Name: crispr/cas9 editing of the c. elegans rbm-3.2 gene using the dpy-10 co-crispr screening marker and assembled ribonucleoprotein complexes.
Uploaded: 2020-12-11T14:00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes. at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door start-upfondsen van de Universiteit van Tulsa (TU) en de TU Faculty Development Summer Fellowship toegekend aan Jyoti Iyer. We willen het Chemistry Summer Undergraduate Research Program (CSURP) en de Tulsa Undergraduate Research Challenge (TURC) bedanken voor het toekennen van stipendia aan de studenten die betrokken zijn bij deze studie. We willen mevrouw Caroline Dunn bedanken voor haar technische bijstand. Tot slot willen we Drs. Jordan Ward, Aimee Jaramillo-Lambert, Anna Allen, Robert Sheaff, William Potter en Saili Moghe bedanken voor hun kritische commentaar op dit manuscript.

Dit protocol voor CRISPR / Cas9-genoombewerking is goedgekeurd door de University of Tulsa Institutional Biosafety Committee volgens de NIH-richtlijnen. In dit protocol werd de steriele techniek beoefend. Alle stappen van dit protocol werden uitgevoerd met behulp van reagentia die vrij waren van nucleasen. Speciale aandacht werd besteed aan het voorkomen van RNase-verontreiniging, zoals reinigingshandschoenen en werkruimten en apparatuur (bijv. pipetten, buitenkant van glaswerk, enz.) met een RNase-ontsmettingsoplossing.
1. crRNA-ontwerp
<ol><li>Zoek de PAM waarmee Cas9 het dichtst bij de bewerkingssite kan snijden.<ol>
<li>De PAM-site is 5'-NGG-3'.</li>
		<li>Vergeet niet dat de PAM zich op beide strengen van het DNA kan bekningen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecteer 20 bp aan het 5'-uiteinde van de PAM als de crRNA-sequentie. OPMERKING: De werkelijke crRNA-sequentie die door commerciële bedrijven wordt gesynthetiseerd, is langer dan 20 bp omdat het een extra generieke sequentie heeft die automatisch wordt toegevoegd aan de doelspecifieke 20 bp crRNA-sequentie door het synthetiserende bedrijf. Met betrekking tot off-target effecten hebben recente studies geen off-target effecten van Cas9 gevonden in C. elegans36,37,38,39,40. Verder worden de resulterende CRISPR-bewerkte soorten overgekruist. Daarom maken we ons niet erg zorgen over off-target effecten van de ontworpen crRNA's. Online websites met http://genome.sfu.ca/crispr/ en http://crispor.tefor.net/ kunnen echter worden gebruikt om de crRNA's met de minste off-target effecten te vinden en te selecteren38,41. crRNA's die eindigen op een G of GG en die met meer dan 50% GC-gehalte worden voorspeld efficiënter te zijn19,23,42.</li>
	<li>Bestel ten minste 10 nmol van het crRNA bij een bedrijf (bijv. IDT, Horizon Discovery, enz.).<ol>
<li>Zodra het gelyofiliseerde crRNA arriveert, bewaart u het bij -30 °C tot de dag van de micro-injectie.</li>
		<li>Draai op de dag van het uitvoeren van de micro-injectie het gelyofiliseerde crRNA met maximale snelheid (17.000 x g) gedurende één minuut en resuspend het in 5 mM Tris-Cl (pH 7,4) om een voorraad van 8 μg / μL van het crRNA te maken.</li>
		<li>Bewaar de ongebruikte crRNA-voorraad bevroren bij -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Repareer sjabloonontwerp
<ol><li>Download software voor sequentiemanipulatie (bijv. CLC-sequentieviewer, APE, Snapgene, Vector NTI, enz.). We gebruiken CLC sequence viewer versie 8.0 (Qiagen) omdat het gebruiksvriendelijk is en gratis kan worden gedownload.</li>
	<li>Plak de volgorde van het beoogde DNA in de sequentieviewer.</li>
	<li>De oriëntatie van de reparatiesjabloon beïnvloedt de bewerkingsefficiëntie28. Voor het invoegen van een reparatiesequentie aan het 5'-uiteinde van de PAM, ontwerpt u een enkelstrengs reparatiesjabloon met DNA-sequentie van dezelfde DNA-streng waarop de PAM-sequentie zich bevindt (protospacer-streng)28. Ontwerp voor het invoegen van een reparatiesequentie aan het 3'-uiteinde van de PAM een enkelstrengs reparatiesjabloon met DNA-sequentie van de DNA-streng die de PAM-sequentie (afstandstreng) niet draagt28.</li>
	<li>Selecteer 35 basenparen van sequentie met ononderbroken homologie aan beide zijden (aan het 5'- en 3'-uiteinde) van de bewerking.</li>
	<li>Muteer of verwijder de PAM om te voorkomen dat het reparatiesjabloon of het bewerkte genomische DNA door Cas9 wordt doorgeknipt.<ol>
<li>Als mutatie van de PAM niet mogelijk is, introduceer dan verschillende stille mutaties dicht bij het 5'-uiteinde van de PAM om te voorkomen dat het reparatiesjabloon of het bewerkte genomische DNA wordt doorgesneden.</li>
		<li>Zorg ervoor dat u alleen stille mutaties van de PAM introduceert als deze aanwezig is in een exonische regio.</li>
