Name: stepwise cell seeding on tessellated scaffolds to study sprouting blood vessels
Uploaded: 2021-01-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels at JoVE.com

Bu araştırma Michigan Üniversitesi - İsrail Araştırma Ortaklığı'ndan sağlanan fonla desteklendi. Yazarlar, Uri Merdler, Lior Debbi ve Galia Ben David'e büyük yardımları ve destekleri için, Michigan Üniversitesi Lurie Nanofabrication Tesisi DoktoraSı Nadine Wang, Ph.D. ve Pilar Herrera-Fierro'ya ve fotolithografi tekniklerinin aydınlatıcı tartışmaları için Luis Solorio'ya teşekkür etmek istiyor.

1. Mozaikli iskele imalatı
NOT: Fotolithografi, tipik olarak bir nanofabrikasyon tesisinde/laboratuvarında bulunan özel ekipmanlar gerektiren yaygın bir tekniktir. Bu protokolde ortaya konan yöntem izleyiciler için mümkün olduğunca genelleştirilmiştir; ancak, okuyucunun kullanabileceği ekipmana bağlı olarak prosedürlerde küçük değişiklikler gerekebilir. En yüksek proses kalitesini sağlamak için bu prosedürlerin nanofabrikasyon tesisinde temiz bir odada yapılmasını öne...

