro.">Adipose-derived endothelial and mesenchymal stem cells enhance vascular network formation on three-dimensional constructs in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 7 (1), 5 (2016).</li><li>van Duinen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfused+3D+angiogenic+sprouting+in+a+high-throughput+in+vitro+platform.">Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform.</a> Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).</li><li>Nguyen, D. -. H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+model+to+reconstitute+angiogenic+sprouting+morphogenesis+in+vitro.">Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (17), 6712-6717 (2013).</li><li>Nashimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+perfusable+vascular+networks+with+a+three-dimensional+tissue+in+a+microfluidic+device.">Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device.</a> Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).</li><li>Rosenfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+3D+vascular+networks+is+regulated+by+tensile+forces.">Morphogenesis of 3D vascular networks is regulated by tensile forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3215-3220 (2016).</li><li>Neto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+TAZ+regulate+adherens+junction+dynamics+and+endothelial+cell+distribution+during+vascular+development.">and TAZ regulate adherens junction dynamics and endothelial cell distribution during vascular development.</a> bioRxiv. , 174185 (2017).</li></ol>

La necesidad de una vasculatura rica dentro de los tejidos incrustados en la ingeniería es fundamental para la supervivencia de la construcción y la función adecuada1. Aunque la ingeniería del sistema vascular ha sido el foco de una gran cantidad de investigación, queda mucho por investigar y entender24. En particular, al recrear un tejido específico, la microvasculatura debe comportarse y organizarse en consecuencia12. El enfoque más común p...