		<li>Controleer de frequentie van het codongebruik om er zeker van te zijn dat het gemuteerde codon wordt geïntroduceerd met een frequentie die vergelijkbaar is met het oorspronkelijke niet-gemuteerde codon (bijv. https://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table). In sommige gevallen is het mogelijk dat het niet mogelijk is om het gemuteerde codon met een vergelijkbare frequentie in te brengen als het niet-gemuteerde codon. Voor het maken van mutaties van enkele aminozuren verwachten we echter niet dat het expressieniveau van het gemuteerde eiwit significant zal veranderen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Als de bewerking klein is (bijvoorbeeld mutatie van een paar basen), introduceer dan een unieke restrictiesite dicht bij de bewerking door stille mutagenese. We gebruiken http://heimanlab.com/cut2.html om beperkingssites te vinden die kunnen worden geïntroduceerd door stille mutagenese.<ol>
<li>Controleer de frequentie van het codongebruik om er zeker van te zijn dat het gemuteerde codon wordt geïntroduceerd met een frequentie die vergelijkbaar is met het oorspronkelijke niet-gemuteerde codon. Zoals gezegd is dit niet altijd mogelijk. Voor experimenten met mutaties van enkele aminozuren verwachten we echter niet dat het expressieniveau van het gemuteerde eiwit significant zal veranderen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Synthetiseer en koop lineaire enkelstrengs reparatiesjablonen voor HDR als 4 nmol ultramer oligos.</li>
	<li>Resuspend de lyofilized oligonucleotide reparatie sjabloon in nuclease-vrij water om een 1 μg / μL voorraad van de reparatie sjabloon te maken en bewaar het bij -30 °C tot verder gebruik.</li>
</ol>3. Screening primer ontwerp
<ol><li>Ontwerp met behulp van CLC-sequentieviewer of andere vergelijkbare toepassingen respectievelijk 20 tot 23 basispaar voorwaartse en achterwaartse primers aan weerszijden van de bewerking, zodat ze een band van tussen de 400 en 600 basenparen produceren bij PCR-versterking.<ol>
<li>Voor grotere inserties die enkele kilobases groot zijn, ontwerpt u de voorwaartse primer net buiten de linker homologiearm van de reparatiesjabloon. Ontwerp de omgekeerde primer die zich in de reparatiesjabloon zelf bevindt. In dit geval wordt een PCR-product alleen verkregen in het geval van positief bewerkte wormen.</li>
		<li>Om homozygoot bewerkte wormen te identificeren voor langere inserties, versterkt u het hele gebied van de insertie door voorwaartse en omgekeerde primers te ontwerpen die zich buiten de insertie-juncties bevinden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Test de primers en optimaliseer pcr-omstandigheden met wild-type genomisch DNA voordat u de primers gebruikt voor genotypering.<ol>
<li>Zorg ervoor dat een enkele band van verwachte grootte wordt geproduceerd bij PCR-amplificatie van het genomische DNA (indien van toepassing).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Jongvolwassen wormen voorbereiden voor injectie
<ol><li>Kies L2-L3 stadium C. elegans op een vers bacterieel gazon op een MYOB-plaat en incubeer een nacht bij 20 °C. OPMERKING: Het protocol voor het maken van MYOB-platen vindt u hier: http://www.wormbook.org/wli/wbg13.2p12a/</li>
	<li>Kies op de dag van micro-injectie jongvolwassen wormen met minder dan 10 embryo's in de baarmoeder om te injecteren.</li>
</ol>5. Bereiding van de injectiemix
<ol><li>Bereid het injectiemengsel in dezelfde volgorde als in tabel 1 in steriele nucleasevrije buisjes. OPMERKING: De componenten van de injectiemix kunnen worden verkleind om 5 μL injectiemengsels te maken (in plaats van 20 μL) als toekomstige injecties met dit mengsel niet worden verwacht.</li>
	<li>Meng het injectiemengsel door te pipetteren.</li>
	<li>Incubeer het injectiemengsel bij 37 °C gedurende 15 minuten om ribonucleoproteïnecomplexen samen te stellen.</li>
	<li>Draai het injectiemengsel gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 17.000 x g.</li>
</ol>6. Micro-injectie in de C. elegans gonade
<ol><li>Voer micro-injectie van het CRISPR-injectiemengsel uit in de C. elegans-gonade, zoals beschreven in Iyer et al. 201943.<ol>
<li>Injecteer ongeveer 30 wormen met CRISPR-injectiemix. Het ongebruikte injectiemengsel kan worden hergebruikt door het gedurende een periode van ongeveer 6 maanden bij 4°C te bewaren zonder rendementsverlies49.</li>
		<li>Injecteer indien mogelijk beide gonadarmen. Geïnjecteerde wormen worden beschouwd als de P0-generatie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Geïnjecteerd wormherstel en -overdracht
<ol><li>Verplaats na micro-injectie de micro-geïnjecteerde P0-wormen met behulp van een wormenprikker naar een 60 mm MYOB-agarplaat gezaaid met OP50 E. coli en laat ze ongeveer een uur bij kamertemperatuur herstellen.<ol>
<li>Merk op dat de hersteltemperatuur afhankelijk is van het genotype van de geïnjecteerde wormen. Voor temperatuurgevoelige stammen kan bijvoorbeeld wormherstel bij een andere temperatuur nodig zijn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Breng met behulp van een platinadraadwormpluk elke geïnjecteerde worm over op een enkele gezaaide 35 mm MYOB agar petriplaat en laat ze eieren leggen bij 20 °C tot de volgendedag.