<ol>
	<li>Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+is+the+key+challenge+in+tissue+engineering.">Vascularization is the key challenge in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4), 300-311 (2011).</li><li>Landau, S., Guo, S., Levenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Engineered+Vasculature+within+3D+Tissue+Constructs.">Localization of Engineered Vasculature within 3D Tissue Constructs.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 2 (2018).</li><li>Griffith, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+Limits+of+an+in+Vitro+Thick+Prevascularized+Tissue.">Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue.</a> Tissue Engineering. 11 (12), (2005).</li><li>Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+and+therapeutic+aspects+of+angiogenesis.">Basic and therapeutic aspects of angiogenesis.</a> Cell. 146 (6), 873-887 (2011).</li><li>Landau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropoelastin+coated+PLLA-PLGA+scaffolds+promote+vascular+network+formation.">Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation.</a> Biomaterials. 122, 72-82 (2017).</li><li>Lesman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vessel-like+networks+within+multicellular+fibrin-based+constructs.">Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs.</a> Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).</li><li>Richards, D., Jia, J., Yost, M., Markwald, R., Mei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Bioprinting+for+Vascularized+Tissue+Fabrication.">3D Bioprinting for Vascularized Tissue Fabrication.</a> Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 132-147 (2017).</li><li>Levenberg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+skeletal+muscle+tissue.">Engineering vascularized skeletal muscle tissue.</a> Nature Biotechnology. 23 (7), 879-884 (2005).</li><li>Rouwkema, J., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+and+Angiogenesis+in+Tissue+Engineering:+Beyond+Creating+Static+Networks.">Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks.</a> Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+casting+of+patterned+vascular+networks+for+perfusable+engineered+three-dimensional+tissues.">Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues.</a> Nature Materials. 11, (2012).</li><li>Gariboldi, M. I., Butler, R., Best, S. M., Cameron, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vasculature+Architectural+effects+on+microcapillary-like+structure+self-assembly.">Engineering vasculature Architectural effects on microcapillary-like structure self-assembly.</a> PLOS ONE. 14 (1), 1-13 (2019).</li><li>Blache, U., Guerrero, J., G&#252;ven, S., Klar, A. S., Scherberich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+Networks+and+Models,+In+vitro+Formation.">Microvascular Networks and Models, In vitro Formation.</a> Vascularization for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. , 1-40 (2018).</li><li>Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Models+of+Vascular+Functions.">Microfluidic Models of Vascular Functions.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 14 (1), 205-230 (2012).</li><li>Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+actively+stiffen+fibrin+networks+by+generating+contractile+stress.">Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress.</a> Biophysical Journal. 105 (10), 2240-2251 (2013).</li><li>Pollet, A. M. A. O., den Toonder, J. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+the+vasculature+using+Organ-on-Chip+technology.">Recapitulating the vasculature using Organ-on-Chip technology.</a> Bioengineering. 7 (1), (2020).</li><li>Hasan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+techniques+for+development+of+3D+vascularized+tissue.">Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue.</a> Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).</li><li>Jordahl, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Jet+Writing:+Functional+Microtissues+Based+on+Tessellated+Scaffold+Architectures.">3D Jet Writing: Functional Microtissues Based on Tessellated Scaffold Architectures.</a> Advanced Materials. 30 (14), 1707196 (2018).</li><li>Gauvin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+complex+porous+tissue+engineering+scaffolds+using+3D+projection+stereolithography.">Microfabrication of complex porous tissue engineering scaffolds using 3D projection stereolithography.</a> Biomaterials. 33 (15), 3824-3834 (2012).</li><li>Coscoy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtopographies+control+the+development+of+basal+protrusions+in+epithelial+sheets.">Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets.</a> Biointerphases. 13 (4), 041003 (2018).</li><li>Kaplan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+prototyping+fabrication+of+soft+and+oriented+polyester+scaffolds+for+axonal+guidance.">Rapid prototyping fabrication of soft and oriented polyester scaffolds for axonal guidance.</a> Biomaterials. , (2020).