Name: cone-enriched cultures from the retina of chicken embryos to study rod to cone cellular interactions
Uploaded: 2021-03-20T14:15:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cone-Enriched Cultures from the Retina of Chicken Embryos to Study Rod to Cone Cellular Interactions at JoVE.com

המחברים מודים לז'אק בללו, לורלי פורנייה, עמנואל קלרין, פרדריק בלונד והאגריקולה המנוקדת (EARL Morizeau Dangers, צרפת) על עזרתם רבת הערך. עבודה זו נתמכה על ידי Inserm, אוניברסיטת סורבון, סוכנות לאומית לשפוך לה Recherche (ANR, Labex Lifesenses), קרן הלחימה עיוורון (ארה"ב) ו IHU FOReSIGHT [ANR-18-IAHU-0001] נתמך על ידי קרנות מדינה צרפתיות המנוהלות על ידי ANR בתוך תוכנית Investissements d'Avenir.

הפרוטוקול אושר על ידי הוועדה לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת פייר ומארי קירי ומשרד המחקר הצרפתי (מספר היתר: APAFIS #1028 2015070211275177). הניסויים בבעלי חיים בוצעו תחת האישור הבא: "אישור d'autorisation d'expérimenter סור les אנימו vertébrés A-75-1863. Préfecture de Police de Paris (9 בנובמבר 2011 - 8 בנובמבר 2016)".
1. דגירה של ביצים מופרות
<ol><li>לאסוף ביצים מופרות שבועיות (זן אני 657, תווית אדומה), המתקבל באופן טבעי, במדגרה תעשייתית.</li>
	<li>לשמור על הביציות המופריות ב 17 מעלות צלזיוס (האפס הביולוגי שלהם) במעבדה לאחר שהם "מוטלים" על ידי התרנגולת.</li>
	<li>עבור כל תרבות, דגירה שבע ביצים מופרות במשך 24 שעות ב 20 מעלות צלזיוס ולאחר מכן 136 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם היפוך לסירוגין של הנטייה (תנועה פרוגרסיבית במשך 2 שעות מצד אחד להיפך, מחזור 4 שעות) של הביצים בתא לח.</li>
</ol>2. שחזור של עוברי העוף
<ol><li>לשטוף את פני השטח של שבע הביצים עם חיטוי (למשל, Pursept A אקספרס).</li>
	<li>כדי לשבור את קליפת הביצה, לעשות חור בחלק העליון של הקליפה עם צבת ישרה גדולה. ואז לחתוך את הקליפה כדי להסיר את הכובע מן הביצה כמו ביצה רכה.</li>
	<li>מוציאים בעדינות כל עובר מקליפת הביצה עם מלקחיים מעוגלים, ולאחר מכן מעבירים אותו לצלחת פטרי המכילה מלוח חיץ פוספט סטרילי (PBS) שחומם בעבר ל-37 מעלות צלזיוס. בעדינות, להסיר את המעטפה המקיפה את העוברים (chorion או קרום chorioallantoic).</li>
	<li>לאמת את שלב ההתפתחות של כל עובר על ידי השוואה חזותית המבורגר המילטון42.</li>
	<li>בחרו שני עוברים בשלב ה-29 של ההתפתחות (איור 1). הכנפיים מתכופפות במרפקים. הצווארון בולט בעליל. הצעת החוק בולטת יותר מאשר בשלבה-28.</li>
	<li>האחסנו את עיניהם של עוברים נבחרים אלה והעבירו אותם במדיום בלתי תלוי CO2(טכנולוגיות חיים). התראה: חשוב מאוד שהעובר יהיה בשלב 29, ולא בשלב 28 או 30(איור 1); לכן יש צורך להדגיר לפחות 7 ביצים, גם אם רק שתיים ישמשו סוף סוף. ה chorion הוא דק מאוד, כל כך קשה להבחין, אבל זה קרוב מאוד מן העובר, ולכן יש להסיר אותו מבלי לגעת העובר.</li>
</ol>3. ניתוח הרשתית
<ol><li>לערוף ולהטמיע את העוברים שנבחרו עם מלקחיים מעוגלים.</li>
	<li>מעבירים את ארבע העיניים למדיוםדו-חמצני עצמאי. מדיום זה מכיל 0.9 mM CaCl2 ו 0.65 mM MgCl2.</li>
	<li>מקם את העין עם הקרנית עם הפנים כלפי מטה, עצב הראייה מול הניסוי. לקדוח חור בעצב הראייה באמצעות שתי מלקחיים ישרים.</li>
	<li>הכנס ענף של כל מלקחיים בין הרשתית לבין אפיתל הפיגמנט (איור 2). משוך על כל מלקחיים ולסובב את העין כדי לנתק את האפיתל מן הרשתית. הסר את הקרנית ואחריו את העדשה ואת זגוגית.</li>
	<li>מעבירים את ארבע הרשתות בצלחת פטרי המכילה את המדיום של רינגר ב-pH 7.2. התראה: ודא כי רק הרשתית נשארת ולהסיר את כל העקבות של אפיתל פיגמנט רשתית שנותרו.</li>
</ol>4. הכנת ההשעיה של תאי הרשתית
<ol><li>חותכים את ארבע הרשתיות בחתיכות קטנות מאוד באמצעות שני צבת ישר.</li>
	<li>לשטוף את חתיכות הרשתית פעמיים עם המדיום של רינגר.</li>
	<li>לאחר הכביסה השנייה עם המדיום של רינגר, תן את חתיכות הרשתית ליפול על החלק התחתון של הצינור ולהסיר את המדיום של צלצול. לטפל חתיכות הרשתית במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם פתרון של טריפסין (0.25% w / v).</li>
	<li>לפזר את הפתרון לאחר 10 דקות על ידי יניקה רצופה. פריקה באמצעות פיפטה פסטר ולבדוק ניתוק של חתיכות הרשתית. לעצור את התגובה על ידי הוספת מדיה תרבות בתוספת 10% מומת סרום עגל העובר.</li>