	<ol>
<li>Merk op dat sommige wormen zullen sterven als gevolg van letsel door de micro-injectieprocedure. Kies alleen die wormen die leven en beweging vertonen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Breng na 24 uur de geïnjecteerde wormen over naar nieuwe individuele platen (1 worm per plaat).</li>
</ol>8. Ckiezen. elegans voor screening
<ol><li>Controleer 3 tot 4 dagen bij 20 °C nadat de injectie is uitgevoerd alle platen die het nageslacht van de geïnjecteerde wormen bevatten met behulp van een ontleedmicroscoop.</li>
	<li>Identificeer platen met F1-nakomelingen die roller (Rol) en dumpy (Dpy) fenotypen vertonen. Een Dpy-fenotype is waar wormen korter en stouter lijken dan controlewormen in hetzelfde ontwikkelingsstadium (WormBase: https://wormbase.org/species/all/phenotype/WBPhenotype:0000583#0--10). Platen met Rol- en Dpy-wormen vertegenwoordigen platen waar het F1-nageslacht met succes is bewerkt met de dpy-10 (cn64) mutatie om respectievelijk aanwezig te zijn in zijn heterozygote of homozygote toestand.</li>
	<li>Kies de platen met de meeste roller en dumpy wormen voor screening.</li>
	<li>Pik 50 tot 100 F1 Rolwormen uit deze platen naar hun eigen individuele platen (1 worm per plaat) en laat ze eieren leggen.<ol>
<li>Laat L4-gefaseerde F1 Rol-wormen eieren leggen en nageslacht (F2)produceren gedurende 1 tot 2 dagen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Enkele worm lysis en PCR
<ol><li>Na de productie van F2 gedurende 1 tot 2 dagen, breng elke F1 Rol-moeder over in 2,5 μL lysisbuffer (tabel 2) met een verdunning van 1:100 van 20 mg/ml Proteïnase K.</li>
	<li>Vries de buisjes in bij -30 °C gedurende 20 minuten. De wormen kunnen in dit stadium voor een langere periode worden opgeslagen tot verdere analyse.</li>
	<li>Voer een enkele wormlysis uit op een PCR-thermocycler met de volgende voorwaarden: 60 °C gedurende 1 uur, 95 °C gedurende 15 minuten en houd op 4 °C.</li>
	<li>Voeg de volgende reagentia rechtstreeks toe aan 2,5 μL van de gelyseerde worm met PCR-buis: 12,5 μL 2x PCR-mix met dNTPs, DNA-polymerase, MgCl2 en ladende kleurstof, 1 μL van 10 μM voorwaartse primer, 1 μL van 10 μM omgekeerde primer en steriel water tot 22,5 μL. Het totale volume van elke PCR-reactie is 25 μL. OPMERKING: In het geval van screening van meerdere F1-wormen, is het sneller en handiger om een PCR-mastermix te maken voor meerdere reacties en 22,5 μL van de mastermix toe te voegen aan elke lysisbuis.</li>
	<li>Stel PCR-reacties in op een thermocycler met de volgende voorwaarden: 95 °C gedurende 1 minuut, 35 cycli van 95 °C gedurende 15 s, 55 °C gedurende 15 s (optimaliseren voor elke primerset), 72 °C gedurende 1 minuut (optimaliseren voor elk doel-DNA)44. Houd de reacties op 4 °C.</li>
</ol>10. Beperking van de spijsvertering en elektroforese van agarosegel
OPMERKING: Een restrictieve vertering is alleen nodig tijdens het screenen op kleine bewerkingen (minder dan 50 bp).
