Name: cone-enriched cultures from the retina of chicken embryos to study rod to cone cellular interactions
Uploaded: 2021-03-20T14:15:00
Duration: 8 min 4 s
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作者感谢雅克·贝拉卢、洛雷雷·富尼尔、埃马努埃尔·克莱林、弗雷德里克·布隆德和农用 产品 有限公司（法国莫里索·丹斯）的宝贵帮助。这项工作得到了因塞尔姆、索邦大学、 法国国家再培训局 （ANR，Labex生命传感器）、抗击失明基金会（美国）和IHU FORESight[ANR-18-IAHU-0001]的支持，这些资金由法国国家重建局在 阿韦尼尔投资 计划内管理。

该议定书得到了皮埃尔大学和玛丽居里大学动物实验伦理委员会和法国研究部（许可证编号：APAFIS#1028 2015070211275177）的批准。动物实验是在以下授权下进行的："A-75-1863年自动化证书"。巴黎警察局（2011年11月9日至2016年11月8日）。
1. 受精卵的孵化
<ol><li>收集每周受精卵（菌株I 657，红色标签），自然获得，在工业孵化场。</li>
	<li>受精卵被母鸡"产卵"后，将受精卵保持在17°C（其生物零度）。</li>
	<li>对于每种培养物，在20°C下孵育7个受精卵24小时，然后在37°C时136小时，在潮湿的腔室中间歇性地恢复卵位（从一侧到对面的渐进运动2小时，4小时周期）。</li>
</ol>2. 鸡胚胎的恢复
<ol><li>用消毒剂（例如，附着A快车）清洗七个鸡蛋的表面。</li>
	<li>要打破蛋壳，在壳的顶部用大直钳打个洞。然后切开壳，把帽子从鸡蛋上取下，作为软煮鸡蛋。</li>
	<li>用弯曲的钳子轻轻地从蛋壳中提取每个胚胎，然后将其转移到含有无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的培养皿中，该盐水以前加热到 37 °C。 轻轻地，取出环绕胚胎的信封（胆汁或胆囊膜）。</li>
	<li>通过与汉堡和汉密尔顿42的视觉比较，验证每个胚胎的发育阶段。</li>
	<li>在第29个 发育阶段选择两个胚胎（图1）。翅膀在肘部弯曲。衣领明显突出。该法案比第28阶段 更为突出。</li>
	<li>激发这些选定胚胎的眼睛，并以二氧化碳独立介质（生命技术）转移它们。 注意：胚胎处于第29阶段，而不是第28或30阶段（图1）：这就是为什么有必要孵育至少7个鸡蛋，即使只有两个将最终使用。胆汁很薄，很难区分，但它与胚胎非常接近，所以它必须去除而不接触胚胎。</li>
</ol>3. 视网膜解剖
<ol><li>用弯曲的钳子斩首并诱导选定的胚胎。</li>
	<li>将四只眼睛转移到 CO2独立介质中。此介质包含 0.9 m 卡Cl2 和 0.65 mM 毫克2。</li>
	<li>将眼睛与角膜朝下定位，视神经面向实验者。用两个直钳在视神经上钻一个洞。</li>
	<li>在网状膜和色素上皮之间插入每个钳子的分支（图2）。拉上每个钳子，旋转眼睛，从视网膜分离上皮。取出角膜，然后是镜片和静脉。</li>
	<li>在含有林格介质的培养皿中以 pH 7.2 传输四个视网膜。 注意：确保只有视网膜保留并去除任何微量的视网膜和残留的视网膜色素上皮。</li>
</ol>4. 准备视网膜细胞悬架
<ol><li>使用两个直钳将四个视网膜切成非常小的碎片。</li>
	<li>用林格的介质清洗视网膜两次。</li>
	<li>使用林格介质进行第二次洗涤后，让小灵汀娜碎片落在管子底部，并取出林格的介质。在 37 °C 下用 trypsin 溶液（0.25% w/v）治疗视网膜片件 20 分钟。</li>
	<li>通过连续吸力在 10 分钟后分散溶液。使用巴斯德移液器放电，并检查视网膜碎片的分离情况。停止反应，添加文化介质补充10%灭活胎儿小牛血清。</li>
