Name: cone-enriched cultures from the retina of chicken embryos to study rod to cone cellular interactions
Uploaded: 2021-03-20T14:15:00
Duration: 8 min 4 s
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लेखक जैक्स बेलालो, लोरलेई फोरनियर, इमैनुएल क्लेरिन, फ्रेडेरिक गोरा और एंट्रेप्राइज एग्रीकोल ए रेस्पॉन्साबिलिटे लिमिटी (अर्ल मोर्इज़ौ खतरों, फ्रांस) को उनकी अमूल्य मदद के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम को इन्सेर्म, सोरबोन विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था, एग्नेस नेशनल डालना ला रेचेचे (एएनआर, लेटेक्स लाइफसेंस), फाउंडेशन फाइटिंग ब्लाइंडनेस (यूएसए) और आईएचयू एफओरेसी [एएनआर-18-आईएएचयू-0001] ने इन्वेस्टिसमेंट्स डी एवेनिर प्रोग्राम के भीतर एएनआर द्वारा प्रबंधित फ्रांसीसी राज्य फंड द्वारा समर्थित किया था।

टीएल, जे-एएस और वीएफ रेटिना डिजनरेशन [WO2009071659 (A1) के इलाज के लिए एडसीवीएफ के उपयोग पर पेटेंट आयोजित करते हैं। जून 12 2007]।