<ol><li>Breng 10 μL van het PCR-DNA over van stap 9 naar een nieuwe buis.</li>
	<li>Voeg tussen 2 en 4 eenheden restrictie-enzym en 1x restrictie-enzymbuffer (1,5 μL 10x reactiebuffer) per 15 μL reactie toe.</li>
	<li>Incubeer bij 37 °C (of bij een andere enzymspecifieke temperatuur) gedurende 2 uur (kortere incubatietijden kunnen mogelijk zijn met snelwerkende enzymen).</li>
	<li>Warmte inactiveert de restrictieve verteer door de PCR-buizen gedurende 10 tot 15 minuten te verwarmen bij 65 °C (of een andere enzymspecifieke temperatuur).</li>
	<li>Laad de volledige reactie van elke PCR-buis in een enkele put van een 1% -2% agarose-gel en voer gel uit op 110 mA totdat de juiste bandscheiding is bereikt. OPMERKING: We gebruiken een PCR-mix die al een beladingskleurstof bevat voor visualisatie tijdens het draaien op een agarose-gel. Deze mix interfereert niet met de restrictieve verteringsreactie en is daarom handig om te gebruiken voor het screenen van veel wormen tegelijk.</li>
</ol>11. Identificeer positief bewerkte wormen
<ol><li>Visualiseer agarosegels onder UV-licht (voor ethidiumbromidegels) om DNA-bandgroottes te detecteren. OPMERKING: Positief bewerkte wormen zullen een extra BAND VAN DNA weergeven op de verwachte grootte als gevolg van bewerking met behulp van de reparatiesjabloon die de restrictieplaats op de gewenste locatie in het wormgenoom draagt. F 1-rolwormen zullen naar verwachting heterozygoot zijn voor de bewerking en zullen daarom naar verwachting drie banden vertonen (een wild-type ongesneden PCR-product en twee kleinere fragmenten van het bewerkte gesneden PCR-product). Hoewel zeldzaam, moet worden opgemerkt dat homozygoten af en toe voorkomen.</li>
	<li>Sla alle oorspronkelijke positief bewerkte platen op totdat de aanwezigheid van de bewerking is geverifieerd door Sanger-sequencing.</li>
</ol>12. Homozygose bewerking van belang
<ol><li>Kies tussen 8 en 12 wild uitziende niet-rollende F2-wormen uit de respectieve positief bewerkte F1 Rol-wormplaten en laat ze eieren leggen en nakomelingen produceren gedurende 1 tot 2 dagen. OPMERKING: Aangezien C. elegans zelfbevruchtende hermafrodieten zijn, moet het aandeel verwachte homozygote mutanten ongeveer 25% zijn als het bewerkte allel de levensvatbaarheid of ontwikkeling niet beïnvloedt. Niet-rollende F2-wormen moeten wild-type zijn voor de dpy-10-locus. Het plukken van niet-rollende wormen maakt het mogelijk om bewerkte wormen te genereren die de dpy-10 (cn64) mutatie hebben verloren en alleen de mutatie bij uw gen van belang hebben.<ol>
<li>Merk op dat het dpy-10 gen aanwezig is op chromosoom II. Als uw gen van belang is gekoppeld aan dpy-10,kunt u de dpy-10-mutatie mogelijk niet gemakkelijk scheiden van uw gen van belang.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voer stap 9 tot en met 11 uit om homozygote wormlijnen te identificeren.</li>
</ol>13. Bevestig de bewerking door sequencing
<ol><li>Zodra homozygote wormen zijn geïdentificeerd, voert u lysis en PCR uit zoals beschreven in stap 9.<ol>
<li>Stel ten minste 3 PCR-reacties in voor elke homozygote lijn die moet worden gesequenced.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zuiver de PCR-reacties met behulp van een PCR-zuiveringskit.</li>
	<li>Meet de DNA-concentratie met behulp van een nanodruppelspectrofotometer.</li>
	<li>Stuur een monster met de respectievelijke voorwaartse primer voor Sanger-sequencing. Zorg ervoor dat de voorwaartse primer is ontworpen om ten minste 50 bases verwijderd te zijn van de bewerking die moet worden gesequenced.</li>
	<li>Analyseer de sequencingresultaten met behulp van sequentieanalysesoftware om de aanwezigheid van de bewerking te bevestigen.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We hebben het bovenstaande protocol gebruikt om verschillende genen naast rbm-3.2 te bewerken. Onze bewerkingsefficiëntie voor verschillende loci, gids-RNA's en reparatiesjablonen (enkelstrengs en dubbelstrengs) varieerde tussen 2% en 58% (gegevens niet weergegeven). De waargenomen bewerkingsefficiënties zijn vergelijkbaar met de eerder gerapporteerde bewerkingsefficiënties van 2% tot 70% voor dit protocol27. We zijn ook succesvol geweest in het gebruik van deze techniek bij het maken van gendeleties. Met behulp van twee crRNA's hebben we een gen vervangen dat bijna 6 kb lang is door de coderende sequentie voor groen fluorescerend eiwit (GFP) (gegevens niet weergegeven). Voor dit experiment bleek ongeveer 14% van de Rol F1-wormen die werden geanalyseerd positief te zijn voor de gendeletie en vervanging door GFP (gegevens niet getoond). Er zijn echter aanvullende experimenten nodig om de maximale lengte van gendeleties en vervangingen te bepalen die met deze techniek kunnen worden uitgevoerd.
Deze techniek kan worden gebruikt om inserties te maken die ongeveer 1,6 kb lang zijn19. Een recente studie heeft aangetoond dat voor het maken van inserties die meer dan 1,6 kb lang zijn met behulp van dit protocol, het genereren van twee dubbelstrengsbreuken en het gebruik van reparatiesjablonen met langere homologiearmen de inbrenging van veel grotere DNA-fragmenten (~ 10 Kb) mogelijk kan maken28. Als alternatief kunnen meerdere rondes van genbewerking met dit protocol worden uitgevoerd om grotere bewerkingen te genereren. Andere op plasmide gebaseerde C. elegans CRISPR / Cas9-genbewerkingsprotocollen kunnen ook worden aangenomen voor CRISPR-experimenten waarbij DNA-fragmenten groter dan 1,6 kb46,47,48worden ingebracht.