	<li>在加入 DNase 后，立即使用巴斯德移液器连续吸附和放电，用 0.05 毫克 DNase I. 分离细胞簇和 DNA，从而孵育细胞悬浮。</li>
	<li>用化学定义培养介质 （CDCM） 清洗视网膜细胞悬架两次：Dulbecco 的改良鹰介质和 M199 介质的体积相等，并辅以 100 μg/mL 亚油酸/BSA， 0.86 μM 胰岛素， 0.07 μM 转移林， 2.0 μM 黄体酮， 0.28 μM 前列腺素， 0.29 μM Na2SeO3， 182 μM 普特雷斯辛， 3 m 牛磺酸， 4.7 μM 西蒂丁 5+二磷胆素， 2.7 μM 青霉素 5+二磷乙醇胺， 0.55 μM 氢皮质松， 0.03 μM 三磷霉素， 1 mM 丙酮钠和 20 μM 根塔霉素.</li>
</ol>5. 视网膜细胞播种
<ol><li>在37°C时，用透明底处理两个黑色96井培养板2小时，多L-lysine在32.25微克/厘米2。</li>
	<li>用 M199 文化介质冲洗这些板两次。将细胞颗粒在 1 mL 的 CDCM 中恢复。</li>
	<li>添加到细胞悬架的 10μL 的别名中，尝试泛蓝色来染色活细胞。将细胞悬浮标本添加到血细胞计（马拉塞兹细胞计数室）中。<ol>
<li>在显微镜下，数一数血细胞仪四行（即40平方）的染色细胞，然后计算一行的平均细胞数。应用以下方法计算悬浮细胞的浓度：悬浮的细胞/mL 数 = 连续（10 平方）x 10 的细胞平均数，血细胞仪 x 稀释的正方形数与 trypan blue x 1，000（以细胞/mL 表示结果）。</li>
	</ol>
</li>
	<li>使用 CDCM 将细胞悬浮到两个浓度（5.6 x 104细胞/mL 和 1.12 x10 5细胞/mL），对应于两个电镀密度（1 x 105细胞/厘米2和 2 x10 5细胞/cm2）。</li>
	<li>种子 50 μL 的两个细胞悬架到两个预处理的黑色 96 井培养板。用多通道移液器从板的右侧向左分配板中的细胞，使每个柱子之间均匀，使细胞的分布是均匀的。</li>
	<li>添加分子库的 50 μL（例如，cDNA 库中的条件介质，见下文），使用预先定义的模式（表 1）进行筛选。</li>
	<li>在 5% CO 2 下的 37°C 下孵化板7 天，无需更换介质。</li>
</ol>6. 计算可行细胞
<ol><li>在板的每口井中，加入2.7微米钙素AM和0.3毫米同源性乙酸钠。 注：钙素穿透大分子不可渗透的细胞，作为同质体。在活细胞的细胞质中，钙化物被内源性酯酶水解，在485纳米兴奋时以520纳米的速度发光，成为荧光。同源体与死细胞上的DNA结合。DNA-同源体结合导致红色荧光在520纳米激发后以635纳米发出。</li>
	<li>在没有光线的情况下，在室温下将盘子孵化1小时。</li>
	<li>阅读自动板读取器上的荧光，该读数由装有汞灯的倒置显微镜组成，该显微镜配有两个 485 和 520 nm 的激发滤光片、520 和 635 nm 的两个排放过滤器、一个目标 （x10）、一个由处理器控制的电动舞台和一个充电耦合设备摄像头 （CCD）。此计数平台由变形软件19 控制。它使在96井板的每个井中同时获得活细胞和死细胞的荧光图像成为可能，从井A1到A12井，然后B12向B1，C1对C12等（表一）。</li>
	<li>使用负控件的 18 口井计算单个单元的平均面积 A （表 I）。</li>
	<li>数一数板中每个井中的细胞，并应用以下经验公式 A x 29/ 20.7 以防止细胞双倍（两个细胞的分组）被计算在内。按分子对圆锥体的保护作用进行评分，作为我们测试分子的 4 口井中平均细胞数与负控制 18 口井中平均细胞数之间的比率（参见表1和补充图 1）。</li>
	<li>将 1 x 105 细胞/cm2 播种的板的结果与 2 x 105 细胞/cm2 播种的板的结果相结合，以评估每个分子筛选的潜在保护（生存率）。</li>
</ol>