	<li>דגירה את ההשעיה התא עם 0.05 מ ג של DNase I. לנתק את אשכולות התא ואת ה- DNA על ידי יניקה רצופה פריקה באמצעות פיפטה פסטר מיד לאחר הוספת DNase.</li>
	<li>לשטוף את ההשעיה תא הרשתית פעמיים עם מדיום תרבות מוגדר כימית (CDCM): נפח שווה של מדיום הנשר שונה של Dulbecco ו M199 מדיה בתוספת 100 מיקרוגרם / מ"ל חומצה לינולאית / BSA, 0.86 מיקרומטר אינסולין, 0.07 מיקרומטר טרנספרין, 2.0 מיקרומטר פרוגסטרון, 0.28 מיקרומטר פרוסטגלנדין, 0.29 מיקרומטרנה 2SeO3, 182 μM putrescine, 3 mM טאורין, 4.7 מיקרומטר ציטידין 5′-דיפוספוגולין, 2.7 מיקרומטר ציטידין 5′-דיפוספוטנולאמין, 0.55 מיקרומטר הידרוקורטיזון, 0.03 מיקרומטר טריודוטירונין, 1 מ"מ נתרן פירובט ו 20 מיקרומטר גנטימיצין.</li>
</ol>5. זריעת תאי רשתית
<ol><li>פנקו שתי צלחות תרבות שחורות של 96 בארות עם תחתית שקופה למשך שעתיים ב-37°C עם פולי-ל-ליצין ב-32.25 מיקרוגרם/ס"מ2.</li>
	<li>יש לשטוף את הצלחות פעמיים במדיום התרבות M199. Resuspend גלולת התא ב 1 מ"ל של CDCM.</li>
	<li>הוסף aliquot של 10 μL של התא השעיה trypan כחול כדי להכתים את התאים החיים. מוסיפים את דגימת ההשעיה של התאים לתוך המוציתומטר (תא ספירת תאים של Malassez).<ol>
<li>תחת מיקרוסקופ, לספור את התאים המוכתמים עבור ארבע שורות של המוציתומטר (כלומר, 40 ריבועים), ולאחר מכן לחשב את מספר התא הממוצע עבור שורה אחת. לחשב את ריכוז התאים של המתלה על ידי החלת השיטה הבאה: מספר תאים / מ"ל של השעיה = מספר ממוצע של תאים בשורה (10 ריבועים) x 10 המספר הכולל של ריבועים של המוציטופומטר x דילול עם כחול trypan x 1,000 (כדי לבטא את התוצאה כתאים / מ"ל).</li>
	</ol>
</li>
	<li>להביא את התא השעיה לשני ריכוזים (5.6 x 104 תאים / מ"ל ו 1.12 x 105 תאים / מ"ל) המתאים שתי צפיפות ציפוי (1 x 105 תאים / ס"מ2 ו 2 x 105 תאים / ס"מ2) באמצעות CDCM.</li>
	<li>זרע 50 μL של שני התא השעיות לתוך שתי צלחות תרבות שחורות 96-באר מטופלות מראש. פזר את התאים בלוחות עם פיפטה רב-ערוצית מימין ללוח שמאלה, הומוגניזציה בין כל עמודה, כך שהתפלגות התאים היא הומוגנית.</li>
	<li>הוסף 50 μL של ספריית המולקולות (למשל, המדיה המותנית מספריית cDNA, ראה להלן) להקרנה באמצעות תבנית מוגדרת מראש (טבלה 1).</li>
	<li>דגירה הצלחות במשך שבעה ימים ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% CO2 ללא שינוי של מדיה.</li>
</ol>6. ספירת תאים בני קיימא
<ol><li>לכל באר של הצלחת, להוסיף 2.7 מיקרומטר של calcein AM ו 0.3 מ"מ של הומודימר אתידיום. הערה: Calcein חודר את התאים אטומים מולקולות גדולות כמו הומודימר אתידיום. בציטופלסמה של תאים חיים, calcein הוא הידרוליזה על ידי אסטרות אנדוגני, הופך פלואורסצנטי על ידי פולט ב 520 ננומטר כאשר נרגש ב 485 ננומטר. אתידיום הומודימר נקשר לדנ"א על תאים מתים. כריכת DNA-homodimer אתידיום גורמת פלואורסצנטיות אדומה להיפלט ב 635 ננומטר לאחר עירור ב 520 ננומטר.</li>
	<li>הדגירה את הצלחות במשך שעה בטמפרטורת החדר בהיעדר אור.</li>
	<li>קרא את הפלואורסצנטיות על קורא לוחות אוטומטי המורכב ממיקרוסקופ הפוך המצויד במנורת כספית עם שני מסנני עירור ב- 485 ו- 520 ננומטר, שני מסנני פליטה ב- 520 ו- 635 ננומטר, מטרה (x10), שלב ממונע הנשלט על ידי מעבד ומצלמת מכשיר משולבת טעינה (CCD). פלטפורמת ספירה זו נשלטת על ידי תוכנת מטמורף19. זה מאפשר לרכוש תמונות פלואורסצנטיות של תאים חיים ותאים מתים בו זמנית בכל באר של צלחת 96-באר, החל בארות A1 לכיוון גם A12, אז B12 לכיוון B1, C1 לכיוון C12 וכןהלאה( טבלה I ).</li>
	<li>חישוב האזור הממוצע A של תא בודד באמצעות 18 הבארות של הפקדים השליליים (טבלה I).</li>
	<li>לספור את התאים בכל באר של הצלחת ולהחיל את הנוסחה האמפירית הבאה A x 29 / 20.7 כדי למנוע כי תא מכפיל (קיבוץ של שני תאים) נספרים. ניקוד ההשפעה המגנה של הקונוסים על ידי מולקולות כיחס בין מספר התא הממוצע ב 4 בארות שבו בדקנו את המולקולה לעומת מספר התא הממוצע ב 18 בארות של הפקד השלילי (ראה טבלה 1 ואיור משלים 1).</li>
	<li>שלב את התוצאות של הלוח זרעים ב 1 x 105 תאים / ס"מ2 עם אחד זרע ב 2 x 105 תאים / ס"מ2 כדי להעריך את ההגנה הפוטנציאלית (יחס הכדאיות) על ידי כל מולקולה מוקרן.</li>
</ol>

TL, J-AS ו- VF מחזיקים פטנט על השימוש ב- EdCVF לטיפול ניוון רשתית [WO2009071659 (A1). 12 ביוני 2007].