Voordat u dit protocol voor genbewerking gebruikt, moet u ervoor zorgen dat het betreffende gen niet is gekoppeld aan de dpy-10-locus op chromosoom II. In het geval van een doelgen dat gekoppeld is aan dpy-10, kan het problematisch zijn om de dpy-10 mutatie weg te scheiden van uw bewerking van interesse. Daarom, in het geval dat het gen van belang is gekoppeld aan de dpy-10 locus, kunnen andere co-CRISPR-markers zoals unc-58 (X-chromosoom),unc-22 of zen-4 (chromosoom IV) en ben-1 of pha-1 (chromosoom III) die zich op verschillende chromosomen bevinden, worden gebruikt24,25,26,28. Gegevens van het Meyer-lab tonen aan dat ben-1- en zen-4-mutaties kunnen worden gebruikt als succesvolle co-CRISPR-markers voor screening met deze methode28. Het is echter belangrijk op te merken dat het gebruik van zen-4 en pha-1 als co-CRISPR-markers het uitvoeren van het CRISPR-experiment vereist in niet-wild-type zen-4 (cle10ts) of pha-1 (e2123ts) achtergronden respectievelijk26,28. Verder kunnen CRISPR-experimenten met sommige co-CRISPR-markers zoals ben-1 de bereiding van speciale platen vereisen (bijv. Platen met benzimidazol)28. We hebben met succes de unc-58 co-CRISPR-marker gebruikt om te screenen op positieve bewerkingen voor een gen dat is gekoppeld aan de dpy-10 met behulp van deze methode (gegevens niet weergegeven). De unc-58(e665) mutatie verleent een zichtbaar fenotype (verlamming) dat effectief kan worden gebruikt om te screenen op positief bewerkte wormen24. Als alternatief, als toegang tot een fluorescerende microscoop beschikbaar is, kan een fluorescerend getagd gtbp-1-gen ook worden gebruikt als co-CRISPR-marker voor dit protocol19.
Voor een hoge bewerkingsefficiëntie tijdens het gebruik van deze methode van genoombewerking, moet de bewerkingsplaats zich binnen 10 tot 30 basen van de Cas9-snijplaats liggen. Als de bewerkingssite meer dan 30 bases verwijderd is van de Cas9-snijsite, daalt de bewerkingsefficiëntie drastischmet 19,35,37. Een recente studie van het Meyer-lab heeft echter aangetoond dat het creëren van twee dubbelstrengsbreuken op afstand van elkaar het invoegen van bewerkingen ver weg van de Cas9-snijlocatie mogelijk kan maken met behulp van dit protocol28.
In het huidige protocol is de reparatiesjabloon zo ontworpen dat alle drie de ingevoegde stopcodons in hetzelfde leesframe verschijnen. Een alternatieve strategie om null-mutanten te maken zou echter zijn om een universele 43-basen lange knock-in STOP-IN cassette te gebruiken die eerder is beschreven50. Belangrijk is dat deze cassette stopcodons heeft in alle drie de mogelijke leesframes en frameshift-mutaties veroorzaakt. Dit is een bijzonder nuttige strategie voor het genereren van null-mutanten wanneer onjuiste of onvolledige reparatie plaatsvindt op de bewerkingssite.
Kortom, vanwege de korte duur en de recente vooruitgang in deze methode, is dit een uitstekende methode voor routinematige laboratoriumexperimenten met de toevoeging van korte immunogene epitooptags, fluorescerende tags, het maken van gendeleties, genvervangingen en codonsubstituties.

De Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/ Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) technologie maakt efficiënte gerichte genoombewerking mogelijk in een breed scala van organismen1,2,3,4. Het CRISPR-systeem werd voor het eerst ontdekt als onderdeel van een prokaryote antivirale immuunrespons5,6,7. Het Type II CRISPR-systeem maakt gebruik van een endonuclease zoals Cas9, een transactiverend RNA (tracrRNA) en een korte, doel-DNA-specifieke 20-nucleotide lange gids CRISPR-RNA (crRNA) om een "NGG" Protospacer Adjacent Motif (PAM) te herkennen en een dubbelstrengs breuk te maken in het doel-DNA5,6,7,8,9,10,11,12. Deze dubbelstrengs breuk wordt herkend als een laesie door de cellulaire DNA-reparatiemachinerie. Bijgevolg kan de gegenereerde dubbelstrengs breuk worden gerepareerd door een van de twee paden: i) Niet-homologe eindvoeging (NHEJ) of ii) Homologie-gerichte reparatie (HDR)13. NHEJ is vaak foutgevoelig en daarom, wanneer deze route wordt gebruikt om de dubbelstrengs breuk in het doel-DNA te repareren, veroorzaakt het vaak inactiverende mutaties (inserties, deleties) in het gen van belang. Aan de andere kant, door een exogene reparatiesjabloon te leveren met homologie aan weerszijden van de dubbelstrengsbreuk, kan de cellulaire DNA-reparatiemachinerie worden aangestuurd om HDR te gebruiken om de breuk te repareren13. De HDR-methode maakt dus nauwkeurige bewerking van elke locus van belang mogelijk.