TL、J-AS 和 VF 拥有使用 EdCVF 治疗视网膜退化的专利 [WO2009071659 （A1）。2007年6月12日]。

在可能限制鸡胚胎产生圆锥体浓缩培养物的许多参数中，第一个关键步骤是准确识别孵化卵子中胚胎的发育阶段。观察到，ED8（第34阶段）胚胎视网膜细胞培养只产生35%的光感受器，其余65%由其他神经元4组成。无论后勤工作如何获得孵化的卵子，都有必要微调温度和孵化时间，并仔细检查胚胎，与发育的所有阶段的参考图片42，45相比。
最初，圆锥体丰富的文化系统是利用白腿角菌株4开发的。这种菌株的白色在法国不是特别受欢迎，所以我们用一种生产棕色鸡蛋的鸡。我们利用了I 657菌株，这是通过交叉I 66公鸡与JA57母鸡5。我们能够再现原始文化的特点。这表明，鸡的遗传背景对于获得圆锥体丰富的文化并不重要。
我们没有测试在培养介质中单独去除补充剂的效果，但观察到胰岛素根据胰岛素对rd1小鼠锥体生存的影响起着至关重要的作用，这是自动体隐性RP46的模型。三叶草（T3）也可以参与区分视网膜前体细胞的鸡胚胎成锥体根据甲状腺激素受体的作用在视网膜细胞的命运在发展40。因此，圆锥体丰富的培养系统不能用来识别胰岛素表达克隆46。
圆锥体丰富的培养系统依赖于原发神经元的培养，并且依靠使用不朽的细胞作为细胞系661W24、25、26的方法更为合适。
此处描述的方法可以通过使用质粒DNA20进行事先电波化来修改。在准备视网膜细胞悬架之前，整个视网膜被放置在定制电管的腔室中，在 10 mM Tris-HCl pH 8.0、1 mM EDTA 中，具有 120 μL 的 0.5μg/μL 质粒DNA。5个脉冲的15 V为50毫秒，每个应用由950毫秒间隔22分开。试图提供干扰RNA（RNAi）使用复制主管的鸟类拼接（RCAS）逆转录病毒到圆锥体丰富的文化没有成功47。这当然是由于在没有血清和低密度培养物的情况下，视网膜前体细胞不具有复制性，这是传播逆转录病毒的必要条件。
我们开发了圆锥体丰富的培养系统，通过表达克隆19来识别促进圆锥体生存的营养因子。为了使其可行，我们使用来自100个克隆池的有条件介质进行了高含量筛查的第一步。即使库中的 cDNA 在 COS-1 细胞传输后在强大的 CMV 促进剂的控制下表示，它也不提供保证，即由单个 cDNA 编码的所有蛋白质都达到足以通过可行性检测获得阳性的浓度。这是一个主要的限制。从这个意义上说，任何筛选并不是真正详尽无遗的。此外，即使膜蛋白没有从条件介质中去除，检测的配置也不利于非扩散因子的识别。另一种选择是在获得 cDNAs 序列后筛选单个克隆，以避免重复使用多次相同的候选蛋白质。这是通过测序我们使用的43个视网膜cDNA库而启动的。这种方法虽然合理，但也有其局限性。对cDNA序列的生物信息分析将不可抗拒地强加于，除了减少冗余之外，还优先考虑根据知识筛选某些克隆。如果最终对整个图书馆进行筛选，即使需要的时间大大延长，这也不会有害。但总是，序列的身份将影响我们看待结果的方式。这不会是中性的，因为序列的解释自然会与实验数据竞争。
EdCVF 的鉴定还表明，高含量筛查会带来技术限制。从第一轮筛选中，我们确定了两个活动量大的池（补充图1）。池 0073 导致成功识别 EdCVF，而池 0080 没有进行此类发现。我们尚未解决在准备子池过程中失去活性克隆可能造成的问题。或者，不排除，即使统计学上不有利，在0080池的cDNAs中，有两种蛋白质协同作用，其活性不能作为单个克隆来观察。
通过筛选小分子来识别保护圆锥体的分子是圆锥体丰富培养系统的未来应用。这种分子对于治疗视网膜病理学是无价的，基因治疗不是与年龄相关的黄斑变性最合适的方法。