בין הפרמטרים הרבים שעשויים להגביל את הייצור של תרבות מועשרת חרוט מעוברים עוף, הצעד הקריטי הראשון הוא לזהות במדויק את שלב ההתפתחות של העוברים בביצים שבקעו. זה נצפתה כי תרבות של תאים מן הרשתית של עוברים ב ED8 (השלבה -34) מייצרת רק 35% פוטורצפטורים, עם 65% הנותרים עשויים נוירונים אחרים4. לא משנה מה הלוגיסטיקה להחיל כדי לקבל את הביצים שבקעו, יש צורך לכוונן את הטמפרטורה ואת זמן הדגירה, ולבחון בזהירות את העוברים לעומת תמונות התייחסות של כל שלבי ההתפתחות42,45.
במקור, מערכת התרבות מועשרת חרוט פותחה באמצעות זן לגהורןלבן 4. הצבע הלבן של הביצים של זן זה אינו מוערך במיוחד בצרפת, ולכן השתמשנו בזן של עוף המייצר ביצים חומות. ניצלנו את זן I 657, אשר נעשה על ידי חציית I 66 תרנגולים עםJA57 תרנגולות 5. הצלחנו לשחזר את המאפיינים של התרבויות המקוריות. זה מראה כי הרקע הגנטי של העוף אינו קריטי כדי להשיג תרבויות מועשרות חרוט.
לא בדקנו את ההשפעה של הסרה אישית של תוספי מזון במדיום התרבות, אבל ראינו כי אינסולין ממלא תפקיד קריטי בהתאם להשפעת האינסולין על הישרדותם של קונוסים בעכבר rd1, מודל של RP רצסיבי אוטוזומלי46. Triiodothyronine (T3) עשוי גם להשתתף בהבחנה של תאים מבשר רשתית של עובר העוף לתוך קונוסים על פי התפקיד של קולטן הורמון בלוטת התריס בגורל התא ברשתית במהלך הפיתוח40. כתוצאה מכך, לא ניתן להשתמש במערכת התרבות המועשרת בקונוס כדי לזהות אינסולין על ידי שיבוט ביטוי46.
מערכת התרבות מועשרת חרוט מסתמך על התרבות של נוירונים ראשוניים והוא הרבה יותר מתאים שיטות tha להסתמך על השימוש בתאים מונצחים כמו קו התא 661W24,25,26.
השיטה המתוארת כאן ניתן לשנות על ידי ביצוע electroporation הקודם עם DNAפלסמיד 20. לפני הכנת ההשעיה של התא ברשתית, הרשתית כולה ממוקמת בתא של electroporator בהתאמה אישית עם 120 μL של 0.5 מיקרוגרם / μL של DNA פלסמיד ב 10 מ"מ Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA. חמישה פולסים של 15 V עבור 50 ms כל אחד מוחלים מופרדים על ידי מרווח 950 ms22. ניסיונות לספק RNA מפריע (RNAi) באמצעות שכפול splice העופות המוסמכים (RCAS) retroviruses לתוך תרבויות מועשר חרוט לא הצליחו47. זה בהחלט בשל העובדה כי בהיעדר סרום ובתרבויות של צפיפות נמוכה, תאים מבשר רשתית אינם משכפלים, דרישה להפצת retroviruses.
פיתחנו את מערכת התרבות מועשרת חרוט לזהות גורמים טרופיים המקדמים הישרדות חרוט באמצעות שיבוט ביטוי19. על מנת להפוך אותו ריאלי, ביצענו צעד ראשון של הקרנת תוכן גבוה באמצעות מדיום מותנה מבריכות של 100 שיבוטים. גם אם cDNAs מהספרייה באים לידי ביטוי תחת שליטה של מקדם CMV חזק לאחר transfection של תאי COS-1, זה לא מציע ערבות כי כל החלבונים המקודדים על ידי cDNAs בודדים להגיע לריכוז מספיק כדי לקבל ציון חיובי על ידי מבחני הכדאיות. זוהי מגבלה עיקרית. במובן זה, כל הקרנה היא לא ממש ממצה. בנוסף, גם אם חלבונים membranous לא הוסרו מן המדיום המותנה, התצורה של ההסתעפות היא שלילית לזיהוי של גורמים שאינם מפוזרים. חלופה אחרת תהיה לסנן שיבוטים בודדים לאחר שהשיגו את הרצף של cDNAs על מנת למנוע כפילויות בבדיקת פעמים רבות את אותו חלבון מועמד. זה היה ביוזמת רצף ספריות cDNA הרשתית השתמשנו43. אמנם רציונלי, גישה זו יש גם את המגבלות שלה. הניתוח הביואינפורמטי של רצפי cDNA יטיל, ללא עוררין, לצד הפחתת היתירות, את סדר העדיפויות של סינון שיבוטים מסוימים המבוססים על ידע. זה לא יהיה מזיק אם סוף סוף, הספרייה כולה תוקרן גם אם הזמן הנדרש לעשות את זה יוארך באופן משמעותי. אבל תמיד, זהות הרצף תשפיע על הדרך שלנו להסתכל על התוצאות. זה לא יהיה ניטרלי שכן הפרשנות של הרצף תהיה באופן טבעי בתחרות עם הנתונים הניסיוניים.
הזיהוי של EdCVF גם מראה כי סינון תוכן גבוה כרוך במגבלות טכניות. מהסיבוב הראשון של ההקרנה זיהינו שתי בריכות עם פעילות גבוהה (איור משלים 1). הבריכה 0073 הובילה לזיהוי מוצלח של EdCVF, בעוד בריכה 0080 לא גרמה לממצא כזה. לא פתרנו את הבעיה שעלולה לנבוע מאובדן השיבוט הפעיל במהלך הכנת מאגרי משנה. לחלופין, זה לא נשלל, גם אם לא חיובי מבחינה סטטיסטית, כי בין cDNAs של הבריכה 0080, שני חלבונים פעלו בסינרגיה ופעילותם לא ניתן היה לראות שיבוטים בודדים.
זיהוי מולקולות המגנות על קונוסים על ידי סינון מולקולות קטנות הוא יישום עתידי של מערכת התרבות המועשרת בקונוסים. מולקולות כאלה יהיו יקרות ערך לטיפול בפתולוגיות רשתית שעבורן ריפוי גנטי אינו הגישה המתאימה ביותר כמו ניוון מקולרי הקשור לגיל.