कई मापदंडों है कि चिकन भ्रूण से एक शंकु समृद्ध संस्कृति के उत्पादन को सीमित हो सकता है में, पहला महत्वपूर्ण कदम के लिए सही रची अंडे में भ्रूण के विकास के चरण की पहचान है । यह देखा गया है कि ED8 (34वें चरण) में भ्रूण के रेटिना से कोशिकाओं की संस्कृति केवल 35% फोटोरिसेप्टर पैदा करती है, शेष 65% अन्य न्यूरॉन्स4से बने होते हैं। जो कुछ भी रसद रची अंडे पाने के लिए लागू किया, यह ठीक करने के लिए आवश्यक है तापमान और इनक्यूबेशन समय धुन, और ध्यान से भ्रूण की जांच के रूप में विकास के सभी चरणों के संदर्भ चित्रों की तुलना में४२,४५।
मूल रूप से, शंकु-समृद्ध संस्कृति प्रणाली को व्हाइट लेगहॉर्नस्ट्रेन 4का उपयोग करके विकसित किया गया था। उस तनाव के अंडों का सफेद रंग फ्रांस में विशेष रूप से सराहना नहीं की जाती है, इसलिए हमने चिकन के एक तनाव का उपयोग किया जो भूरे रंग के अंडे का उत्पादन करता है। हम मैं 657 तनाव है, जो JA57 मुर्गियां 5 के साथ मैं 66 मुर्गा पार करके कियाजाताहै का उपयोग किया. हम मूल संस्कृतियों की विशेषताओं को पुन: पेश करने में सक्षम थे। इससे पता चलता है कि चिकन की आनुवंशिक पृष्ठभूमि शंकु-समृद्ध संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है।
हमने संस्कृति माध्यम में पूरक के व्यक्तिगत निष्कासन के प्रभाव का परीक्षण नहीं किया है, लेकिन यह देखा है कि इंसुलिन आरडी1 माउस में शंकु के अस्तित्व पर इंसुलिन के प्रभाव के अनुसार एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जो ऑटोसोमल अप्रभावी आरपी46का एक मॉडल है। त्रियोडोथाइरोनिन (टी 3) विकास40के दौरान रेटिना सेल भाग्य में थायराइड हार्मोन रिसेप्टर की भूमिका के अनुसार चिकन भ्रूण की रेटिना अग्रदूत कोशिकाओं के भेदभाव में भी भाग ले सकता है। नतीजतन, शंकु समृद्ध संस्कृति प्रणाली४६क्लोनिंग द्वारा इंसुलिन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है ।
शंकु-समृद्ध संस्कृति प्रणाली प्राथमिक न्यूरॉन्स की संस्कृति पर निर्भर करती है और यह कोशिका रेखा 661W24, 25, 26के रूप में अमर कोशिकाओं के उपयोग पर निर्भर हैऔरअधिक उपयुक्त था विधियां हैं।
यहां वर्णित विधि को प्लाज्मिड डीएनए20के साथ पूर्व विद्युत प्रवयन करके संशोधित किया जा सकता है । रेटिना सेल निलंबन तैयार करने से पहले, पूरे रेटिना को कस्टम-निर्मित इलेक्ट्रोपोरेटर के कक्ष में रखा जाता है जिसमें 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0, 1 एमएमएम ईडीटीए में प्लाज्मिड डीएनए के 0.5 माइक्रोन/माइक्रोन के 120 माइक्रोन के साथ रखा जाता है। 50 एमएस के लिए 15 वी की पांच दालें 950 एमएस अंतराल22से अलग होती हैं । कोन-समृद्ध संस्कृतियों में प्रतिकृति सक्षम एवियन स्प्लिस (आरसीएएएस) रेट्रोवायरस का उपयोग करके हस्तक्षेप आरएनए (आरएनएआई) देने के प्रयास असफल47थे। यह निश्चित रूप से इस तथ्य के कारण है कि सीरम की अनुपस्थिति में और कम घनत्व की संस्कृतियों में, रेटिना अग्रदूत कोशिकाएं प्रतिकृति नहीं हैं, रेट्रोवायरस के प्रचार के लिए एक अपेक्षित है।
हमने ट्रॉफिक कारकों की पहचान करने के लिए शंकु-समृद्ध संस्कृति प्रणाली विकसित की है जो अभिव्यक्ति क्लोनिंग19का उपयोग करके शंकु के अस्तित्व को बढ़ावा देती है। इसे व्यवहार्य बनाने के लिए, हमने 100 क्लोन के पूल से वातानुकूलित माध्यम का उपयोग करके उच्च सामग्री स्क्रीनिंग का पहला कदम किया। यहां तक कि अगर पुस्तकालय से सीडीएनए COS-1 कोशिकाओं के ट्रांसफैक्शन के बाद एक मजबूत सीएमवी प्रमोटर के नियंत्रण में व्यक्त किए जाते हैं, तो यह एक गारंटी प्रदान नहीं करता है कि व्यक्तिगत सीडीएनए द्वारा एन्कोड किए गए सभी प्रोटीन व्यवहार्यता परख द्वारा सकारात्मक बनाए जाने के लिए पर्याप्त एकाग्रता तक पहुंचते हैं। यह एक बड़ी सीमा है । इस अर्थ में, किसी भी स्क्रीनिंग वास्तव में संपूर्ण नहीं है । इसके अलावा, भले ही वातानुकूलित माध्यम से झिल्लीदार प्रोटीन को नहीं हटाया गया हो, लेकिन परख का विन्यास गैर-विसारक कारकों की पहचान के लिए प्रतिकूल है। एक विकल्प के लिए सीडीएनए के अनुक्रम प्राप्त करने के बाद व्यक्तिगत क्लोन स्क्रीन के लिए कई बार एक ही उंमीदवार प्रोटीन परख में दोहराव से बचने के लिए किया जाएगा । यह रेटिना सीडीएनए पुस्तकालयों हम43इस्तेमाल अनुक्रमण द्वारा शुरू किया गया था. तर्कसंगत रहते हुए इस दृष्टिकोण की भी अपनी सीमाएं हैं । सीडीएनए दृश्यों का जैव सूचना विश्लेषण अपरिवर्तनीयता में कमी के अलावा, ज्ञान के आधार पर कुछ क्लोन स्क्रीनिंग की प्राथमिकता को अनूठा रूप से लागू करेगा। यह हानिकारक नहीं होगा अगर अंत में, पूरी लाइब्रेरी की जांच की जाएगी, भले ही ऐसा करने के लिए आवश्यक समय काफी लंबा हो जाएगा। लेकिन निरपवाद रूप से, अनुक्रम की पहचान परिणामों को देखने के हमारे तरीके को प्रभावित करेगी। यह तटस्थ नहीं होगा क्योंकि अनुक्रम की व्याख्या स्वाभाविक रूप से प्रायोगिक आंकड़ों के साथ प्रतिस्पर्धा में होगी ।
एडसीवीएफ की पहचान से यह भी पता चलता है कि उच्च सामग्री स्क्रीनिंग में तकनीकी सीमाएं आवश्यक हैं । स्क्रीनिंग के पहले दौर से, हम उच्च गतिविधि(अनुपूरक चित्रा 1)के साथ दो पूल की पहचान की । पूल 0073 ने ईडीसीवीएफ की सफल पहचान की, जबकि पूल 0080 ने इस तरह की खोज का संचालन नहीं किया। हमने उस समस्या का समाधान नहीं किया है जो उप-पूल तैयार करने के दौरान सक्रिय क्लोन के नुकसान से परिणाम दे सकती है। वैकल्पिक रूप से, इसे बाहर नहीं रखा गया है, भले ही सांख्यिकीय रूप से अनुकूल न हो, कि पूल 0080 के सीडीएनए के बीच, दो प्रोटीन सहक्रियात्मक रूप से कार्य कर रहे थे और उनकी गतिविधि को व्यक्तिगत क्लोन के रूप में नहीं देखा जा सकता था।
छोटे अणुओं की स्क्रीनिंग द्वारा शंकु की रक्षा करने वाले अणुओं की पहचान शंकु-समृद्ध संस्कृति प्रणाली का भविष्य का अनुप्रयोग है । ऐसे अणु रेटिना विकृतियों के उपचार के लिए अमूल्य होंगे जिनके लिए जीन थेरेपी उम्र से संबंधित मैकुलर अध: पतन के रूप में सबसे उपयुक्त दृष्टिकोण नहीं है ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 black plates (Clear Button with lid Tissue culture treated)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>C1430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>CoolSnap&#160; FX HQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDPC (Cytidine 5&#8242;-diphosphocholine sodium salt dihydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Independant</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>18045-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>005093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Media</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eggs incubator</td>
			<td>FarmLine</td>
			<td>M08 01 3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Homodimer</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>E1169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F&#339;tal bovine serum</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>10270-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>15710-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS (insulin Transferine selenium)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>large straight pliers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>005074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 medium</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>31150-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph software</td>
			<td>Metamorph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>Eclipse TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>Martzauzer</td>
			<td>Mutlicontrol 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical filter switch</td>
			<td>Shutter Instrument company</td>
			<td>Lambda 10-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>14190-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pursept A express</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11814110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putriscine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight forceps</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>005092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine 0.25 %</td>
			<td>Thermo-Fisher scientific</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cone-enriched cultures from the retina of chicken embryos to study rod to cone cellular interactions