脊椎动物物种的视网膜是双的，具有用于昏暗光视觉的杆光感受器和用于日光、颜色和敏锐度视觉的锥光感光器。灵长类视觉敏锐度依赖于视网膜中心的一个区域，称为卵泡，富含圆锥体，但总体而言，圆锥体仅占所有光感受器的 5%。因此，对灵长类小灵长类动物的圆锥体，特别是圆锥体培养的分析在技术上是困难的。所有其他哺乳动物物种都没有卵泡，在视网膜研究中最常用的啮齿动物中，圆锥体的百分比很低。鸟类的情况并非如此，锥体主宰着这些观赏鸟类的视网膜。恐龙在哺乳动物进化过程中首次出现时一直主宰着生态系统，它们处于鸟类的植物起源。由于恐龙和早期哺乳动物之间的这种竞争，哺乳动物大多是夜间的，视网膜以棒子为主。直到后来在进化过程中，灵长类动物所属的一些哺乳动物物种的日间视觉才成为进化优势。然而，祖先时期仍然是哺乳动物视觉2、3进化过程中夜间瓶颈的一个时期。
在研究视网膜细胞分化时，Adler和Hatlee显示，在胚胎日（ED）6或第29阶段4期从鸡中衍生的培养物中，光感受器占视网膜分化细胞的大约70%。由于鸡视网膜中锥体的流行，ED6鸡胚胎的视网膜细胞培养已发展为圆锥体富集培养物5。
锥体介质视觉敏锐性对人类的重要性是一种真理。受改变锥体功能的遗传或衰老疾病影响的人严重残疾。这促进了大量关于遗传性视网膜退化的研究，目的是找到治疗这些致盲疾病6，7。第一个成功，获得使用重组腺相关载体（AAV）治疗严重形式的 IRD 勒伯先天性动脉瘤 （LCA）， 是基因治疗8的概念证明.基因突变触发 IRD 的基因的识别为使用基因疗法治愈这些疾病开辟了可能性。然而，这些疾病是由于200多个不同基因的突变造成的。即使在自体隐性形式的 IRD 中，当病态基因的正常拷贝重新引入时，可恢复视觉功能，每个个体发育的经济成本也有利于最普遍的开发，从而损害较不常见的基因和遗传起源仍然未知的因素。这一事实促使研究人员考虑了更普遍的治疗方法。凋亡细胞死亡似乎是一种常见的途径，是这些疾病的治疗目标，这些疾病是通过光感受器的退化而发展而发展的，包括对自体主导形式10、11。然而，这种办法的成功是缺失的。对于最常见的 IRD 形式，视网膜炎色素瘤 （RP）， 常见的途径是功能的继发性丧失， 最终导致锥体 12，13的退化.防止锥体功能丧失将保持胎儿的中心视力独立于致病突变14。
在RP的早期阶段，棒的丢失触发了由核素状1（NXNL1）基因编码的棒源性锥活性因子（RdCVF）的表达减少，该基因中断了棒和圆锥体之间代谢和重氧化物信号。重组AAV编码NXNL1基因的两种产品，营养因子RdCVF和硫胺酮酶RdCVFL的管理，理论上可以防止锥体视力丧失的所有遗传形式的RP16。我们已经表明，NXNL1基因产品RdCVFL，表现在鸡锥丰富的培养物17，在那里它起到保护作用18。RdCVF和NXNL1基因是通过高含量的视网膜cDNA库的筛选来识别的，该库利用圆锥体丰富培养物中的细胞的存活率作为读数19。我们使用每个克隆的 8 个平行测试筛选了相当于 210，000 个库的单个克隆。这代表了大量的测试，需要容易获得生物材料，鸡胚胎的视网膜。我们发现，每周获得胚胎鸡蛋相对容易，因为它们是为产蛋母鸡和产肉鸡的农业工业广泛生产的。经过锥体浓缩培养物的仔细标准化后，该系统提供了一种简单、坚固和可重复的方式来测试数千个分子，以增强其保持圆锥体生存能力的能力。这些细胞也有利于基因操纵20，有利于信号转导的研究和生化分析21，22，23。
视网膜研究人员已经开发出替代方法，如使用锥形细胞系661W24，25，26。然而，这个细胞系的身份仍然有争议的27，28。661W细胞是从转基因小鼠线的视网膜肿瘤中克隆的，该肿瘤表达了在人类间感器视网膜蛋白结合蛋白促进剂控制下的SV40大T抗原。SV40大T抗原介导细胞转化和永生。因此，使用 661W 细胞识别的信号通路必须报告到转化和不朽的细胞系的上下文中，该线在许多方面与原位圆锥体不同。在这方面，圆锥体丰富的培养系统由原发神经元组成，这些神经元在生理上更为相关。
虽然使用小鼠视网膜的振动剖析获得纯光感受器文化是可能的，但啮齿动物外视网膜中锥体的极低百分比使得这种方法不适合产生富含圆锥体的文化29。猪网膜不含叶，但有一个区域称为区域中央，是非常丰富的圆锥体30。视网膜二极啮齿动物中圆锥体的比例很高，如阿尔维坎蒂·安索盖和普萨莫米斯·痴迷者31，32，提供了一个可能的解决方案，但需要繁殖这种外来物种。从当地屠宰场收集的成年猪眼，可用于生产用于研究光感受器生存33的棒和圆锥体的混合培养。一个优雅的解决方案是预先净化圆锥体从猪视网膜使用平移与花生凝胶素（PNA）lectin，选择性地结合锥体34。然而，由于其复杂性，这种方法很难大规模地实施。
人类诱导的多能干细胞（iPS）提供了最有希望的方法，以获得锥形光感受细胞群，可用于视网膜移植，但也可适应圆锥体丰富的培养35，36。由于转录因子 NRL 是棒光感受器37所必需的，Nrl-/-鼠标具有由短波锥 （S-圆锥体） 主导的视网膜。这种灭活可以用来通过区分人类与iPS38、39来产生S-圆锥体丰富的制备。另一种可能的方法是促进锥分化使用甲状腺激素信号40。虽然从人类iPS产生圆锥体浓缩培养物的新方法正在出现，但鸡胚胎提供了一种目前已证实的方法19。