הרשתית של מינים בעלי חוליות היא כפולה, עם פוטורצפטורים מוט לראיית אור עמום קולטני חרוט עבור אור יום, צבע וראיית חדות. חדות ראייה פרימטים מסתמכת על אזור במרכז הרשתית, הנקרא הגומה, המועשר בקונוסים, אך בסך הכל, קונוסים מייצגים רק 5% מכלל הפוטורצפטורים. כתוצאה מכך, הניתוח של הקונוסים ברשתית הפרימטים ובמיוחד תרבות הקונוסים קשה מבחינה טכנית. לכל מיני היונקים האחרים אין גומה ואחוז הקונוסים נמוך עבור מכרסמים הנפוצים ביותר במחקר רשתית. זה לא המקרה של מיני העופות, שעבורם קונוסים שולטים ברשתית של מיני הציפורים הנראים היטב האלה. דינוזאורים, ששלטו במערכת האקולוגית כאשר היונקים הופיעו לראשונה במהלך האבולוציה, נמצאים במקור הפילוגנטי שלציפורים 1. כתוצאה מתחרות כזו בין דינוזאורים ליונקים מוקדמים, היונקים הם בעיקר ליליים עם רשתיות הנשלטות על ידי מוטות. רק מאוחר יותר במהלך האבולוציה הפך החזון היורנלי של מיני יונקים מסוימים, ביניהם שייכים הפרימטים, ליתרון אבולוציוני. עם זאת, תקופת האבות נותרה כאטביזם של צוואר הבקבוק הלילי באבולוציה של חזון היונקים2,3.
בעת לימוד בידול תאי הרשתית, אדלר והאטלי הראו כי פוטורצפטורים מייצגים כ -70% מהתאים המובחנים ברשתית בתרבויות שמקורן בעוף ביום העוברי (אד) 6 או שלב 294. בגלל השכיחות של קונוסים ברשתית העוף, תרבויות של תאים ברשתית מעוברים עוף ED6 פותחו כמו תרבויות מועשרות חרוט5.
החשיבות של חדות ראייה בתיווך חרוט לאדם היא אמת. אנשים מושפעים ממחלות גנטיות או הזדקנות שמשנות את תפקוד הקונוסים מוגבלים מאוד. זה קידם גוף גדול מאוד של מחקרים על ניוון רשתית בירושה (IRD) במטרה למצוא טיפולים למחלות מסנוורות אלה6,7. ההצלחה הראשונה, שהושגה באמצעות וקטור הקשור לאדנו רקומביננטי (AAV) לטיפול בצורה חמורה של IRD Leber אמורוזיס מולד (LCA), היא הוכחת רעיון לריפוי גנטי8. זיהוי הגנים שהמוטציות שלהם מפעילות את IRD פותח את האפשרות לרפא מחלות אלה באמצעות ריפוי גנטי. עם זאת, מחלות אלה נובעות מוטציות יותר מ 200 גנים שונים9. אפילו במקרה של צורות רצסיביות אוטוזומליות של IRD, כאשר הצגתו מחדש של העותק הרגיל של הגן החולני יכולה לשחזר את התפקוד החזותי, העלות הכלכלית של כל התפתחות אינדיבידואלית מעדיפה את הנפוצים ביותר המזיקים לאלה הפחות נפוצים ולאלה שעבורם המקור הגנטי עדיין לא ידוע. עובדה זו הובילה את החוקרים לחשוב על טיפולים כלליים יותר. מוות תאי אפופטי הופיע כמסלול נפוץ, ויעד טיפולי של מחלות אלה המתקדמות על ידי ניוון של פוטורצפטורים, כולל עבור צורות דומיננטיות אוטוזומליות10,11. עם זאת, ההצלחות של גישה כזו חסרות. עבור הצורה הנפוצה ביותר של IRD, רטיניטיס פיגמנטוזה (RP), המסלול המשותף הוא אובדן משני של תפקוד בסופו של דבר ואחריו ניוון של קונוסים12,13. מניעת אובדן תפקוד החרוט תשמר את החזון המרכזי של הגומה ללא תלות במוטציות הסיבתיות14.
בשלב המוקדם של RP, אובדן מוטות מפעילה ירידה בביטוי של גורם הכדאיות חרוט נגזר מוט (RdCVF), מקודד על ידי הגן דמוי גרעין 1 (NXNL1), אשר קוטע את איתות חילוף החומרים ו redox בין מוטות וקונוסים15. הממשל של AAV רקומביננטי קידוד שני המוצרים של הגן NXNL1, הגורם הטרופי RdCVF ואת האנזים תיורדוקסין RdCVFL, יכול תיאורטית למנוע אובדן ראיית חרוט בכל הצורות הגנטיות של RP16. הראינו כי מוצר הגן NXNL1, RdCVFL, בא לידי ביטוי בתרבויות מועשרות חרוט עוף17 ושם הוא ממלא תפקיד מגן18. RdCVF ואת הגן NXNL1 זוהו על ידי הקרנת תוכן גבוה של ספריית cDNA רשתית באמצעות הישרדות של תאים מתרבות מועשרת חרוט כמו קריאה19. הקרנו את המקבילה של 210,000 שיבוטים בודדים של הספרייה באמצעות 8 בדיקות מקבילות לכל שיבוט. זה מייצג מספר גדול מאוד של בדיקות הדורשות גישה קלה לחומר הביולוגי, הרשתית של עוברי עוף. מצאנו כי היה קל יחסית להשיג ביצי עוף עובריות על בסיס שבועי מכיוון שהן מיוצרות באופן נרחב לתעשיית האגרו לתרנגולות מטילות ביצים ותרנגולות המייצרות בשר. לאחר סטנדרטיזציה זהירה של התרבויות המועשרות בקונוסים, המערכת מספקת דרך קלה, איתנה וניתן לשחזור לבדוק אלפי מולקולות על יכולתן לשמר את יכולתן לשמור על יכולת הקיום של הקונוסים. תאים אלה הם גם נוחים מניפולציות גנטיות20 כי תועלת לחקר התמרכות האות וניתוחים ביוכימיים21,22,23.
חוקרי רשתית פיתחו שיטות חלופיות כמו השימוש בקו תא חרוט 661W24,25,26. עם זאת, זהותו של קו תא זה נשארת שנויה במחלוקת27,28. התאים 661W היו משובטים מגידולים ברשתית של קו עכבר מהונדס המבטא את אנטיגן T SV40 גדול תחת שליטה של מקדם חלבון רטינול מחייב האינטרפוטור האנושי. SV40 אנטיגן T גדול מתווך טרנספורמציה סלולרית והנצחה. כתוצאה מכך, יש לדווח על מסלול איתות המזוהה באמצעות תאי 661W בהקשר של קו תאים שעבר המרה ומונצח, הנבדל במובנים רבים מקונוסים באתרו. במובן זה, מערכת התרבות המועשרת בקונוסים מורכבת מתאי עצב ראשוניים, הקונוסים הרלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית.