मानव दिन की दृष्टि रेटिना, फोवे के केंद्र में शंकु फोटोरिसेप्टर्स के कार्य पर निर्भर करती है। विरासत में मिले रेटिना अध: पतन, रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा के सबसे प्रचलित रूप से पीड़ित रोगी, रॉड फोटोरिसेप्टर्स के उत्परिवर्तन संचालित नुकसान के कारण रात की दृष्टि खो देते हैं, एक घटना जिसके बाद कार्य की प्रगतिशील हानि होती है और शंकु की मृत्यु होती है जिससे अंधापन होता है। आनुवंशिकीविदों ने इस बीमारी के कारण म्यूटेशन के साथ कई जीनों की पहचान की है, लेकिन पहले उत्परिवर्तनों की पहचान ने माध्यमिक शंकु अध: पतन के तंत्र पर सवाल उठाया और कैसे रोडोप्सिन जीन एन्कोडिंग में एक प्रमुख उत्परिवर्तन विशेष रूप से छड़ में व्यक्त किए गए दृश्य वर्णक के लिए शंकु अध: पतन को ट्रिगर कर सकता है।
रोग के एक आनुवंशिक मॉडल में प्रत्यारोपण के इस परिणाम ने छड़ और शंकु के बीच सेल इंटरैक्शन की अवधारणा और रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा के सभी आनुवंशिक रूपों में शंकु के गैर-सेल स्वायत्त अध: पतन की अवधारणा का नेतृत्व किया।
शंकु मनुष्यों में सभी फोटोरिसेप्टर के 5% और माउस में केवल 3% शामिल हैं, इसलिए उनका अध्ययन इन प्रजातियों में मुश्किल है, लेकिन पक्षी प्रजातियों में शंकु छड़ से अधिक है। हम अपने विकास के चरण 29 में चिकन भ्रूण के रेटिना से रेटिना अग्रदूत संस्कृति के लिए ९६ अच्छी तरह से प्लेटें अनुकूलित किया है । इन प्राथमिक संस्कृतियों में, शंकु इन विट्रो भेदभाव के बाद कोशिकाओं के 80% का प्रतिनिधित्व करते हैं। कोशिकाएं सीरम की अनुपस्थिति में एक सप्ताह की अवधि में पतित होती हैं। यहां, हम तरीकों और इसके मानकीकरण का वर्णन करते हैं।
इस शंकु-समृद्ध संस्कृति प्रणाली का उपयोग चूहे रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम सामान्यीकृत सीडीएनए पुस्तकालय की उच्च सामग्री स्क्रीनिंग द्वारा एपिथेलियम-व्युत्पन्न शंकु व्यवहार्यता कारक (ईडीसीवीएफ) की पहचान करने के लिए किया गया था। Recombinant EdCVF शंकु के पतन को रोकता है।