圆锥体丰富的文化有助于通过表达克隆19识别RdCVF。该系统还成功地用于证明RdCVF通过有氧糖解22刺激葡萄糖吸收及其新陈代谢。此外，圆锥体丰富的培养被用来验证RdCVFL的保护作用，RdCVFL是 NXNL1 基因23的第二个产物。最近，该系统被用来证明存在保护分子分泌的视网膜色素上皮细胞与OTX241转换。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 black plates (Clear Button with lid Tissue culture treated)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>C1430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>CoolSnap&#160; FX HQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDPC (Cytidine 5&#8242;-diphosphocholine sodium salt dihydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Independant</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>18045-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>005093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Media</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eggs incubator</td>
			<td>FarmLine</td>
			<td>M08 01 3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Homodimer</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>E1169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F&#339;tal bovine serum</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>10270-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>15710-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS (insulin Transferine selenium)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>large straight pliers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>005074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 medium</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>31150-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph software</td>
			<td>Metamorph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>Eclipse TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>Martzauzer</td>
			<td>Mutlicontrol 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical filter switch</td>
			<td>Shutter Instrument company</td>
			<td>Lambda 10-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>14190-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pursept A express</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11814110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putriscine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight forceps</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>005092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine 0.25 %</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cone-enriched cultures from the retina of chicken embryos to study rod to cone cellular interactions