El campo de la ingeniería de tejidos está progresando rápidamente hacia la fabricación de construcciones de ingeniería para reemplazar órganos y tejidos perdidos o dañados1. Sin embargo, las construcciones completamente funcionales todavía tienen que ser alcanzadas, en parte, puesto que la generación de las redes vasculares operacionales para la nutrición del tejido sigue siendo un desafío excepcional. Sin la vascularización adecuada, los tejidos diseñados se limitan a un transporte de difusión pasiva de oxígeno y nutrientes, limitando el espesor máximo viable del tejido al límite de difusión, aproximadamente 200 μm2. Tales espesores no son adecuados para reparar defectos tisulares grandes o para la fabricación completa de órganos, lo que hace que la presencia de una red vascular funcional sea una característica obligatoria para los tejidos funcionales e implantables3.
El sistema vascular se compone de una amplia variedad de vasos sanguíneos, con diversos tamaños, fenotipos, y organización, estrechamente relacionados con el tejido del anfitrión. Comprender el comportamiento, la respuesta y las decisiones de migración tomadas por los vasos en desarrollo y germinación puede indicar su integración en los tejidos deingeniería 4. Actualmente, el enfoque más común para crear redes vasculares in vitro es la combinación de células endoteliales (CE) con células de apoyo (SCs, con la capacidad de diferenciarse en células murales), sembradas dentro de un micro-ambiente tridimensional. Este entorno proporciona señales químicas y físicas para permitir que las células se adhieran, proliferen y seautoensamblan en redes de vasos2,5,6,7,8. Cuando se co-cultivan, los SCs secretan proteínas de la matriz extracelular (ECM) mientras proporcionan soporte mecánico a los CE, que forman las estructuras tubulares. Además, una interacción cruzada entre ambos tipos de células promueve la tubulogénesis, la brotación de vasos y la migración, además de la maduración y diferenciación de las SCs en células murales que expresan actina muscular α (αSMA)4. El desarrollo de redes de buques se estudia más comúnmente en entornos 3D creados con hidrogeles, andamios poliméricos porosos o una combinación de ellos. Esta última opción proporciona igualmente un entorno amigable con las células y el soporte mecánico requerido tanto para las células como para el ECM9.
Se ha llevado a cabo una gran cantidad de trabajo para estudiar el desarrollo vascular, incluyendo el co-cultivo de las células en hidrogeles10,combinaciones hidrogeles-andamios11,12,plataformas 2D, y dispositivos microfluídicos13. Sin embargo, los hidrogeles pueden ser fácilmente deformados por las fuerzas ejercidas por las células14,mientras que los sistemas 2D y microfluídicos no logran recrear un ambiente más cercano a la naturaleza para obtener una respuesta más extrapolable15,16. Comprender cómo reaccionan los buques en formación a su entorno circundante puede proporcionar información crítica que podría permitir la fabricación de entornos de ingeniería con la capacidad de guiar el desarrollo del buque de una manera predecible. Comprender los fenómenos de formación vascular es especialmente crítico para mantener el ritmo de la rápida aparición de técnicas de fabricación a escala submicrónica a micron, como la estereolitografía, la litografía de proyección digital, la producción continua de interfaces líquidas, la escritura de electroayección de fusión 3D, la escritura de electrorreactor 3D basada en soluciones y las técnicas emergentes de bioimpresión17,18,19,20,21. Alinear el control de estas técnicas de microfabricación con una comprensión más profunda de la biología vascular es clave para la creación de una vasculatura de ingeniería adecuada para un tejido diana.
Aquí, presentamos un sistema 3D para estudiar la respuesta de los nuevos vasos de conformado y brotación a la geometría del andamio circundante, observando su origen de brote y posterior migración22. Mediante la utilización de andamios 3D con geometrías compartimentales teseladas, y una técnica de siembra de dos pasos, tuvimos éxito en crear redes vasculares altamente organizadas de una manera clara y fácil de analizar. Las geometrías teseladas proporcionan un sistema de alto rendimiento con unidades individuales que contienen buques que responden a su entorno local. Utilizando ECs multicolores, rastreamos los orígenes de la formación de brotes y los patrones de migración posteriores, correlacionados con la geometría del compartimiento y la ubicación de los SCs22.
Aunque el protocolo propuesto se ha preparado para analizar los efectos de las señales geométricas sobre el comportamiento de vascularización, este enfoque se puede ampliar y aplicar a una variedad de nuevas aplicaciones. El andamio teselado y las redes fácilmente perceptibles permiten el análisis directo de la interacción de diferentes CE y SCs, la adición de células orgánicas específicas y su interacción con las redes vasculares, el efecto de los fármacos en las redes vasculares y más. Nuestro sistema sugerido resulta muy versátil y de fabricación y procesamiento simple.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Angiotool freeware</td>
			<td>NIH-CCR</td>
			<td></td>
			<td>Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine albumin serum Probumin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>82-045-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental pulp stem cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM media + bullet kit</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>#1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>Gadot-Group</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evicel fibrin sealant</td>
			<td>Johnson&#38;Johnson</td>
			<td>EVB05IL</td>
			<td>Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Cy3 antibody</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>115-166-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488</td>
			<td>Thermo- Fisher Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human adipose microvascular cells</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>#7200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0895-5MG</td>
			<td>Stock concentration: 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Gadot-Group</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lift-off reagent</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td>
			<td>G112850</td>
			<td>Commercial name Omnicoat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-glucose DMEM</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-050-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SMA antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in PBS</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>SC-281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-032-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-vWF antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Silicon Valley Microelectronics (SVM)</td>
			<td></td>
			<td>Wafers 4&#34;, Type N-1-10, 500-550 microns thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050 photoresist</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td>
			<td>Y11058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryton-X 100</td>
			<td>BioLab LTD</td>
			<td>57836</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stepwise cell seeding on tessellated scaffolds to study sprouting blood vessels

El sistema cardiovascular es un jugador clave en la fisiología humana, proporcionando nutrición a la mayoría de los tejidos en el cuerpo; los recipientes están presentes en diversos tamaños, estructuras, fenotipos, y funcionamiento dependiendo de cada tejido perfundido específico. El campo de la ingeniería de tejidos, que tiene como objetivo reparar o reemplazar los tejidos corporales dañados o faltantes, se basa en la angiogénesis controlada para crear una vascularización adecuada dentro de los tejidos diseñados. Sin un sistema vascular, las construcciones de ingeniería gruesas no se pueden nutrir suficientemente, lo que puede resultar en muerte celular, eninjerto deficiente y, en última instancia, fracaso. Por lo tanto, la comprensión y el control del comportamiento de los vasos sanguíneos diseñados es un desafío excepcional en el campo. Este trabajo presenta un sistema de alto rendimiento que permite la creación de redes de buques organizadas y repetibles para estudiar el comportamiento de los buques en un entorno de andamios 3D. Este protocolo de siembra en dos pasos muestra que los recipientes dentro del sistema reaccionan a la topografía del andamio, presentando comportamientos de brotación distintivos dependiendo de la geometría del compartimiento en el que residen los recipientes. Los resultados obtenidos y la comprensión de este sistema de alto rendimiento se pueden aplicar con el fin de informar mejores diseños de construcción de andamios bioimpresos en 3D, en los que la fabricación de varias geometrías 3D no se puede evaluar rápidamente cuando se utiliza la impresión 3D como base para entornos biológicos celularizados. Además, la comprensión de este sistema de alto rendimiento se puede utilizar para la mejora de la investigación rápida de la droga, el desarrollo rápido de los modelos de las co-culturas, y la investigación de estímulos mecánicos en la formación del vaso sanguíneo para profundizar el conocimiento del sistema vascular.