</li><li>Steier, A., Mu&#241;iz, A., Neale, D., Lahann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Trends+in+Information-Driven+Engineering+of+Complex+Biological+Systems.">Emerging Trends in Information-Driven Engineering of Complex Biological Systems.</a> Advanced Materials. 31 (26), 11806898 (2019).</li><li>Szklanny, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Scaffold+System+for+Studying+the+Effect+of+Local+Geometry+and+Topology+on+the+Development+and+Orientation+of+Sprouting+Blood+Vessels.">High-Throughput Scaffold System for Studying the Effect of Local Geometry and Topology on the Development and Orientation of Sprouting Blood Vessels.</a> Advanced Functional Materials. , 1901335 (2019).</li><li>Welti, J., Loges, S., Dimmeler, S., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+molecular+discoveries+in+angiogenesis+and+antiangiogenic+therapies+in+cancer.">Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3190-3200 (2013).</li><li>Gui, L., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Tissue+Engineering:+Building+Perfusable+Vasculature+for+Implantation.">Vascular Tissue Engineering: Building Perfusable Vasculature for Implantation.</a> Current Opinion in Chemical Engineering. 3, 68-74 (2014).</li><li>Blache, U., Ehrbar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inspired+by+nature:+Hydrogels+as+versatile+tools+for+vascular+engineering.">Inspired by nature: Hydrogels as versatile tools for vascular engineering.</a> Advances in Wound Care. 7 (7), 232-246 (2018).</li><li>Cochrane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+in+vitro+models+of+vascular+biology:+Human+induced+pluripotent+stem+cells+and+organ-on-chip+technology.">Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).</li><li>Nemani, K. V., Moodie, K. L., Brennick, J. B., Su, A., Gimi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+evaluation+of+SU-8+biocompatibility.">In vitro and in vivo evaluation of SU-8 biocompatibility.</a> Materials Science &amp; Engineering. C, Materials for Biological Applications. 33 (7), 4453-4459 (2013).</li><li>Mathew, R., Ravi Sankar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+on+Surface+Stress-Based+Miniaturized+Piezoresistive+SU-8+Polymeric+Cantilever+Sensors.">A Review on Surface Stress-Based Miniaturized Piezoresistive SU-8 Polymeric Cantilever Sensors.</a> Nano-Micro Letters. 10 (2), 1-41 (2018).</li><li>Knowlton, S., Yenilmez, B., Anand, S., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocrosslinking-based+bioprinting:+Examining+crosslinking+schemes.">Photocrosslinking-based bioprinting: Examining crosslinking schemes.</a> Bioprinting. 5, 10-18 (2017).</li><li>Redd, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+human+microvascular+grafts+enable+rapid+vascularization+and+increase+perfusion+in+infarcted+rat+hearts.">Patterned human microvascular grafts enable rapid vascularization and increase perfusion in infarcted rat hearts.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).</li><li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SU-8+Photoresist.">SU-8 Photoresist.</a> Encyclopedia of Nanotechnology. , 2530-2543 (2012).</li><li>Zheng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-a-Chip+Systems:+Microengineering+to+Biomimic+Living+Systems.">Organ-on-a-Chip Systems: Microengineering to Biomimic Living Systems.</a> Small. 12 (17), 2253-2282 (2016).</li><li>Freiman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+endothelial+and+mesenchymal+stem+cells+enhance+vascular+network+formation+on+three-dimensional+constructs+in+vitro.">Adipose-derived endothelial and mesenchymal stem cells enhance vascular network formation on three-dimensional constructs in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 7 (1), 5 (2016).</li><li>van Duinen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfused+3D+angiogenic+sprouting+in+a+high-throughput+in+vitro+platform.">Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform.</a> Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).</li><li>Nguyen, D. -. H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+model+to+reconstitute+angiogenic+sprouting+morphogenesis+in+vitro.">Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (17), 6712-6717 (2013).</li><li>Nashimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+perfusable+vascular+networks+with+a+three-dimensional+tissue+in+a+microfluidic+device.">Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device.</a> Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).</li><li>Rosenfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+3D+vascular+networks+is+regulated+by+tensile+forces.">Morphogenesis of 3D vascular networks is regulated by tensile forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3215-3220 (2016).</li><li>Neto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+TAZ+regulate+adherens+junction+dynamics+and+endothelial+cell+distribution+during+vascular+development.">and TAZ regulate adherens junction dynamics and endothelial cell distribution during vascular development.</a> bioRxiv. , 174185 (2017).</li></ol>