אמנם ניתן להשיג תרבות טהורה של פוטורצפטורים באמצעות קטעים vibratome של הרשתית העכבר, אחוז נמוך מאוד של קונוסים ברשתית החיצונית של מכרסמים עושה גישה זו אינה מתאימה לייצור תרבויות מועשר חרוט29. רשתית החזירים אינה מכילה גומה, אך יש בה אזור שנקרא אזור מרכזי המועשר מאוד בקונוסים30. השיעור הגבוה של קונוסים במכרסמים הבסיסיים ברשתית, כמו Arvicanthis ansorgei ו Psammomys אובססיבי31,32, מציע פתרון אפשרי אבל דורש רבייה של מינים אקזוטיים כאלה. עיני חזיר בוגרות, שנאספו מבתי מטבחיים מקומיים, יכולות לשמש לייצור תרבות מעורבת של מוטות וקונוסים ששימשו ללימוד הישרדות פוטורצפטור33. פתרון אלגנטי הוא לטהר מראש קונוסים מרשת החזיר באמצעות גלילה עם אגלוטינין בוטנים (PNA) לקטין, אשר נקשר באופן סלקטיבי לקונוסים34. עם זאת, קשה ליישם שיטה זו בקנה מידה גדול בשל מורכבותה.
תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPS) מציעים את הגישה המבטיחה ביותר להשגת אוכלוסיית תאי פוטורצפטור חרוט שניתן להשתמש בהם להשתלת רשתית אך ניתן גם להתאים לתרבות מועשרת חרוט35,36. מאז גורם שעתוק NRL נדרש עבור rod-photoreceptors37, Nrl-/- העכבר יש רשתית הנשלטת על ידי קונוסים גל קצר (S-קונוסים). ניתן להשתמש בהשבתה כדי לייצר הכנה מועשרת S-חרוט על ידי בידול של אדם מ- iPS38,39. גישה אפשרית נוספת היא לקדם בידול חרוט באמצעות הורמון בלוטת התריס איתות40. בעוד שיטות חדשניות לייצור תרבויות מועשרות חרוט מן iPS האנושי מתגלים, עוברי עוף לספק שיטה מוכחת הנוכחי19.
התרבות המועשרת בקונוס סייעה בזיהוי RdCVF על ידי שיבוט ביטוי19. מערכת זו שימשה גם בהצלחה כדי להדגים כי RdCVF מגרה את ספיגת הגלוקוז ואת חילוף החומרים שלה על ידי גליקוליזהאירובית 22. יתר על כן תרבות מועשרת חרוט שימש כדי לאמת את התפקיד המגן של RdCVFL, המוצר השני של הגן NXNL1 23. לאחרונה, מערכת זו שימשה כדי להדגים את קיומו של הגנה על מולקולות המופרשות על ידי תאי אפיתל פיגמנט רשתית transduced עם OTX241.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 black plates (Clear Button with lid Tissue culture treated)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>C1430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>CoolSnap&#160; FX HQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDPC (Cytidine 5&#8242;-diphosphocholine sodium salt dihydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Independant</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>18045-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>005093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Media</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eggs incubator</td>
			<td>FarmLine</td>
			<td>M08 01 3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Homodimer</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>E1169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F&#339;tal bovine serum</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>10270-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>15710-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS (insulin Transferine selenium)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>large straight pliers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>005074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 medium</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>31150-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph software</td>
			<td>Metamorph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>Eclipse TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>Martzauzer</td>
			<td>Mutlicontrol 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical filter switch</td>
			<td>Shutter Instrument company</td>
			<td>Lambda 10-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>14190-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pursept A express</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11814110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putriscine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight forceps</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>005092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine 0.25 %</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cone-enriched cultures from the retina of chicken embryos to study rod to cone cellular interactions