हम यहां वर्णन कैसे शंकु समृद्ध संस्कृति प्रणाली प्रोटीन की रक्षा उपन्यास शंकु की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हमने इस प्रोटोकॉल का उपयोग 8 सप्ताह पुराने लॉन्ग-इवांस चूहों43की 400 आंखों से कोरॉयड और रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम से बने एक सामान्यीकृत सीडीएनए पुस्तकालय को स्क्रीन करने के लिए किया।
इस पुस्तकालय में 6.0 x 106 स्वतंत्र कॉलोनियां इकाइयां (सीएफयू) बनाती हैं और इसमें 2.1 किलोबेस (केबी) का औसत क्लोन डालने का आकार है, जिसमें 99% से अधिक पुनर्संयोजन क्लोन हैं। उस पुस्तकालय से १०० क्लोन के पूल क्षणिक रूप से संक्रमित थे (प्लाज्मिड डीएनए के ०.१ माइक्रोन) को COS-1 कोशिकाओं में और COS-1 के वातानुकूलित माध्यम (सीएम) को सीरम के बिना डीएमईएम में ४८ घंटे के लिए इनक्यूबेशन के बाद काटा गया था । अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन द्वारा झिल्ली या एक्सोसोम नहीं हटाए गए थे। प्रत्येक सीएम के ५० माइक्रोलीटर को दो ९६-वेल प्लेटों के 4 कुओं में जोड़ा गया: एक 2 x 105 कोशिकाओं/सेमी2पर वरीयता प्राप्त, दूसरा 4 x 105 कोशिकाओं/सेमी2पर । पुस्तकालय के निर्माण के लिए उपयोग किए जाने वाले खाली वेक्टर पीसीडीएनए3.1 से संक्रमित COS-1 कोशिकाओं से सीएम का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण(तालिका 1)के रूप में किया जाता था। २११,२०० व्यक्तिगत क्लोन के अनुरूप १०० क्लोन के कुल २,११२ सेट चार संस्कृति कुओं में और शंकु समृद्ध संस्कृतियों की दो सीडिंग शर्तों के लिए मूल्यांकन किया गया । दो स्थितियां दो थोड़ा अलग टीका घनत्व के अनुरूप हैं जो कुल 1,689,600 संस्कृति कुओं के लिए सुरक्षात्मक गतिविधि का अधिक सटीक आकलन करना संभव बनाती हैं।
2 से अधिक अनुपात वाले क्लोन के 42 पूलों में, पूल 0080 और 0073 में नकारात्मक नियंत्रण, pcDNA3.1(अनुपूरक चित्रा1) की तुलना में संस्कृति के 7 दिनों के बाद व्यवहार्यता अनुपात 16 और 14 गुना अधिक है। यह विश्लेषण ब्याज के पूल की पहचान करने के लिए आवश्यक है । 100 क्लोन के प्रत्येक चयनित पूल को उनके ग्लिसरोल स्टॉक से 10 क्लोन के 16 सेटों में विभाजित किया गया था। इन उप-पूलों को स्क्रीनिंग के दूसरे दौर (यानी कुल 3,200 संस्कृति कुओं) में एक ही विधि के अनुसार तैयार और परीक्षण किया गया था। उप-पूल 0073-09 ने सबसे मजबूत व्यवहार्यता अनुपात(अनुपूरक चित्रा 2 ए)दिया और 16 व्यक्तिगत क्लोन का उत्पादन करने के लिए विभाजित किया गया था जिनका परीक्षण शंकु-समृद्ध संस्कृतियों पर स्क्रीनिंग के तीसरे दौर में किया गया था । क्लोन 0073-09-37 क्लोन स्पष्ट रूप से 2.5(अनुपूरक चित्रा 2B)के बराबर व्यवहार्यता अनुपात के साथ दूसरों से बाहर खड़ा है। वाई एक्सिस का एक अलग पैमाना है, भले ही सीडिंग घनत्व अनुपूरक आंकड़ा 2A की तुलना में समान था। हमने इसे आमतौर पर तब देखा है जब परखों को महीनों तक साप्ताहिक रूप से दोहराया जाता है । विश्लेषण के बाद, इन परिणामों की पुष्टि करते है कि क्लोन 0073-09-37 शंकु अस्तित्व पर एक मजबूत और प्रजनन प्रभाव पड़ता है । परीक्षण स्वतंत्र रूप से दोहराया गया था(चित्रा 3A),और 1.8 kb के सम्मिलित अनुक्रम(चित्रा 3B)था।
एक जैव सूचना विश्लेषण से पता चला है कि क्लोन 0073-09-37, कि हमने एपिथेलियम-व्युत्पन्न शंकु व्यवहार्यता कारक (ईडीसीवीएफ) का नाम दिया, जिसमें तीन ओपन रीडिंग फ्रेम (ओआरएफ) शामिल हैं, जो चूहा प्रोटीन जिंक फिंगर प्रोटीन-180 (ZFP180, NP_653358) के 727 अमीनो एसिड44के सी-टर्मिनल भाग के 84 अवशेषों के लिए सबसे ऊपर (ओआरएफ1) एन्कोड करता है। अन्य दो ORFs (ORF2 और ORF3) चूहों में बहुत कम अच्छी तरह से संरक्षित और अन्य स्तनधारियों में अनुपस्थित हैं। जब स्वतंत्र रूप से परीक्षण किया जाता है, तो केवल ORF1 शंकु(अनुपूरक चित्र 3)पर सुरक्षात्मक प्रभाव डालती है। ओआरएफ1 को ग्लूटाथिएक एस-ट्रांसफरेज (जीएसटी) फ्यूजन प्रोटीन(चित्रा 4A) केरूप में उत्पादित किया गया था। एडसीवीएफ प्रोटीन को शुद्ध किया गया और जीएसटी टैग हटा दिया गया(चित्रा 4B)। EdCVF शंकु समृद्ध संस्कृति प्रणाली(चित्रा 4C)में शंकु पतन को रोकने में सक्षम है ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61998/61998fig01.jpg"> चित्रा 1:28,29और विकास के 30चरणों में चिकन भ्रूण। तीर डब्ल्यू: विंग, सी: कॉलर और बी: बिल। स्केल बार 1 सेमी. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/61998fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61998/61998fig02.jpg"> चित्रा 2:चिकन भ्रूण के रेटिना का विच्छेदन <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/61998fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61998/61998fig03.jpg"> चित्रा 3:एपिथेलियम-व्युत्पन्न शंकु व्यवहार्यता कारक (EdCVF), क्लोन 0073-09-37 । A. शंकु-समृद्ध संस्कृति पर व्यवहार्यता में वृद्धि। B. सीडीएनए क्लोन 0073-09-37 का क्रम । रेखांकित अनुक्रम GAATTC EcoRI प्रतिबंध पुस्तकालय के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया साइट है । बोल्ड में दो codons GTG वेक्टर से निकलने वाले एडसीवीएफ के लिए असामान्य अनुवाद दीक्षा साइटें हैं। छात्र के परीक्षण द्वारा सांख्यिकीय विश्लेषण। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/61998fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61998/61998fig04.jpg"> चित्रा 4-रीकॉम्बिनेंट एडसीवीएफ एक्टिविटी। A. ग्लूटाथिएक एस-ट्रांसफरेज (जीएसटी) के साथ फ्यूजन में एडसीवीएफ का सीक्वेंस। B. शुद्ध रिकॉम्बिनेंट एडसीवीएफ प्रोटीन। सी. संस्कृति में शंकु पर जीएसटी-EdCVF की ट्रॉफिक गतिविधि। तुकी के परीक्षण का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/61998fig04large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
अनुपूरक चित्रा 1: सीडीएनए पूल के लिए औसत सेल संख्या का अनुपात और नकारात्मक नियंत्रण, स्क्रीनिंग के पहले दौर के दौरान खाली वेक्टर पीसीडीएनए3.1 से संक्रमित COS-1 कोशिकाओं का वातानुकूलित माध्यम। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/Supplemntary_File_1_12_11_2020.pdf" target="_blank">इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।</a> 
अनुपूरक चित्रा 2: जीवित कोशिकाओं की संख्या। A. 0073 पूल के उप पूल के साथ स्क्रीनिंग का दूसरा दौर। B. इक्का-दुक्का क्लोन के साथ स्क्रीनिंग का तीसरा दौर । सीएन: खाली वेक्टर, pcDNA3.1 से संक्रमित COS-1 कोशिकाओं का वातानुकूलित माध्यम। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/Supplementary_Figure_2_12_11_2020.pdf" target="_blank">इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।</a> 
अनुपूरक चित्र3: अलग क्लोन 0073-09-37 के तीन खुले पढ़ने के फ्रेम की ट्रॉफिक गतिविधि। डननेट के परीक्षण का उपयोग करते हुए सांख्यिकीय विश्लेषण। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/Supplementary_figure_3.pdf" target="_blank">इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
			<td>9</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
			<td>12</td>
		</tr>
<tr>
<td>एक</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>नेकां</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>नेकां</td>
		</tr>
<tr>
<td>बी</td>
			<td>नेकां</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>नेकां</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>सी</td>
			<td>6</td>
			<td>नेकां</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>नेकां</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>डी</td>
			<td>8</td>
			<td>8</td>
			<td>नेकां</td>
			<td>9</td>
			<td>9</td>
			<td>9</td>
			<td>9</td>
			<td>10</td>
			<td>नेकां</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>ई</td>
			<td>11</td>
			<td>11</td>
			<td>11</td>
			<td>नेकां</td>
			<td>11</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>नेकां</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
		</tr>
<tr>
<td>एफ</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
			<td>14</td>
			<td>14</td>
			<td>नेकां</td>
			<td>14</td>
			<td>14</td>
			<td>15</td>
			<td>15</td>
			<td>15</td>
			<td>नेकां</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>जी</td>
			<td>16</td>
			<td>16</td>
			<td>16</td>
			<td>16</td>
			<td>17</td>
			<td>नेकां</td>
			<td>17</td>
			<td>17</td>
			<td>17</td>
			<td>18</td>
			<td>18</td>
			<td>नेकां</td>
		</tr>
<tr>
<td>एच</td>
			<td>18</td>
			<td>18</td>
			<td>19</td>
			<td>19</td>
			<td>19</td>
			<td>19</td>
			<td>नेकां</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>नेकां</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="13">नेकां नकारात्मक नियंत्रण</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="13">चौगुनी में परीक्षण किए गए पूल के 1-20 पदों</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1: उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए ९६-अच्छी तरह से थाली की योजना