人类白天的视觉依赖于视网膜中心锥形光感受器的功能。患者患有最普遍的遗传性视网膜退化，视网膜炎色素，失去夜视，由于突变驱动的杆光感受器的损失，一个现象，随后逐渐丧失功能和锥体死亡导致失明。遗传学家已经识别出许多基因与突变导致这种疾病，但第一个突变发现质疑的继发性锥体退化的机制，以及如何在罗多普辛基因编码的显性突变的视觉色素完全表达在棒可以触发锥体退化。
这种移植的结果在疾病的基因模型导致细胞相互作用的棒和圆锥体的概念，以及非细胞自主变性锥体在所有遗传形式的视网膜炎色素。
圆锥体占人类所有光感受者的5%，在小鼠中只占3%，因此它们在这些物种中的研究是困难的，但圆锥体的数量超过了鸟类中的棒。我们已经将96个井板调整为鸡胚胎发育阶段29的视网膜前体培养。在这些初级培养物中，圆锥体在体外分化后占细胞的80%。在没有血清的情况下，细胞在一周内退化。在这里，我们描述的方法及其标准化。
这种圆锥体丰富的培养系统用于通过对大鼠视网膜色素上皮上皮规范化cDNA库的高含量筛选来识别上皮源性锥体生存因子（EdCVF）。重组的EdCVF可防止圆锥体的退化。