Een verscheidenheid aan CRISPR / Cas9-genbewerkingsprotocollen zijn beschreven voor C. elegans14,15,16,17,18,19,20. De meest gebruikte CRISPR / Cas9-bewerkingsmethoden in C. elegans omvatten zowel op klonen gebaseerde als kloonvrije protocollen om reparatiesjablonen te genereren voor CRISPR / Cas9-bewerking14,15,16,17,18,19,20. Dit protocol bespreekt in detail een kloonvrij CRISPR/Cas9-bewerkingsprotocol op basis van het gebruik van dpy-10 als co-CRISPR-marker voor screening. Tot nu toe maakt het enige gedetailleerde C. elegans-gerichteCRISPR / Cas9-bewerkingsvideoprotocol dat bestaat gebruik van een fluorescerende marker voor screening21. Het gebruik van een fluorescerende marker voor screening vereist echter toegang tot een fluorescentiemicroscoop, die veel laboratoria bij kleine voornamelijk niet-gegradueerde instellingen (PUI's) moeilijk toegankelijk kunnen vinden. Het is bemoedigend om op te merken dat positieve correlatieve resultaten zijn verkregen in eerdere studies tussen wormen die fluorescerende markers dragen en de aanwezigheid van de edit21,22. Er zijn echter aanvullende studies nodig om de algehele efficiëntie van de op fluorescentie gebaseerde screeningsmethode te bepalen voor het bewerken van een breed scala aan loci met verschillende gids-RNA's en reparatiesjablonen. Ten slotte, aangezien de plasmiden die coderen voor deze fluorescerende markers extrachromosomale arrays vormen, wordt vaak variabele fluorescentie geproduceerd uit deze arrays die het moeilijk kunnen maken om positieven te identificeren23. Hoewel de op fluorescentie gebaseerde screeningsmethode nuttig kan zijn om toe te passen, kunnen de bovengenoemde problemen de toepasbaarheid ervan beperken.
Het gebruik van een co-CRISPR-marker die een zichtbaar fenotype produceert, vermindert het aantal nakomelingen dat moet worden gescreend om een positief bewerkte worm te vinden23,24,25,26,27,28. Belangrijk is dat de fenotypen die door deze markers worden geproduceerd, gemakkelijk kunnen worden gedetecteerd onder een eenvoudige ontleedmicroscoop23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. De dpy-10 co-CRISPR marker is een van de best gekarakteriseerde en meest gebruikte co-CRISPR markers voor het uitvoeren van C. elegans CRISPR/Cas9 genome editing24,27. Daarom zal dit artikel de methode bespreken voor het uitvoeren van CRISPR / Cas9-bewerking in C. elegans met behulp van de directe afgifte van ribonucleoproteïnecomplexen met dpy-10 als een co-CRISPR-marker27,35. In deze methode bestaat de voorbereide bewerkingsinjectiemix uit een goed gekarakteriseerd dpy-10 crRNA en dpy-10 reparatiesjabloon om de generatie van een waarneembaar dominant "roller" (Rol) fenotype te bemiddelen dat wordt verleend door een bekende heterozygote dpy-10 (cn64) mutatie binnen het dpy-10 gen24,27,29. Wanneer aanwezig in zijn homozygote toestand, veroorzaakt de dpy-10 (cn64) mutatie een dumpy (Dpy) fenotype dat kortere en stoutere wormen produceert24,29. Het Rol-fenotype wordt gemedieerd door de nauwkeurige invoeging van de gelijktijdig geleverde dpy-10-reparatiesjabloon in een enkele kopie van het dpy-10-gen door HDR-gemedieerde CRISPR / Cas9-bewerking. Daarom duidt het verschijnen van Rol C. elegans op een succesvolle injectie en een succesvolle HDR-gemedieerde bewerkingsgebeurtenis in de cellen van de geïnjecteerde worm. Aangezien het crRNA en het reparatiesjabloon van het doelgen van belang zich in dezelfde injectiemix bevinden met de dpy-10 crRNA en dpy-10 reparatiesjabloon, is de kans groot dat de geïdentificeerde Rol-wormen ook tegelijkertijd werden bewerkt op het doelgen van belang. Daarom worden deze Rol-wormen vervolgens gescreend op de bewerking van belang door technieken zoals polymerasekettingreactie (PCR) (voor bewerkingen groter dan 50 bp) of door PCR gevolgd door restrictieve vertering (voor bewerkingen minder dan 50 bp).