El protocolo presentado, utilizando técnicas de estereolitografía, permite la fabricación de andamios teselados hechos de fotorresistible SU-8. Se obtuvieron andamios con geometrías compartimentales distintas (cuadrados, hexágonos y círculos) y características altamente precisas y repetibles (Figura 1).
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Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

Los tejidos diseñados dependen en gran medida de las redes vasculares adecuadas para proporcionar nutrientes y gases vitales y eliminar los desechos metabólicos. En este trabajo, un protocolo de siembra escalonada de células endoteliales y células de apoyo crea redes vasculares altamente organizadas en una plataforma de alto rendimiento para estudiar el comportamiento de los vasos en desarrollo en un entorno 3D controlado.

Siembra celular escalonada en andamios teselados para estudiar la brotación de los vasos sanguíneos

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...

Nuestro protocolo permite a los investigadores estudiar el proceso de formación de la red de vasos de una manera clara y fácilmente rastreable, abriendo las puertas a nuevos estudios y arrojando luz sobre el comportamiento de los vasos sanguíneos. Esta técnica presenta la posibilidad de crear redes vasculares altamente organizadas y repetibles con respuesta al entorno circundante. Las células endoteliales de pacientes que sufren de una enfermedad vascular se pueden recuperar en el uso de este sistema, lo que permite recrear la enfermedad vascular y encontrar un tratamiento adecuado.El método propuesto se puede ampliar para estudiar el comportamiento de la red vascular cuando se combina con diferentes tipos de células, lo que permite observar la interacción de los vasos en desarrollo con un tipo de tejido específico. Comience sumergiendo los andamios en etanol al 70% durante un mínimo de 15 minutos, luego lávelos dos veces en PBS. Mezclar 1,5 microlitros de solución común de fibronectina con 28,5 microlitros de PBS por andamio a sembrar.Prepare una dilución de fibronectina que se utilizará para todos los andamios para evitar errores de pipeteo. Coloque los andamios escasamente encima de una superficie hidrofóbica y cubra cada andamio con 30 microlitros de la dilución de fibronectina. Reemplace la tapa de la placa y coloque los andamios cubiertos de fibronectina en una incubadora a 37 grados Celsius y 100% de humedad durante un mínimo de una hora.Después de la incubación, enjuague ligeramente los andamios en PBS para eliminar los restos de fibronectina. Los andamios se pueden mantener en PBS a cuatro grados centígrados durante un hasta una semana. Prepare la célula endotelial o el medio de la EC mezclando el medio básico con los componentes correspondientes del kit del medio, incluyendo una solución antibiótico, FBS, y suplementos endoteliales del crecimiento de la célula según lo indicado por el fabricante.Hacer la suspensión de células endoteliales microvasculares adiposas humanas en medio CE con una concentración de cuatro millones de células por mililitro. Usando las medidas de suba, coloque un andamio recubierto de fibronectina por pocillo en una placa de 24 pocillos que no sea TC. Cubra cada andamio con 25 gotas de microlitro de la suspensión de la celda, asegurándose de no dejar que la suspensión fluya lejos del andamio.Coloque la tapa en el plato y colóquele en una incubadora a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y 100% de humedad durante 60 a 90 minutos. Después de la incubación, llene cada pocillo con 700 microlitros de medio EC. Incubar los andamios endotelializados hasta que se pueda observar la confluencia de la CE mediante microscopía fluorescente o durante tres días.Cambie el medio cada dos días. Prepare el medio DPSC mezclando 500 mililitros de DMEM bajo en glucosa, 57,5 mililitros de FBS, 5,75 mililitros de aminoácidos no esenciales, 5,75 mililitros de GlutaMAX y 5,75 mililitros de solución de penicilina-estreptomicina-nistatina. Transfiera los andamios endotelializados a una nueva placa de 24 pozos que no sea TC.Deseche todos los medios de la placa actual utilizando una pipeta o succión al vacío, teniendo cuidado de no aplicar vacío directamente al andamio. Coloque un andamio en el centro de cada pozo, luego seque el área circundante con vacío ligero. Diluya las soluciones de la trombina y del fibrinógeno común con PBS a una concentración final de cinco unidades por mililitro y de 15 miligramos por mililitro respectivamente.Prepare una suspensión de ocho millones de DPSC por mililitro en la dilución de trombina y distribuya 12,5 microlitros de la suspensión en microtubos individuales por andamio