我们在这里描述如何利用圆锥体丰富的培养系统来识别保护蛋白质的新圆锥体。我们使用这个协议来筛选一个规范化的cDNA库，由胆汁和视网膜色素上皮从400眼睛8周大的长埃文斯大鼠43。
该库包含 6.0 x 106 个独立结肠形成单元 （CFUs），平均克隆插入大小为 2.1 千基 （kb），超过 99% 的重组克隆。该库的100个克隆池被短暂地传输到COS-1细胞中（0.1微克质粒DNA），在没有血清的DMEM中孵育48小时后收获COS-1的条件介质（CM）。膜或外体不会通过超集中式去除。每个CM的50微升被添加到两个96井板的4口井：一个种子在2×105 细胞/厘米2，另一个在4×105 细胞/厘米2。来自COS-1细胞的CM与用于构建库的空矢量pcDNA3.1发生变异，用作负控（表1）。在四口培养井和两个富含圆锥体的养殖条件下，共评估了2 112套100个克隆，相当于211 200个个体克隆。这两种情况对应于两个略有不同的接种密度，因此可以更准确地评估总共1，689，600口养殖井的保护活动。
在42个比例大于2的克隆池中，池0080和0073的存活率在7天培养后比负控制高16倍和14倍，pcDNA3.1（补充图1）。这种分析对于确定兴趣池至关重要。每个选定的100个克隆池被细分为16组10个克隆从他们的甘油库存。在第二轮筛选中，这些子池按照同一方法（即总共3 200口养殖井）进行了准备和测试。子池 0073-09 给出了最强的生存率 （补充图 2A），并细分为产生 16 个单独的克隆， 在第三轮筛选锥体丰富的文化测试.克隆 0073-09-37 克隆显然与其他克隆的存活率相等于 2.5（补充图 2B）。y 轴具有不同的比例，即使播种密度与补充图 2A 相同。我们经常看到这种情况，当检测每周重复几个月。经过分析，这些结果证实克隆0073-09-37对圆锥体存活有稳健和可重复的影响。测试是独立重复的（图3A），插入1.8 kb是有序的（图3B）。
生物信息分析显示克隆人0073-09-37， 我们命名的上皮源锥活性因子（EdCVF），包含三个开放读取帧（ORF），一个最上游（ORF1）编码为84残留的C端部分的鼠蛋白锌指蛋白-180（ZFP180，NP_653358）的727氨基酸44。另外两种ORF（ORF2和ORF3）在小鼠中保存得不太好，在其他哺乳动物中也不存在。独立测试时，只有ORF1对圆锥体（补充图3）产生保护作用。ORF1是作为谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白（图4A）产生的。EdCVF蛋白被纯化，GST标签被移除（图4B）。EdCVF 能够防止圆锥体丰富的培养系统（图 4C）中的锥体变性。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61998/61998fig01.jpg"> 图1：发育阶段28、29和30的鸡胚胎。箭 W： 翅膀， C： 衣领和 B： 账单。比例栏 1 厘米。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/61998fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61998/61998fig02.jpg"> 图2：鸡胚胎视网膜解剖<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/61998fig02large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61998/61998fig03.jpg"> 图3：表皮衍生锥体生存因子 （EdCVF）， 克隆 0073-09-37.A. 提高圆锥体丰富文化的生存能力。 B. cDNA 克隆的序列 0073-09-37。下划线序列 GAATTC 是用于构建库的 EcoRI 限制站点。两个以粗体表示GTG的共生器是来自向量的EDCVF的罕见翻译启动站点。按学生测试进行统计分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/61998fig03large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61998/61998fig04.jpg"> 图 4： 重组 Edcvf 活动。 A. Edcvf 在与谷胱甘肽 S - 转移酶 （Gst） 融合中的序列。 B. 纯化重组的EdCVF蛋白。 C. GST-EdCVF在文化锥体上的营养活动。使用图基测试进行统计分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/61998fig04large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
补充图1：cDNA池的平均细胞数与负控制的比例，COS-1细胞的条件介质在第一轮筛选过程中与空向量pcDNA3.1发生变质。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/Supplemntary_File_1_12_11_2020.pdf" target="_blank">请单击此处下载此文件。</a>
补充图2：活细胞数量。A. 第二轮筛选，分池为0073池。B.第三轮筛选与孤立的克隆。CN：COS-1细胞的条件介质与空向量pcDNA3.1发生变质。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/Supplementary_Figure_2_12_11_2020.pdf" target="_blank">请单击此处下载此文件。</a> 
补充图3：分离克隆0073-09-37三个开放读取帧的营养活性。 使用邓内特的测试进行统计分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/Supplementary_figure_3.pdf" target="_blank">请单击此处下载此文件。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
			<td>9</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
			<td>12</td>
		</tr>
<tr>
<td>一</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>数控</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>数控</td>
		</tr>
<tr>
<td>乙</td>
			<td>数控</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>数控</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>6</td>
			<td>数控</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>数控</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>8</td>
			<td>8</td>
			<td>数控</td>
			<td>9</td>
			<td>9</td>
			<td>9</td>
			<td>9</td>
			<td>10</td>
			<td>数控</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>戊</td>
			<td>11</td>
			<td>11</td>
			<td>11</td>
			<td>数控</td>
			<td>11</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>数控</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
		</tr>
<tr>
<td>F</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
			<td>14</td>
			<td>14</td>
			<td>数控</td>
			<td>14</td>
			<td>14</td>
			<td>15</td>
			<td>15</td>
			<td>15</td>
			<td>数控</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>G</td>
			<td>16</td>
			<td>16</td>
			<td>16</td>
			<td>16</td>
			<td>17</td>
			<td>数控</td>
			<td>17</td>
			<td>17</td>
			<td>17</td>
			<td>18</td>
			<td>18</td>
			<td>数控</td>
		</tr>
<tr>
<td>H</td>
			<td>18</td>
			<td>18</td>
			<td>19</td>
			<td>19</td>
			<td>19</td>
			<td>19</td>
			<td>数控</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>数控</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="13">NC 负控件</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="13">在四重奏中测试的池的 1-20 个位置</td>
		</tr>
</tbody></table>表1：96井板高含量筛选计划