De voordelen van het gebruik van deze methode voor genoombewerking zijn: i) CRISPR-bewerkingen kunnen met deze methode met een relatief hoog rendement (2% tot 70%) worden gegenereerd27; ii) de reparatiesjablonen en geleideRNA's die bij deze methode worden gebruikt, omvatten geen klonen, waardoor de tijd die nodig is voor het genereren ervan wordt verkort; iii) door ribonucleoproteïnecomplexen in vitrote assembleren, kunnen de concentraties van de geassembleerde bewerkingscomplexen relatief constant worden gehouden, waardoor de reproduceerbaarheid wordt verbeterd; iv) van sommige gids-RNA's die geen bewerkingen genereren wanneer ze worden uitgedrukt uit plasmiden, is aangetoond dat ze werken voor CRISPR/Cas9-genoombewerking wanneer ze worden geleverd als in vitro getranscribeerde cRNA's27; v) het opnemen van de dpy-10 co-CRISPR-marker maakt eenvoudige screening met behulp van een ontleedmicroscoop mogelijk en vermindert het aantal nakomelingen dat moet worden gescreend om positieven te vinden24,27; en vi) DNA-sequencing geverifieerde homozygoot-bewerkte wormlijnen kan met deze methode worden verkregen binnen een paar weken19,27.
Uitstekende boekhoofdstukken met betrekking tot veel verschillende C. elegans CRISPR-methoden zijn gepubliceerd14,15,16,17,18,19,20,43. De demonstratie van de dpy-10 co-CRISPR-methode in een videoformaat in een laboratoriumomgeving ontbreekt momenteel echter. In dit artikel beschrijven en demonstreren we het proces van het gebruik van de dpy-10 co-CRISPR-methode om een representatief doelgen genaamd rbm-3.2 te bewerken, een vermeende RNA-bindende eiwit (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10).  In het bijzonder beschrijven we hier in detail de methode voor het introduceren van drie voortijdige stopcodons in het C. elegans rbm-3.2-gen met behulp van in vitro geassembleerde ribonucleoproteïnecomplexen en een exogene geleverde lineaire enkelstrengs reparatiesjabloon. Deze studies zijn succesvol geweest in het genereren van de eerste C. elegans CRISPR-stam met voortijdige stopcodons in het rbm-3.2-gen. Aangezien er momenteel niet veel bekend is over de functie van dit gen in C. elegans, zal deze stam dienen als een nuttig hulpmiddel bij het ontleden van de functie van RMB-3.2. Deze methode kan ook worden gebruikt om inserties, substituties en deleties te maken op elke locatie in het C. elegans-genoom.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Barcoded DNA sequencing tubes</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>SimpleSeq Kit Premixed</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein</td>
			<td>PNA Bio</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Lyophilized Cas9 protein was resuspended in 20%glycerol containing nuclease-free water, aliquoted and stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>crRNAs</td>
			<td>Horizon Discovery/ GE Dharmacon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Lyophilized crRNAs were resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td>Stored at -30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minelute PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>Spin columns stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyTaq Redmix</td>
			<td>Meridian Bioscience</td>
			<td>BIO-25043</td>
			<td>Stored at -30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard 20 nmol oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>P-480-SL4</td>
			<td>Stored at -30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repair template oligos</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>4 nmol Ultramer oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tracrRNA</td>
			<td>Horizon Discovery/ GE Dharmacon</td>
			<td>U-002005-50</td>
			<td>Lyophilized tracrRNA was resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 editing of the c. elegans rbm-3.2 gene using the dpy-10 co-crispr screening marker and assembled ribonucleoprotein complexes.

Het bacteriële Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) systeem is door onderzoekers gebruikt om belangrijke biologisch relevante problemen te bestuderen. De ongeëvenaarde kracht van de CRISPR/Cas-genoombewerkingsmethode stelt onderzoekers in staat om elke locus van hun keuze nauwkeurig te bewerken, waardoor een beter begrip van de genfunctie wordt vergemakkelijkt. Verschillende methoden voor het bewerken van het C. elegans-genoom door CRISPR / Cas9 zijn eerder beschreven. Hier bespreken en demonstreren we een methode die gebruik maakt van in vitro geassembleerde ribonucleoproteïnecomplexen en de dpy-10 co-CRISPR-marker voor screening. In dit artikel gaan we specifiek door het stapsgewijze proces van het introduceren van voortijdige stopcodons in het C. elegans rbm-3.2-gen door homologiegerichte reparatie met behulp van deze methode van CRISPR / Cas9-bewerking. Deze relatief eenvoudige bewerkingsmethode kan worden gebruikt om de functie van elk interessant gen te bestuderen en maakt het mogelijk om homozygoot-bewerkte C. elegans te genereren door CRISPR / Cas9-bewerking in minder dan twee weken.

rbm-3.2 is een vermeend RNA-bindend eiwit dat homologie heeft aan de menselijke splitsingsstimulatiefactor subeenheid 2 tau-variant (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10). Het RBM-3.2-eiwit werd geïdentificeerd als een bindende partner van Protein Phosphatase 1 (GSP-1) en zijn regulatoren Inhibitor-2 (I-2SZY-2) en SDS-22 in een eerdere studie die deze eiwitten identificeerde als nieuwe regulatoren van C. elegans centriole duplicatie (gegevens niet getoond)45. Momenteel is er zeer weinig bekend over de functie van het rbm-3.2 gen in C. elegans. Daarom, om de biologische rol van het C. elegans rbm-3.2-gen verder te onderzoeken, werd het rbm-3.2-nul-allel rbm-3.2 (ok688) verkregen van het Caenorhabditis Genetics Center (CGC). 