Mühendislik dokularına gömülü zengin bir vaskülat ihtiyacı, yapı sağkalım ve uygun işlev için kritik öneme sahiptir1. Vasküler sistemin mühendisliği çok miktarda araştırmanın odak noktası olmasına rağmen, araştıracak ve anlayacak çok şey kaldı24. Özellikle, belirli bir dokuyu yeniden canlandırırken, mikrovasküler yapılıp buna göre düzenlenmelidir12. Mikrovessel üretimi için en yaygın yaklaşım, endotel tohumlam...

Doku mühendisliği alanı, eksik veya hasarlı organ ve dokuların yerine mühendislik yapılarının imalatı yolunda hızla ilerlemektadır1. Bununla birlikte, doku beslenmesi için operasyonel vasküler ağlar oluşturmak olağanüstü bir zorluk olmaya devam ettiği için, tamamen işlevsel yapılar henüz elde edilmemiştir. Uygun vaskülarizasyon olmadan, mühendislik dokuları oksijen ve besin maddelerinin pasif difüzyon taşınması ile sınırlıdır ve maksimum uygulanabilir doku kalınlığını difüzyon sınırına, yaklaşık 200 μm2ile sınırlar. Bu kalınlıklar, büyük doku kusurlarını onarmak veya fonksiyonel damar ağının varlığını fonksiyonel ve implante edilebilir dokular için zorunlu bir özellik haline getiren tam organ imalatı için uygun değildir3.
Vasküler sistem, konak doku ile sıkı bir şekilde ilişkili farklı boyutlarda, fenotiplere ve organizasyona sahip çok çeşitli kan damarlarından oluşur. Gelişmekte olan ve filizlenen damarlar tarafından verilen davranış, tepki ve göç kararlarını anlamak, mühendislik dokularına entegrasyonlarını sağlayabilir4. Şu anda, in vitro vasküler ağlar oluşturmak için en yaygın yaklaşım, endotel hücrelerini (VC'ler) üç boyutlu bir mikro ortamda tohumlanmış destek hücreleriyle (SBC'ler, duvar hücrelerine farklılaşma yeteneği ile) birleştirmektir. Bu ortam, hücrelerin damar ağlarına bağlanmasına, çoğalmasına ve kendi kendine bir araya toplanmasına izin vermek için kimyasal ve fiziksel ipuçları sağlar2,5,6,7,8. Birlikte kültürlendiğinde, IC'ler tübüler yapıları oluşturan VC'lere mekanik destek sağlarken hücre dışı matris (ECM) proteinleri salgılarlar. Ayrıca, her iki hücre tipi arasındaki çapraz etkileşim tubulogenez, damar filizlenmesi ve göçü teşvik eder, SCs olgunlaşmasına ve α düz kas aktinin ifade eden (αSMA) duvar hücrelerine farklılaşmasına ek olarak4. Gemi ağı geliştirme en yaygın olarak hidrojeller, gözenekli polimerik iskeleler veya bunların bir kombinasyonu kullanılarak oluşturulan 3D ortamlarda incelenir. İkinci seçenek eşit olarak hücre dostu bir ortam ve hem hücreler hem de ECM9için gerekli mekanik desteği sağlar.
Hidrojeller10,hidrojeller-iskele kombinasyonları 11 , 12,2Dplatformlar ve mikroakışkan cihazlar13üzerindeki hücrelerin birlikte kültleştirilmesi de dahil olmak üzere vasküler gelişimi incelemek için büyük miktarda çalışma yapılmıştır. Bununla birlikte, hidrojeller hücre tarafından uygulanan kuvvetler tarafından kolayca deforme edilebilir14, 2D ve mikroakışkan sistemler daha tahmin edilebilir bir yanıt elde etmek için doğaya daha yakın bir ortamı yenidenoluşturamazken 15,16. Gemilerin çevrelerine nasıl tepki verdiğini anlamak, gemi gelişimini öngörülebilir bir şekilde yönlendirme yeteneğine sahip mühendislik ortamlarının üretilmesine izin verebilecek kritik içgörü sağlayabilir. Vasküler oluşum olgularını anlamak, stereolitografi, dijital projeksiyon litografisi, sürekli sıvı arayüz üretimi, 3D eriyik-elektro jetwriting, çözelti tabanlı 3D elektro jet yazma ve ortaya çıkan biyobaskı teknikleri 17 ,18 , 19,20,21gibi mikronden mikron ölçekli imalat tekniklerinin hızla ortaya çıkmasına ayak uydurmak için özellikle kritik öneme sahiptir. Bu mikro üretim tekniklerinin kontrolünü derinleşmiş bir vasküler biyoloji anlayışıyla hizalamak, hedef doku için uygun bir mühendislik vaskülatının oluşturulmasında anahtardır.
Burada, yeni şekillendirme ve filizlenen gemilerin çevredeki iskele geometrisine tepkisini incelemek, filiz kökenlerini gözlemlemek için bir 3D sistem sunuyoruz ve daha sonra göç22. Mozaik bölme geometrili 3D iskeleler ve iki adımlı bir tohumlama tekniği kullanarak, analiz etmesi kolay ve net bir şekilde son derece organize damar ağları oluşturmayı başardık. Mozaikli geometriler, yerel ortamlarına yanıt veren kaplar içeren tek tek birimlerle yüksek verim sistemi sağlar. Çok renkli EC'leri kullanarak, kompartıman geometrisi ve IC'lerin konumu22ile ilişkili filiz oluşum kökenlerini ve sonraki geçiş modellerini izledik.
Önerilen protokol geometrik ipuçlarının damarlanma davranışı üzerindeki etkilerini analiz etmek için hazırlanmış olsa da, bu yaklaşım genişletilebilir ve çeşitli yeni uygulamalara uygulanabilir. Mozaikli iskele ve kolayca görüntülenebilir ağlar, farklı VC'lerin ve SBC'lerin etkileşiminin basit analizine, belirli organ hücrelerinin eklenmesine ve damar ağlarıyla etkileşimlerine, damar ağları üzerindeki ilaç etkisine ve daha fazlasına izin verir. Önerdiğimiz sistem çok yönlü ve basit imalat ve işleme sonuçları.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Angiotool freeware</td>
			<td>NIH-CCR</td>
			<td></td>
			<td>Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine albumin serum Probumin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>82-045-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental pulp stem cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM media + bullet kit</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>#1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>Gadot-Group</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evicel fibrin sealant</td>
			<td>Johnson&#38;Johnson</td>
			<td>EVB05IL</td>
			<td>Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Cy3 antibody</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>115-166-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488</td>
			<td>Thermo- Fisher Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human adipose microvascular cells</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>#7200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0895-5MG</td>
			<td>Stock concentration: 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Gadot-Group</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lift-off reagent</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td>
			<td>G112850</td>
			<td>Commercial name Omnicoat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-glucose DMEM</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-050-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SMA antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in PBS</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>SC-281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-032-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-vWF antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Silicon Valley Microelectronics (SVM)</td>
			<td></td>
			<td>Wafers 4&#34;, Type N-1-10, 500-550 microns thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050 photoresist</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td>
			<td>Y11058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryton-X 100</td>
			<td>BioLab LTD</td>
			<td>57836</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stepwise cell seeding on tessellated scaffolds to study sprouting blood vessels