a sembrar. Establezca una pipeta de cinco a 50 microlitros en 12.5 microlitros y llénela con una solución de fibrinógeno. Sin quitar la punta, fije la pipeta en 25 microlitros.El material en la punta debe elevarse y dejar un volumen vacío. Presione lentamente el botón del émbolo hasta que el líquido llegue a la abertura de la punta, pero no se filtre. Sostenga el émbolo en esta posición y coloque la punta en uno de los tubos de microcentrífuga que contienen las células en suspensión de trombina, asegurándose de que la punta esté en contacto con el líquido.Suelte suavemente el botón del émbolo y dibuje la suspensión de la celda en la punta. Mezcle a fondo ambos materiales, evitando la formación de burbujas. Dispense rápidamente los materiales mezclados en la parte superior de un andamio endotelializado.Repita los pasos anteriores para cada andamio, asegurándose de cambiar las puntas entre usos para evitar la formación inesperada de gel de fibrina dentro de la punta. Reemplace la tapa de la placa e incube los andamios a 37 grados Centígrados, 5% de dióxido de carbono y 100% de humedad durante 30 minutos. Después de la incubación, llene cada pocillo con un mililitro de DPSC uno a uno y medio EC.Cultura durante una semana, cambiando el medio cada dos días. En diferentes momentos durante el cultivo, retirar el medio del pozo e imagen de las construcciones utilizando un microscopio confocal para estudiar el desarrollo vascular o cualquier otro parámetro de interés. Este protocolo permite la fabricación de andamios teselados hechos de fotorresistible SU-8.Se obtuvieron andamios con geometrías compartimentales distintas y características altamente precisas y repetibles. Con la siembra simultánea tradicional de células endoteliales y células de apoyo, las células se distribuyeron homogéneamente sobre el andamio, lo que resultó en redes vasculares impredecibles y desorganizadas. Por el contrario, la siembra de células escalonadas dio lugar a redes vasculares altamente organizadas.Cuando se utilizan células endoteliales fluorescentes, los vasos se pueden fotograr en tiempo real. La proteína fluorescente roja que expresaba las células endoteliales fue cultivada en andamios hexagonales e imagenizada. Las células de soporte se añadieron al primer día y las redes vasculares se fotogenaron cada dos días para cuantificar el desarrollo de los vasos.Para cada punto de tiempo, se tomaron imágenes amplias de todo el andamio. El crecimiento del buque se cuantificó como la longitud total y el área del buque. Un time-lapse confocal de la proyección de imagen fue realizado para permitir el solo seguimiento del recipiente usando las células endoteliales multicolores.La trayectoria del buque se generó a partir del lapso de tiempo, lo que permite observar la migración del buque. La maduración del recipiente fue observada por la presencia de células de la actinilla y de la ayuda del músculo liso. Para los compartimentos circular, hexagonal y cuadrado, las celdas se multiplican y se organizan en estructuras.Por el día siete, todas las formas mostraron una red vascular rica y compleja. Imágenes de mayor aumento revelaron una presencia más densa de la célula de la actinia y de la ayuda del músculo liso co-localizada con los recipientes formados, evidenciando el reclutamiento y la diferenciación de la célula de la ayuda que rodeaban las estructuras vasculares. Esta técnica se puede utilizar para estudiar el comportamiento de las redes vasculares tridimensionales cuando se expone a diferentes condiciones, como inhibidores celulares específicos o en presencia de tipos de células adicionales.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

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Investigación

Bioingeniería

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Preparación de fibrina Andamios 3D para Aplicaciones madre para cultivo celular

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Gel System Concentric para estudiar el papel de Biofísica de Matrix Microambiente en la migración de células en 3D

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Escritura de Electrospinning de andamios Poly(ε-caprolactone) tridimensional con morfologías controlables para aplicaciones de ingeniería de tejidos del derretimiento

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Ensayo estandarizado y escalable para estudiar la brotación angiogénica 3D perfundida de células endoteliales derivadas de iPSC in Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

Etiquetado de los vasos sanguíneos en el cerebro Teleost y la hipófisis usando perfusión cardíaca con un-fijador DiI

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