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Cone-Enriched Cultures from the Retina of Chicken Embryos to Study Rod to Cone Cellular Interactions

हम चिकन भ्रूण के रेटिना और उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए इसके उपयोग से शंकु फोटोरिसेप्टर्स की प्राथमिक संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं।

कोन-समृद्ध संस्कृतियों चिकन भ्रूण के रेटिना से शंकु सेलुलर इंटरैक्शन के लिए रॉड का अध्ययन करने के लिए

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form ...

इस विधि का उपयोग शंकु रिसेप्टर्स का अध्ययन करने के लिए किया जाता है जो दिन के उजाले की दृष्टि के लिए आवश्यक हैं। तरीकों का लाभ यह है कि यह निषेचित चिकन अंडे का उपयोग करता है, जो आसान सुलभ हैं, और प्राथमिक शंकु संस्कृतियों के एकमात्र स्रोत में से एक है। प्रोटोकॉल का उपयोग रॉड-व्युत्पन्न कोन व्यवहार्यता कारक की पहचान करने के लिए किया गया था, जो विरासत में मिले रेटिना अध: पतन के लिए भविष्य का आशाजनक उपचार था।इसके अलावा, प्रोटोकॉल का उपयोग शंकु फोटोरिसेप्टर मेटाबोलिज्म का अध्ययन करने के लिए किया गया था। वर्णित प्रोटोकॉल का सावधानीपूर्वक पालन करके, एक व्यक्ति जिसकी विशेषज्ञता प्राथमिक कोशिका संस्कृति में है, को केवल कुछ प्रयासों के बाद शंकु समृद्ध संस्कृति प्राप्त करने में सक्षम होना चाहिए। एक औद्योगिक हैचरी से साप्ताहिक निषेचित अंडे इकट्ठा करके शुरू करें।प्रयोगशाला में 17 डिग्री सेल्सियस पर निषेचित अंडे बनाए रखें। प्रत्येक संस्कृति के लिए, 20 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए सात निषेचित अंडे इनक्यूबेट, और फिर झुकाव के आंतरायिक प्रतिवर्तन के साथ एक आर्द्र कक्ष में ३७ डिग्री सेल्सियस पर १३६ घंटे । चिकन भ्रूण को ठीक करने के लिए, कीटाणुनाशक के साथ अंडे की सतह को धोएं, बड़े सीधे चिमटा के साथ खोल के शीर्ष पर एक छेद बनाकर अंडे का खोल तोड़ें, फिर अंडे से टोपी हटाने के लिए खोल को काटें।धीरे से घुमावदार संदंश के साथ अंडे के शेल से प्रत्येक भ्रूण निकालें और इसे एक पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें बाँझ पीबीएस पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म होता है। ध्यान से भ्रूण के चारों ओर से घेरे लिफाफे को हटा दें। हैम्बर्गर और हैमिल्टन के दृश्य तुलना द्वारा प्रत्येक भ्रूण के विकास के चरण को सत्यापित करें और विकास के 29वें चरण में दो भ्रूणों का चयन करें इन चयनित भ्रूणों की आंखों को न्यूलेट करें और उन्हें कार्बन डाइऑक्साइड-स्वतंत्र माध्यम में स्थानांतरित करें।कार्बन डाइऑक्साइड-स्वतंत्र माध्यम में काम करना, नीचे का सामना करना पड़ कॉर्निया और प्रयोगकर्ता का सामना करना पड़ ऑप्टिक तंत्रिका के साथ चार आंखों की स्थिति । दो सीधे संदंश का उपयोग कर ऑप्टिक तंत्रिका में एक छेद ड्रिल। रेटिना और पिगमेंट एपिथेलियम के बीच प्रत्येक संदंश की एक शाखा डालें, फिर रेटिना से एपिथेलियम को अलग करने के लिए आंख को खींचें और घुमाएं।कॉर्निया निकालें, लेंस और विट्रियस के बाद। चार रेटिना को पीएच 7.2 पर रिंगर के माध्यम से युक्त पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। दो सीधे चिमटा का उपयोग कर बहुत छोटे टुकड़ों में चार रेटिना काटें और रिंगर के माध्यम से दो बार टुकड़े धोएं।दूसरे धोने के बाद रेटिना के टुकड़ों को ट्यूब के नीचे तक गिरने दें और मीडिया को हटा दें। रेटिना के टुकड़ों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ट्रिप्पसिन के समाधान के साथ इलाज करें। 20 मिनट के बाद, 10% निष्क्रिय भ्रूण बछड़े सीरम के साथ पूरक संस्कृति मीडिया जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो ।0.05 मिलीग्राम DNase 1 के साथ सेल निलंबन को इनक्यूबेट करें इसके बाद तुरंत कोशिका समूहों और डीएनए को पिपेट के साथ ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अलग करें। रासायनिक रूप से परिभाषित संस्कृति माध्यम या सीडीएम के साथ रेटिना सेल निलंबन को दो बार धोएं। ३७ डिग्री सेल्सियस पर दो घंटे के लिए पॉलीसाइन के साथ एक पारदर्शी नीचे के साथ दो काले ९६-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों का इलाज करें ।