Kardiyovasküler sistem, insan fizyolojisinde önemli bir oyuncudur ve vücuttaki çoğu dokuya beslenme sağlar; damarlar, her bir perfüzyonlu dokuya bağlı olarak farklı boyutlarda, yapılarda, fenotiplerde ve performansta bulunur. Hasarlı veya eksik vücut dokularını onarmayı veya değiştirmeyi amaçlayan doku mühendisliği alanı, mühendislik dokularında uygun bir damarlanma oluşturmak için kontrollü anjiogeneze dayanır. Vasküler bir sistem olmadan, kalın mühendislik yapıları yeterince beslenemez, bu da hücre ölümü, zayıf engraftment ve nihayetinde başarısızlıkla sonuçlanabilir. Bu nedenle, mühendislik kan damarlarının davranışını anlamak ve kontrol etmek sahada olağanüstü bir zorluktur. Bu çalışma, 3D iskele ortamında gemi davranışını incelemek için organize ve tekrarlanabilir gemi ağlarının oluşturulmasına izin veren yüksek verimli bir sistem sunar. Bu iki adımlı tohumlama protokolü, sistem içindeki damarların iskele topografyasına tepki verdiğini ve damarların bulunduğu bölme geometrisine bağlı olarak ayırt edici filizlenen davranışlar sunduğunu göstermektedir. Bu yüksek verim sisteminden elde edilen sonuçlar ve anlayış, hücreselleştirilmiş biyolojik ortamların temeli olarak 3D baskı kullanırken çeşitli 3D geometrilerin imalatının hızla değerlendirilemediği daha iyi 3D biyobaskı iskele yapı tasarımlarını bilgilendirmek için uygulanabilir. Ayrıca, bu yüksek verim sisteminden gelen anlayış, hızlı ilaç taramasının iyileştirilmesi, ortak kültür modellerinin hızlı gelişimi ve damar sistemi bilgisini derinleştirmek için kan damarı oluşumu üzerindeki mekanik uyaranların araştırılması için kullanılabilir.

Sunulan protokol, stereolitografi teknikleri kullanılarak, SU-8 fotoresistlerinden yapılmış mozaikli iskelelerin imal edilmesine izin verir. Farklı bölme geometrilerine (kareler, altıgenler ve daireler) sahip iskeleler ve son derece doğru ve tekrarlanabilir özellikler elde edilmiştir (Şekil 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61995/61995fig01.jpg"> <strong cl...

Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels at JoVE.com

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

Mühendislik dokuları, hayati besinleri ve gazları sağlamak ve metabolik atıkları gidermek için uygun vasküler ağlara büyük ölçüde güvenir. Bu çalışmada, endotel hücrelerinin ve destek hücrelerinin adım adım tohumlama protokolü, kontrollü bir 3D ortamda gelişen damar davranışını incelemek için yüksek verimli bir platformda son derece organize damar ağları oluşturur.

Filizlenen Kan Damarlarını İncelemek için Mozaikli İskelelerde Stepwise Hücre Tohumlama

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...