ראיית היום האנושית מסתמכת על תפקודם של קולטני חרוטים במרכז הרשתית, הגומה. חולים הסובלים הצורה הנפוצה ביותר של ניוון רשתית בירושה, רטיניטיס פיגמנטוזה, לאבד את ראיית הלילה בגלל מוטציה מונעת אובדן של מוט photoreceptors, תופעה ואחריה אובדן מתמשך של תפקוד ומוות של קונוסים המוביל עיוורון. גנטיקאים זיהו גנים רבים עם מוטציות הגורמות למחלה זו, אך המוטציות הראשונות שזוהו חקרו את המנגנונים של ניוון חרוט משני וכיצד מוטציה דומיננטית בקידוד הגן רודופסין עבור הפיגמנט החזותי המתבטא אך ורק במוטות יכולה לגרום לניוון חרוטים.
תוצאה זו של השתלות במודל גנטי של המחלה הובילה למושג אינטראקציות תאים בין מוטות וקונוסים ושל ניוון אוטונומי שאינו תאים של קונוסים בכל הצורות הגנטיות של רטיניטיס פיגמנטוזה.
קונוסים מהווים 5% מכלל הפוטורצפטורים בבני אדם ורק 3% בעכבר, כך שהמחקר שלהם קשה במינים אלה, אך קונוסים עולים במספרם על מוטות במיני ציפורים. התאמנו צלחות של 96 בארות למבשרי רשתית התרבות מהרשתית של עוברי עוף בשלב 29 להתפתחותם. בתרבויות ראשיות אלה, קונוסים מייצגים 80% מהתאים לאחר בידול במבחנה. התאים מנוונים על פני תקופה של שבוע בהעדר סרום. כאן אנו מתארים את השיטות ואת התקינה שלה.
מערכת תרבות מועשרת חרוט זה שימשה לזיהוי גורם הכדאיות חרוט נגזר אפיתל (EdCVF) על ידי הקרנת תוכן גבוה של אפיתל פיגמנטי חולדה מנורמל ספריית cDNA. EdCVF רקומביננטי מונע התנוונות של הקונוסים.