जब समाप्त हो, M199 संस्कृति माध्यम के साथ दो बार प्लेटें कुल्ला । जीवित कोशिकाओं को दाग देने के लिए सेल निलंबन के 10 माइक्रोलीटर के एक aliquot में ट्राइपैन ब्लू जोड़ें। फिर एक हीमोसाइटोमीटर में सेल निलंबन नमूना जोड़ें।कोशिकाओं की गिनती के बाद, सीडीएम का उपयोग कर उचित सांद्रता के लिए सेल निलंबन लाओ। एक पूर्वनिर्धारित पैटर्न का उपयोग करके जांच की जाने वाली अणुओं की लाइब्रेरी के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। बीज दो सेल निलंबन के ५० माइक्रोलीटर दो पूर्वपचारित काले ९६-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में ।प्लेटों में कोशिकाओं को प्लेट के दाईं ओर से बाईं ओर एक बहु-चैनल पिपेट के साथ वितरित करें, प्रत्येक कॉलम के बीच समरूप। फिर मीडिया के कोई परिवर्तन के साथ 5% कार्बन डाइऑक्साइड के तहत, ३७ डिग्री सेल्सियस पर सात दिनों के लिए प्लेटों इनक्यूबेट । व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करने के लिए, प्लेट के प्रत्येक कुएं में 2.7 माइक्रोमोलर कैल्सेइन एएम और 0.3 मिलीमोलर एथिडियम होमोमर जोड़ें।रोशनी के अभाव में कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करें। ४८५ और ५२० नैनोमीटर पर दो उत्तेजन फिल्टर के साथ एक पारा दीपक से लैस एक उल्टे माइक्रोस्कोप से बना एक स्वचालित प्लेट रीडर पर फ्लोरेसेंस पढ़ें, ५२० और ६३५ नैनोमीटर पर दो उत्सर्जन फिल्टर और एक चार्ज युग्मित डिवाइस कैमरा । इस प्रोटोकॉल का उपयोग आठ सप्ताह पुराने, लांग-इवांस चूहों की 400 आंखों से कोरॉयड और रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम से बने सामान्यीकृत सीडीएनए पुस्तकालय को स्क्रीन करने के लिए किया गया था।211, 200 व्यक्तिगत क्लोन के अनुरूप 100 क्लोन के कुल 2, 112 सेटों का मूल्यांकन किया गया। दो से अधिक अनुपात वाले क्लोन के ४२ पूलों में से पूल ००८० और ००७३ में संस्कृति के सात दिनों के बाद नकारात्मक नियंत्रण से 16 और 14 गुना अधिक व्यवहार्यता अनुपात था । 100 क्लोनों में से प्रत्येक का चयन उनके ग्लिसरोल स्टॉक से 10 क्लोन के 16 सेटों में विभाजित किया गया था।उप पूल 0073-09 सबसे मजबूत व्यवहार्यता अनुपात दिया और 16 व्यक्तिगत क्लोन है कि शंकु समृद्ध संस्कृतियों पर स्क्रीनिंग के एक तिहाई दौर में परीक्षण किया गया उत्पादन करने के लिए विभाजित किया गया था । क्लोन 0073-09-37 २.५ के व्यवहार्यता अनुपात के साथ बाहर खड़ा था । इसके अलावा विश्लेषण की पुष्टि की है कि इस क्लोन शंकु अस्तित्व पर एक मजबूत और प्रजनन प्रभाव पड़ता है ।परीक्षण स्वतंत्र रूप से दोहराया गया था और 1.8 किलोबेस के सम्मिलित अनुक्रम किया गया था। एक बायोइंफॉर्मेटिक विश्लेषण से पता चला है कि क्लोन 0073-09-37, जिसे एपिथेलियम-व्युत्पन्न शंकु व्यवहार्यता कारक, या EdCVF का नाम दिया गया था, में तीन खुले पढ़ने के फ्रेम शामिल हैं । जब स्वतंत्र रूप से परीक्षण किया जाता है, तो केवल ORF1 ने शंकु पर सुरक्षात्मक प्रभाव डाला।ओआरएफ1 को ग्लूटाथिएक एस-ट्रांसफरेस प्रोटीन के रूप में उत्पादित किया गया था। एपिथेलियम-व्युत्पन्न शंकु व्यवहार्यता कारक को शुद्ध किया गया था और जीएसटी टैग हटा दिया गया था। ट्रॉफिक गतिविधि के विश्लेषण से पता चला है कि एडसीवीएफ शंकु-समृद्ध संस्कृति प्रणाली में शंकु अध: पतन को रोकने में सक्षम है।जब इस प्रक्रिया का प्रयास, भ्रूण के विकास के चरण ध्यान से जांच की जानी चाहिए ताकि शंकु समृद्ध संस्कृतियों को पाने के लिए । इस प्रोटोकॉल के बाद, कोशिकाओं को आरडीसीवीएफ जैसे किसी भी जीवित रहने वाले कारकों के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए प्लाज्मिड डीएनए के साथ विद्युतीकृत किया जा सकता है। यह तकनीक शंकु अस्तित्व के गणितीय मॉडलों के विकास सहित मेटाबोलिक अनुसंधान का मार्ग प्रशस्त करती है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Oligodendrocyte संस्कृति समृद्ध और Oligodendrocyte न्यूरॉन / डाक प्रसव murine ऊतकों से सह संस्कृतियों Myelinating की व्युत्पत्ति