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Cone-Enriched Cultures from the Retina of Chicken Embryos to Study Rod to Cone Cellular Interactions

我们描述了一种从鸡胚胎的网膜中获取锥体光感受器的初级培养物的方法，并将其用于高含量筛选。

从鸡胚胎的直膜到研究棒到锥细胞相互作用的锥形丰富文化

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form ...

这种方法用于研究锥体受体，这是日光视力所必需的。这些方法的优点是，它使用受精鸡蛋，这是容易获得的，是主要锥培养的唯一来源之一。该协议用于识别棒源性锥体可生存因子，这是未来有希望的治疗遗传性视网膜退化的方法。此外，该协议还用于研究锥形光感受器的新陈代谢。通过仔细遵循所述协议，其专长在初级细胞培养方面的个人，只需经过几次尝试就能获得圆锥体丰富文化。首先从工业孵化场收集每周受精卵。将受精卵保持在实验室的17摄氏度。对于每种培养物，在20摄氏度下24小时孵育7个受精卵，然后在37摄氏度的潮湿室中孵育136小时，间歇性地回归倾角。要恢复鸡胚胎，用消毒剂清洗鸡蛋表面，用大直钳在蛋壳顶部打个洞，然后切开蛋壳，从鸡蛋上取下帽子。用弯曲的钳子轻轻地从蛋壳中提取每个胚胎，然后转移到含有以前加热到37摄氏度的无菌PBS的培养皿中。小心地取出环绕胚胎的信封。通过与汉堡和汉密尔顿的视觉比较验证每个胚胎的发育阶段，并在发育的第29阶段选择两个胚胎，使这些选定的胚胎的眼睛被激发出来，并将其转移到二氧化碳独立的介质中。在二氧化碳独立介质中工作，位置四眼角膜朝下，视神经朝实验者。用两个直钳在视神经上钻一个洞。在视网膜和色素上皮之间插入每个钳子的一个分支，然后拉动和旋转眼睛，将上皮从视网膜中分离。取出角膜，然后是镜片和角膜。将四个视网膜转移到含有林格介质的培养皿中，pH 7.2。使用两个直钳将四个视网膜切成非常小的碎片，并用林格的介质洗两次。第二次洗涤后，让小管碎片掉到管子底部，并移除介质。在37摄氏度下用Trypsin溶液治疗视网膜片20分钟。20分钟后，停止反应，添加文化媒体补充10%灭活的胎儿小腿血清。用 0.05 毫克的 DNase 1 孵化细胞悬架，然后立即用移液器上下管道分离细胞簇和 DNA。用化学定义培养介质或 CDM 清洗视网膜细胞悬架两次。在37摄氏度下，用透明底和聚氨酯处理两个黑色96井培养板两小时。完成后，用 M199 培养介质冲洗两次板。将Trypan蓝色添加到细胞悬架的10微升的别名中，以染色活细胞。然后将细胞悬浮标本添加到血细胞仪中。在计算细胞后，使用 CDM 将细胞悬浮到适当的浓度。添加分子库的 50 微升，使用预先定义的模式进行筛选。将两个细胞悬架的50微升种子放入两个预处理的黑色96井培养板中。用多通道移液器从板的右侧向左分配板中的细胞，使每个柱子之间均匀。然后在37摄氏度下孵化板块7天，低于5%的二氧化碳，没有媒体变化。为了计算可行的细胞，在板的每个井中加入2.7微摩尔钙素AM和0.3毫摩尔乙酸乙二甲酸钠同质化物。在没有光线的情况下，在室温下将盘子孵化一小时。阅读自动板读取器上的荧光，该读卡器由倒置显微镜组成，配备有 485 和 520 纳米两个激发滤镜的汞灯、520 和 635 纳米的两个排放滤清器以及充电耦合设备摄像头。该协议用于筛选一个标准化的cDNA库，该库由胆汁和视网膜色素上皮组成，由8周大的长埃文斯鼠的400只眼睛组成。共评估了2，112套100个克隆，相当于211，200个个体克隆。在42个比例大于2的克隆池中，0080和0073的活性比7天培养后的负控制高16倍和14倍。从100个克隆中选出的每一个被细分为16组10个克隆从他们的甘油库存。子池 0073-09 提供了最强的生存率，并细分为产生 16 个单独的克隆，在第三轮锥体丰富培养物筛选中进行了测试。克隆 0073-09-37 以 2.5 的生存率脱颖而出。进一步分析证实，这种克隆对圆锥体的生存有强大和可重复的影响。试验独立重复，并按顺序插入1.8千基。生物信息分析显示，克隆0073-09-37，即名为"甲基二甲酸-衍生锥体生存因子"，或EdCVF，包含三个开放读取帧。独立测试时，只有ORF1对圆锥体产生保护作用。ORF1是作为谷胱甘肽S-转移酶蛋白生产的。上皮衍生的锥体生存因子被纯化，GST 标签被移除。营养活动的分析表明，EdCVF能够防止圆锥体丰富的培养系统中的锥体变性。在尝试此过程时，应仔细检查胚胎的发育阶段，以便获得圆锥体丰富的培养物。按照这个协议，细胞可以用质粒DNA电波化，以研究任何生存因素的分子机制，如RdCVF。这项技术为代谢研究铺平了道路，包括锥体生存数学模型的开发。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

丰富的少突胶质细胞培养和Myelinating产后小鼠组织联合培养的少突胶质细胞/神经元的推导

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

科研

神经科学

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

transretinal ERG的录音，从小鼠视网膜杆和锥光反应

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Sex Stratified Neuronal Cultures to Study Ischemic Cell Death Pathways

Sex differences in neuronal susceptibility to ischemic injury and neurodegenerative disease have long been observed, but the signaling mechanisms ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

小脑颗粒神经元的遗传操作<em&gt;体外</em&gt;和<em&gt;在体内</em&gt;为研究神经元形态和迁移

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

器官切片文化研究少突胶质细胞动力学和髓鞘

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

的vibratome切片小鼠视网膜准备感光文化

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

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嗅觉系统作为模型来研究轴突生长的模式和形态<em&gt;在体内</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

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成像钙<sup&gt; 2+</sup&gt;在小鼠视网膜锥光感受器轴突终末动态

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

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Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

时间依赖性增加对微电极阵列刺激神经元细胞培养物的网络响应

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...