אנו מתארים כאן כיצד ניתן להשתמש במערכת התרבות המועשרת בקונוסים כדי לזהות חרוט חדשני המגן על חלבונים. השתמשנו בפרוטוקול זה כדי להקרין ספריית cDNA מנורמלת עשויה אפיתל פיגמנטי choroid ו הרשתית מ 400 עיניים של 8 שבועות חולדות לונג אוונס43.
ספריה זו מכילה 6.0 x 106 יחידות עצמאיות היוצרות יחידות (CFUs) וגודל הכנסה משוכפל ממוצע של 2.1 קילו-בייס (kb), עם יותר מ- 99% מהשיבוטים הרקומביננטיים. בריכות של 100 שיבוטים מאותה ספרייה היו מוחצבים באופן ארעי (0.1 מיקרוגרם של DNA פלסמיד) לתאי COS-1 והבינוני המותנה (CM) של COS-1 נקצר לאחר הדגירה במשך 48 שעות ב- DMEM ללא סרום. ממברנות או אקסוזומים לא הוסרו על ידי ultracentrifugation. חמישים מיקרוליטרים של כל CM נוספו 4 בארות של שני לוחות 96-באר: אחד זרע ב 2 x 105 תאים / ס"מ2, השני ב 4 x 105 תאים / ס"מ2. CM מתאי COS-1 שהודבקו עם pcDNA3.1 הווקטור הריק ששימש לבניית הספריה שימש כפקד שלילי (טבלה 1). בסך הכל הוערכו 2,112 סטים של 100 שיבוטים המתאימים ל-211,200 שיבוטים בודדים בארבע בארות תרבות ובשני תנאי זריעה של תרבויות מועשרות חרוטים. שני התנאים תואמים לשתי צפיפויות חיסון שונות במקצת המאפשרות להעריך את פעילות המגן בצורה מדויקת יותר, בסך הכל 1,689,600 בארות תרבות.
בין 42 בריכות של שיבוטים עם יחס גדול מ 2, בריכות 0080 ו 0073 יש יחס הכדאיות 16 ו 14 פעמים גבוה יותר לאחר 7 ימים של תרבות מאשר שליטה שלילית, pcDNA3.1(איור משלים 1). ניתוח זה חיוני כדי לזהות את מאגרי העניין. כל בריכה נבחרת של 100 שיבוטים חולקה ל-16 סטים של 10 שיבוטים ממלאי הגליצרול שלהם. בריכות משנה אלה הוכנו ונבדקו על פי אותה שיטה בסבב הקרנה שני (כלומר, בסך הכל 3,200 בארות תרבות). תת-הבריכה 0073-09 העניקה את יחס הכדאיות החזק ביותר (איור 2A משלים) וחולקה כדי לייצר 16 שיבוטים בודדים שנבדקו בסיבוב שלישי של הקרנה על תרבויות מועשרות בקונוסים. השיבוט 0073-09-37 בולט בבירור מהאחרים עם יחס כדאיות השווה ל-2.5 (איור משלים 2B). ציר y יש קנה מידה שונה גם אם צפיפות הזריעה היה זהה באיור משלים 2A. ראינו את זה בדרך כלל כאשר מבחנים חוזרים על עצמם מדי שבוע במשך חודשים. לאחר הניתוח, תוצאות אלה מאשרות כי שיבוט 0073-09-37 יש השפעה חזקה לשחזור על הישרדות חרוט. הבדיקה חזרה על עצמה באופן עצמאי (איור 3A),וההוספה של 1.8 קילו-ב' הייתה ברצף (איור 3B).
ניתוח ביואינפורמטי גילה שהשיבוט 0073-09-37, כי קראנו אפיתל נגזר גורם הכדאיות חרוט (EdCVF), מכיל שלוש מסגרות קריאה פתוחות (ORFs), אחד ביותר במעלה הזרם (ORF1) מקודד עבור 84 שאריות של חלק C-מסוף של חלבון החולדה חלבון אבץ אצבע חלבון-180 (ZFP180, NP_653358) של 727 חומצות אמינו44. שני ORFs האחרים (ORF2 ו ORF3) הם הרבה פחות שמורים היטב בעכברים ונעדרים יונקים אחרים. כאשר נבדק באופן עצמאי, רק ORF1 מפעיל אפקט מגן על הקונוסים (איור משלים 3). ORF1 יוצר כחלבון היתוך גלוטתיון S-transferase (GST)(איור 4A). חלבון EdCVF טוהר ותג GST הוסר (איור 4B). EdCVF מסוגל למנוע ניוון חרוטים במערכת התרבות המועשרת בקונוסים (איור 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61998/61998fig01.jpg"> איור 1: עוברי עוף בשלבים28,29 ו-30th של התפתחות. חצים W: כנף, ג: צווארון ו- B: הצעת חוק. סרגל קנה מידה 1 ס"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/61998fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61998/61998fig02.jpg"> איור 2: ניתוח הרשתית של עובר העוף <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/61998fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61998/61998fig03.jpg"> איור 3: גורם הכדאיות של חרוט (EdCVF), שיבוט 0073-09-37. א. כדאיות מוגברת בתרבות מועשרת בקונוסים. ב. ב. הרצף של שיבוט cDNA 0073-09-37. הרצף עם קו תחתון GAATTC הוא אתר ההגבלה של EcoRI המשמש לבניית הספריה. שני קודונים GTG מודגש הם אתרי ייזום תרגום נדירים עבור EdCVF שמקורם וקטור. ניתוח סטטיסטי לפי מבחן סטודנט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/61998fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61998/61998fig04.jpg"> איור 4: פעילות EdCVF רקומביננטית. ב. ב. חלבון EdCVF רקומביננטי מטוהר. ג. ג. פעילות טרופית של GST-EdCVF על חרוט בתרבות. ניתוח סטטיסטי באמצעות המבחן של טוקי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/61998fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
איור משלים 1: היחס בין מספר התא הממוצע עבור מאגר cDNA לבין הפקד השלילי, המדיום המותנה של תאי COS-1 שהודבקו בווקטור הריק pcDNA3.1 במהלך סבב ההקרנה הראשון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/Supplemntary_File_1_12_11_2020.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a> 
משלים איור 2: מספר התאים החיים. א. סבב ההקרנה השני עם בריכות משנה של בריכת 0073. ב. ב. הסיבוב השלישי של ההקרנה עם שיבוטים מבודדים. CN: המדיום המותנה של תאי COS-1 מודבק עם הווקטור הריק, pcDNA3.1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/Supplementary_Figure_2_12_11_2020.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a> 
איור משלים 3: פעילות טרופית של שלוש מסגרות הקריאה הפתוחות של השיבוט המבודד 0073-09-37. ניתוח סטטיסטי באמצעות המבחן של דאנט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/Supplementary_figure_3.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
			<td>9</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
			<td>12</td>
		</tr>
<tr>
<td>A</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>מספר NC</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>מספר NC</td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>מספר NC</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>מספר NC</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>6</td>
			<td>מספר NC</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>מספר NC</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>8</td>
			<td>8</td>
			<td>מספר NC</td>
			<td>9</td>
			<td>9</td>
			<td>9</td>
			<td>9</td>
			<td>10</td>
			<td>מספר NC</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>E</td>
			<td>11</td>
			<td>11</td>
			<td>11</td>
			<td>מספר NC</td>
			<td>11</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>מספר NC</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
		</tr>
<tr>
<td>נ</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
			<td>14</td>
			<td>14</td>
			<td>מספר NC</td>
			<td>14</td>
			<td>14</td>
			<td>15</td>
			<td>15</td>
			<td>15</td>
			<td>מספר NC</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>G</td>
			<td>16</td>
			<td>16</td>
			<td>16</td>
			<td>16</td>
			<td>17</td>
			<td>מספר NC</td>
			<td>17</td>
			<td>17</td>
			<td>17</td>
			<td>18</td>
			<td>18</td>
			<td>מספר NC</td>
		</tr>
<tr>
<td>H</td>
			<td>18</td>
			<td>18</td>
			<td>19</td>
			<td>19</td>
			<td>19</td>
			<td>19</td>
			<td>מספר NC</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>מספר NC</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="13">פקדים שליליים של NC</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="13">1-20 מיקומים של הבריכות שנבדקו ב-quadruplicate</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: תוכנית צלחת 96 באר להקרנת תוכן גבוה