Protokolümüz, araştırmacıların damar ağı oluşum sürecini açık ve kolay izlenebilir bir şekilde incelemelerini, yeni çalışmalara kapıları açmalarını ve kan damarı davranışlarına ışık açmalarını sağlar. Bu teknik, çevredeki çevreye yanıt veren son derece organize ve tekrarlanabilir vasküler ağlar oluşturma imkanı sunar. Vasküler bir hastalıktan muzdarip hastalardan endotel hücreleri bu sistem kullanılarak alınabilir, bu da vasküler hastalığın yeniden oluşturulmasını ve uygun bir tedavinin bulunmasını mümkün hale getirir.Önerilen yöntem, farklı hücre tipleriyle eşleştirildiğinde vasküler ağ davranışını incelemek için genişletilebilir ve gelişmekte olan damarların belirli bir doku tipi ile etkileşimini gözlemlemeye izin verir. İskeleleri en az 15 dakika boyunca% 70 etanol içine batırarak başlayın, ardından PBS'de iki kez yıkayın. Tohumlanacak iskele başına 28,5 mikrolitre PBS ile 1,5 mikrolitre fibronektin stok çözeltisini karıştırın.Pipetleme hatalarını önlemek için tüm iskeleler için kullanılacak bir fibronektin seyreltme hazırlayın. İskeleleri seyrek bir hidrofobik yüzeyin üzerine yerleştirin ve her iskeleyi 30 mikrolitre fibronektin seyreltme ile örtün. Plakanın kapağını değiştirin ve fibronektin kaplı iskeleleri en az bir saat boyunca 37 santigrat dereceye ve% 100 neme ayarlanmış bir inkübatöre koyun.İnkübasyondan sonra, fibronektin kalıntılarını çıkarmak için PBS'deki iskeleleri hafifçe durulayın. İskeleler PBS'de bir haftaya kadar dört santigrat derecede tutulabilir. Bazal ortamı, üretici tarafından belirtildiği gibi bir antibiyotik çözeltisi, FBS ve endotel hücre büyüme takviyeleri de dahil olmak üzere ilgili ortam kiti bileşenleriyle karıştırarak endotel hücre veya EC ortamı hazırlayın.mililitre başına dört milyon hücre konsantrasyonu ile EC ortamında insan yağsız mikrovasküler endotel hücre süspansiyonu yapın. Tokmalar kullanarak, TC olmayan 24 kuyu plakasına kuyu başına bir fibronektin kaplı iskele yerleştirin. Her iskeleyi hücre süspansiyonunun 25 mikroliter damlacıklarıyla kapla ve süspansiyonun iskeleden akmasına izin vermeyin.Kapağı tabağa koyun ve 60 ila 90 dakika boyunca 37 santigrat derece, % 5 karbondioksit ve% 100 nemde bir inkübatöre yerleştirin. Kuluçkadan sonra, her kuyuyu 700 mikrolitre EC ortamı ile doldurun. Endotelize edilmiş iskeleleri, floresan mikroskopi kullanılarak veya üç gün boyunca EC izdihamı gözleninceye kadar kuluçkaya yatırın.Ortamı iki günde bir değiştirin. 500 mililitre düşük glikoz DMEM, 57,5 mililitre FBS, 5,75 mililitre esansiyel olmayan amino asit, 5,75 mililitre GlutaMAX ve 5,75 mililitre penisilin-streptomisinin-nystatin çözeltisini karıştırarak DPSC ortamını hazırlayın. Endotelize edilmiş iskeleleri TC olmayan yeni bir 24 kuyu plakasına aktarın.Vakumu doğrudan iskeleye uygulamamaya dikkat ederek, bir pipet veya vakum emme kullanarak mevcut plakadaki tüm ortamları atın. Her kuyunun ortasına bir iskele yerleştirin, ardından çevreyi hafif vakumla kurulayın. Trombin ve fibrinojen stok çözeltilerini PBS ile mililitre başına beş birim ve mililitre başına 15 miligramlık son konsantrasyona seyreltin.Trombin seyreltmede mililitre süspansiyon başına sekiz milyon DPSC hazırlayın ve süspansiyonun 12,5 mikrolitresini tohumlanacak iskele başına ayrı mikrotüplere dağıtın. 12,5 mikrolitreye beş ila 50 mikrolitre pipet ayarlayın ve fibrinojen çözelti ile doldurun. Ucu çıkarmadan pipet 25 mikrolitreye ayarlayın.Uçtaki malzeme yükselmeli ve boş bir hacim bırakmalıdır. Sıvı uç açıklığı gelene kadar piston düğmesine yavaşça basın, ancak dışarı sızmaz. Pistonu bu pozisyonda tutun ve ucu trombin süspansiyonundaki hücreleri içeren mikrosantrifüj tüplerinden birine yerleştirin ve ucun sıvıyla temas halinde olduğundan emin olun.Piston düğmesini yavaşça bırakın ve hücre süspansiyonunu ucuna çekin. Kabarcık oluşumunu önleyerek her iki malzemeyi de iyice karıştırın. Karışık malzemeleri endotelize edilmiş bir iskelenin üzerine hızla dağıtın.Her iskele için önceki adımları tekrarlayın, uç içinde beklenmeyen fibrin jeli oluşumunu önlemek için kullanımlar arasında ipuçlarını değiştirdiğinden emin olun. Plaka kapağını değiştirin ve iskeleleri 37 santigrat derecede, % 5 karbondioksit ve% 100 nemde 30 dakika boyunca kuluçkaya bırakın. Kuluçkadan sonra, her kuyuyu bir mililitre bire bir DPSC ve EC ortamı ile doldurun.Bir hafta boyunca kültür, her gün ortamı değiştirmek. Kültür sırasında farklı zaman noktalarında, ortamı kuyudan çıkarın ve vasküler gelişimi veya ilgi çekici başka bir parametreyi incelemek için konfokal mikroskop kullanarak yapıları görüntüleyin. Bu protokol, SU-8 fotoresistlerinden yapılmış mozaikli iskelelerin imal edilmesine izin verir.Farklı bölme geometrilerine ve son derece doğru ve tekrarlanabilir özelliklere sahip iskeleler elde edilmiştir. Hem endotel hücrelerinin hem de destek hücrelerinin geleneksel eşzamanlı tohumlanmasıyla, hücreler iskelenin üzerine homojen bir şekilde dağıtıldı ve bu da öngörülemeyen ve düzensiz damar ağlarıyla sonuçlandı. Aksine, adım adım hücre tohumlama oldukça organize vasküler ağlara neden oldu.Floresan endotel hücreleri kullanırken, damarlar gerçek zamanlı olarak görüntülenebilir. Endotel hücrelerini ifade eden kırmızı floresan protein altıgen iskelelerde kültürlendi ve görüntülendi. Destek hücreleri ilk gün eklendi ve damar ağları damar gelişimini ölçmek için her gün görüntülendi.Her zaman noktası için, tüm iskelenin geniş görüntüleri çekildi. Gemi büyümesi toplam damar uzunluğu ve alanı olarak ölçüldü. Çok renkli endotel hücreleri kullanılarak tek damar takibine olanak sağlamak için konfokal görüntüleme zaman atlamalı olarak gerçekleştirildi.Gemi yolu zaman atlamalı olarak oluşturuldu, bu da gemi göçini gözlemlemeyi mümkün hale getirdi. Damar olgunlaşması düz kas aktüensi ve destek hücrelerinin varlığı ile gözlendi. Dairesel, altıgen ve kare bölmeler için hücreler çoğalır ve yapılara dönüşür.Yedinci güne gelindiğinde, tüm şekiller zengin ve karmaşık bir damar ağı gösterdi. Daha yüksek büyütme görüntüleri, daha yoğun bir düz kas aktisin ve oluşan damarlarla birlikte lokalize hücre varlığını desteklediğini, destek hücresi alımını ve damar yapılarını çevreleyen farklılaşmayı ortaya çıkardı. Bu teknik, belirli hücre inhibitörleri gibi farklı durumlara maruz kaldığında veya ek hücre tiplerinin varlığında üç boyutlu vasküler ağların davranışını incelemek için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Devirli Basınç Biyoreaktör Tasarım Ex vivo</emAort Kalp Vanalar> Eğitim