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

माउस रेटिना से transretinal एर्ग रिकॉर्डिंग: रॉड और शंकु Photoresponses के के.

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Sex Stratified Neuronal Cultures to Study Ischemic Cell Death Pathways

इस्केमिक कोशिका मृत्यु रास्ते अध्ययन करने के लिए सेक्स स्तरीकृत neuronal संस्कृतियों

Sex differences in neuronal susceptibility to ischemic injury and neurodegenerative disease have long been observed, but the signaling mechanisms ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन्स की आनुवंशिक हेरफेर<em&gt; इन विट्रो</em&gt; और<em&gt; में Vivo</em&gt; Neuronal आकृति विज्ञान और प्रवास का अध्ययन करने के लिए

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypic स्लाइस संस्कृति Oligodendrocyte गतिशीलता और myelination अध्ययन

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

Vibratome सेक्शनिंग माउस रेटिना फोटोरिसेप्टर संस्कृति तैयार करने के लिए

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

एक मॉडल के रूप घ्राण प्रणाली axonal विकास पैटर्न और आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए<em&gt; Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Ca इमेजिंग<sup&gt; 2 +</supमाउस रेटिना के कोन फोटोरिसेप्टर अक्षतंतु टर्मिनलों में&gt; गतिशीलता

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

गर्भाशय में Electroporation Neuronal उप-जनसंख्या के excitability और एकल कोशिका कनेक्टिविटी अध्ययन के लिए दृष्टिकोण

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

माइक्रो-इलेक्ट्रोड एरेज़ पर न्यूरोनल सेल संस्कृतियों की उत्तेजना के लिए नेटवर्क रिस्पांस में समय पर निर्भर वृद्धि

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...