Watch this Scientific Journal Video about Cone-Enriched Cultures from the Retina of Chicken Embryos to Study Rod to Cone Cellular Interactions at JoVE.com

Cone-Enriched Cultures from the Retina of Chicken Embryos to Study Rod to Cone Cellular Interactions

אנו מתארים שיטה להשגת תרבויות ראשוניות של קולטני חרוטים מהרשתית של עוברי עוף והשימוש בה להקרנת תוכן גבוה.

תרבויות מועשרות חרוט מן הרשתית של עוברי עוף ללמוד מוט כדי חרוט אינטראקציות הסלולר

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form ...

שיטה זו משמשת לחקר קולטני חרוט אשר חיוניים לראיית אור יום. היתרון של השיטות הוא שהיא משתמשת בביצי עוף מופרות, שהן נגישות בקלות, ואחד המקורות היחידים של תרבויות חרוט ראשוניות. הפרוטוקול שימש לזיהוי גורם הכדאיות של חרוט נגזר רוד, טיפול מבטיח בעתיד לניוון רשתית בירושה.יתר על כן, הפרוטוקול שימש לחקר חילוף החומרים פוטורצפטור חרוט. על ידי ביצוע זהיר של הפרוטוקול המתואר, אדם שמומחיותו היא בתרבות התאים העיקרית, צריך להיות מסוגל להשיג תרבות מועשרת חרוט לאחר ניסיונות ספורים בלבד. התחל על ידי איסוף ביצים מופרות שבועיות מדגרה תעשייתית.לשמור על הביציות המופריות ב 17 מעלות צלזיוס במעבדה. עבור כל תרבות, דגירה שבע ביצים מופרות במשך 24 שעות ב 20 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן 136 שעות ב 37 מעלות צלזיוס בתא לח עם היפוך לסירוגין של נטייה. כדי לשחזר את עוברי העוף, לשטוף את פני הביצים עם חיטוי, לשבור את קליפת הביצה על ידי ביצוע חור בחלק העליון של הקליפה עם צבת ישרה גדולה, ולאחר מכן לחתוך את הקליפה כדי להסיר את הכובע מן הביצה.מוציאים בעדינות כל עובר מקליפת הביצה עם מלקחיים מעוגלים ומעבירים אותו לצלחת פטרי המכילה PBS סטרילי שחומם בעבר ל-37 מעלות צלזיוס. הסר בזהירות את המעטפה המקיפה את העוברים. לאמת את שלב ההתפתחות של כל עובר על ידי השוואה חזותית להמבורגר והמילטון ולבחור שני עוברים בשלב ה -29 של הפיתוח להאנקת העיניים של עוברים נבחרים אלה ולהעביר אותם למדיום פחמן דו חמצני עצמאי.עבודה במדיום פחמן דו חמצני עצמאי, למקם ארבע עיניים עם הקרנית פונה כלפי מטה ואת עצב הראייה מול הניסוי. לקדוח חור בעצב הראייה באמצעות שתי מלקחיים ישרים. הכנס ענף של כל מלקחיים בין הרשתית לבין אפיתל הפיגמנט, ולאחר מכן למשוך ולסובב את העין כדי לנתק את האפיתל מן הרשתית.הסר את הקרנית, ואחריו את העדשה ואת זגוגית. מעבירים את ארבע הרשתית לצלחת פטרי המכילה את המדיום של רינגר ב-pH 7.2. חותכים את ארבע הרשתיות לחתיכות קטנות מאוד באמצעות שני צבת ישר לשטוף את החלקים פעמיים עם המדיום של רינגר.לאחר הכביסה השנייה, תן את חתיכות הרשתית ליפול לתחתית הצינור ולהסיר את התקשורת. לטפל חתיכות הרשתית עם פתרון של טריפסין במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר 20 דקות, לעצור את התגובה על ידי הוספת מדיה תרבות בתוספת 10% מומת סרום עגל העובר.דגירה ההשעיה התא עם 0.05 מ ג של DNase 1 ואז מיד לנתק את אשכולות התא ואת ה- DNA על ידי pipetting למעלה ולמטה עם פיפטה. לשטוף את ההשעיה תא הרשתית פעמיים עם מדיום תרבות מוגדר כימית או CDM. פנקו שתי צלחות תרבות שחורות של 96 בארות עם תחתית שקופה עם פוליצין במשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס.בסיום, יש לשטוף את הצלחות פעמיים במדיום התרבות M199. הוסף כחול Trypan aliquot של 10 microliters של המתלה התא כדי להכתים את התאים החיים. לאחר מכן הוסף את דגימת השעיית התא למד המוציטרומטר.לאחר ספירת התאים, להביא את ההשעיה התא לריכוזים המתאימים באמצעות CDM. הוסף 50 מיקרוליטרים של ספריית המולקולות שיוקרנו באמצעות תבנית מוגדרת מראש. זרעו את 50 המיקרוליטרים של שתי השעיות התאים לשתי צלחות התרבות השחורות המטופלות מראש של 96 בארות.פזרו את התאים בלוחות בעזרת פיפטה רב-ערוצית מימין ללוח שמאלה, והומוגניזציה בין כל עמודה. ואז להדגיר את הצלחות במשך שבעה ימים ב 37 מעלות צלזיוס, תחת 5% פחמן דו חמצני ללא שינוי של מדיה. כדי לספור את התאים קיימא, להוסיף 2.7 קלצ'ין micromolar AM ו 0.3 מילימולאר אתידיום homodimer לכל באר של הצלחת.דגירה הצלחות במשך שעה בטמפרטורת החדר בהיעדר אור. קרא את הפלואורסצנטיות על קורא לוחות אוטומטי המורכב ממיקרוסקופ הפוך המצויד במנורת כספית עם שני מסנני עירור ב 485 ו 520 ננומטר, שני מסנני פליטה ב 520 ו 635 ננומטר ומצלמת מכשיר מצמד טעינה. פרוטוקול זה שימש כדי להקרין ספריית cDNA מנורמל עשוי אפיתל choroid ו הרשתית פיגמנט מ 400 עיניים של שמונה שבועות, חולדות לונג-אוונס.בסך הכל 2, 112 סטים של 100 שיבוטים המתאימים 211, 200 שיבוטים בודדים הוערכו. בין 42 בריכות של שיבוטים עם יחס גדול משניים, בריכות 0080 ו 0073 היה יחס הכדאיות 16 ו 14 פעמים גבוה יותר מאשר שליטה שלילית לאחר שבעה ימים של תרבות. כל אחד מ-100 השיבוטים נבחר ל-16 סטים של 10 שיבוטים ממלאי הגליצרול שלהם.מאגר המשנה 0073-09 נתן את יחס הכדאיות החזק ביותר והיה מחולק לייצר 16 שיבוטים בודדים שנבדקו בסיבוב שלישי של הקרנה על תרבויות מועשרות חרוט. השיבוט 0073-09-37 בלט עם יחס כדאיות של 2.5. ניתוח נוסף אישר כי שיבוט זה יש השפעה חזקה לשחזור על הישרדות חרוט.הבדיקה חזרה על עצמה באופן עצמאי וההוספה של 1.8 קילו-בייסים הייתה ברצף. ניתוח ביואינפורמטי גילה כי שיבוט 0073-09-37, אשר נקרא אפיתל נגזר חרוט גורם הכדאיות, או EdCVF מכיל שלוש מסגרות קריאה פתוחות. כאשר נבדק באופן עצמאי, רק ORF1 הפעיל אפקט מגן על הקונוסים.ORF1 יוצר כחלבון גלוטתיון S-טרנספראז. גורם הכדאיות של חרוט שמקורו באפיתל טוהר ותג GST הוסר. ניתוח של פעילות טרופית הראה כי EdCVF הוא מסוגל למנוע ניוון חרוט במערכת התרבות מועשרת חרוט.בעת ניסיון הליך זה, שלב ההתפתחות של העוברים צריך להיבדק בקפידה על מנת לקבל את התרבויות מועשר חרוט. בעקבות פרוטוקול זה, התאים יכולים להיות electroporated עם DNA פלסמיד לחקור את המנגנונים המולקולריים של כל גורמי ההישרדות כגון RdCVF. טכניקה זו סוללת את המחקר המטבולי כולל פיתוח מודלים מתמטיים של הישרדות חרוט.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

גזירת תרבויות Oligodendrocyte מועשר Neuron Oligodendrocyte / Myelinating משותף תרבויות מן שלאחר הלידה רקמות Murine

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

Transretinal ERG הקלטות של רשתית עכבר: רוד Photoresponses חרוט

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Sex Stratified Neuronal Cultures to Study Ischemic Cell Death Pathways

Sex differences in neuronal susceptibility to ischemic injury and neurodegenerative disease have long been observed, but the signaling mechanisms ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

תרבויות Organotypic Slice ללמוד oligodendrocyte Dynamics וmyelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

Vibratome חתך רשתית העכבר להכין תרבויות קולטי אור

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

מערכת חוש הריח כמודל לחקר דפוסי axonal צמיחה ומורפולוגיה<em&gt; In vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

ההדמיה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

ברחם Electroporation גישות לחקר רגישות של העצבית subpopulations וקישוריות תא יחיד

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

זמן תלויי תגובת הרשת בתגובה לגירוי של תרבויות תאים עצביים על מערכי מיקרו-אלקטרודה

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...