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

3D Fibrin hazırlanması Kök Hücre Kültürü Uygulamaları için iskeleleri

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

3-Boyutlu Hücre Kültürü için Self-raporlama iskeleleri

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Yöntem kan-beyin bariyerini bir insan hücre tabanlı bir İletişim Modelinin Hazırlanması için Geliştirilmiş

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Lipid Nanotüpler Kan Pıhtılaşma Faktör VIII Sarmal Organizasyonu

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

Konsantrik Jel Sistemi 3D Hücre Göç Matrix mikroçevresinin biyofiziksel Rolü Eğitim için

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds &#8212; Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

Şeffaf olmayan iskelelerinin üzerinde Görüntüleme Hücre Canlılık - Roman Örme Titanyum İmplant Örnek Kullanımı

Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Üç boyutlu Poly(ε-caprolactone) İskele kontrol edilebilir türleri morfoloji ile Electrospinning yazma doku mühendisliği uygulamaları için erime

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

IPSC türetilmiş Endotel Hücrelerinin Perfüzyonlu 3D Anjiyojenik Filizlenmesini İn Vitro Olarak İncelemek Için Standart ve Ölçeklenebilir Tsay

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

Teleost beyin ve hipofiz kan damarlarının bir dıı-fixative ile kardiyak perfüzyon kullanarak etiketleme

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...