Helaas, naast het bezit van een deletie van het gehele rbm-3.2 gen, resulteert het rbm-3.2 (ok688) allel ook in een gedeeltelijke deletie van een overlappend gen, rbm-3.1, waardoor genetische analyse wordt bemoeilijkt. Om de rol van het rbm-3.2-gen in C. elegans nauwkeurig te onderzoeken, gebruikten we CRISPR / Cas9-bewerking om drie voortijdige stopcodons zeer dicht bij het begin van het C. elegans rbm-3.2-coderende gebied te introduceren, waardoor het overlappende rbm-3.1-gen intact bleef.
Om deze voortijdige stopcodons in het C. elegans rbm-3.2-gen te introduceren, ontwierpen we een crRNA met een PAM-motief dat zich op de tegenovergestelde streng (sjabloonstreng) van DNA bevond (Figuur 1A). De Cas9 cut site bevond zich op 6 bases afstand van de rbm-3.2 start codon ATG. Om voortijdige stopcodons in het rbm-3.2-gen te introduceren, hebben we een reparatiesjabloon ontworpen met de volgende vijf belangrijke kenmerken: 1) 35 basen van ononderbroken homologie tot rbm-3.2 stroomopwaarts van het rbm-3.2 startcodon (linker homologiearm) 2) Een kort stuk basen met het PAM-motief werd verwijderd 3) Een EcoRI-restrictieplaats werd onmiddellijk na het startcodon geïntroduceerd voor screening 4) De tweede en de derde codons van rbm-3.2 werden verwijderd en drie stopcodons werden geïntroduceerd na de vijfde RBM-3.2 codon om de translatie van de rbm-3.2 mRNA 5 te stoppen) 35 basen van ononderbroken homologie naar het eerste intron van rbm-3.2 werden stroomafwaarts van de edit opgenomen (rechter homologiearm) ( Figuur1B).
De injectiemix voor dit CRISPR-experiment werd bereid zoals aangegeven in tabel I. Het injectiemengsel werd gedurende 15 minuten geïncubeerd bij 37 °C om ribonucleoproteïnecomplexen samen te stellen. Het mengsel werd vervolgens gecentrifugeerd en in de getrokken micro-injectiefaald geladen. Micro-injectie in de C. elegans gonade werd uitgevoerd zoals beschreven in Iyer et al. 201943.
Figuur 2 toont de experimentele tijdlijn voor het genereren van bewerkte C. elegans met behulp van dit protocol. Hoewel we meestal 30 wormen injecteren voor elk CRISPR-experiment, injecteren sommige laboratoria minder wormen (tussen 10 en 20) voor elk CRISPR-experiment. Omdat het injecteren van meer wormen de kans op het vinden van positieve bewerkingen verhoogt, geven we er de voorkeur aan om een groter aantal wormen te injecteren. Veel laboratoria kiezen "jackpot" broedsels (platen met meer dan 50% Rol en Dpy nakomelingen) voor screening. In onze ervaring na het uitvoeren van verschillende CRISPR-experimenten, hoewel jackpotbroed af en toe voorkomt, een meerderheid van de keren, komen de Rolwormen die worden geplukt voor screening vaak van veel verschillende P0-platen, elk bestaande uit een paar Rol-nakomelingen. In dit experiment werden geen jackpotbroedsels verkregen.
In totaal screenden we het genomische DNA van 73 F1 Rol-wormen die werden verkregen uit 7 geïnjecteerde P0-wormen op de aanwezigheid van de bewerking. De sequenties van de screeningsprimers en hun locaties ten opzichte van het startcodon van het rbm-3.2-gen zijn weergegeven in figuur 3A. Door onze analyse bleken 7 van de 73 F1-wormen positief te zijn voor de bewerking (9,5%) ( figuur3B). Onbewerkte wormen vertoonden een enkel DNA-fragment van 445 bp bij EcoRI-vertering. Terwijl wormen met een voortijdig stopcodon in het rbm-3.2-gen twee fragmenten van respectievelijk 265 bp en 166 bp vertoonden bij EcoRI-vertering. Heterozygote wormen vertoonden drie fragmenten bij EcoRI-vertering: een wild-type onbewerkt DNA-fragment van 445 bp en twee DNA-fragmenten van respectievelijk 265 bp en 166 bp van de bewerkte kopie van het rbm-3.2-gen. 
Om wormen met homozygote bewerkingen te identificeren, hebben we 12 F2-wormen van de geïdentificeerde positieve F 1-heterozygoten op nieuwe individuele platen overgebracht en hen in staat gesteld nakomelingen te produceren (F3). De F2-wormen werden vervolgens gescreend op homozygositeit zoals eerder beschreven. 6 van de 12 (50%) gescreende wormen bleken homozygoot te zijn voor onze bewerking van interesse (Figuur 4A). Het genomische DNA van een geïdentificeerde homozygote wormlijn werd gebruikt om een DNA-sequencingreactie op te zetten. DNA-sequencinganalyse bevestigde de aanwezigheid van de edit in zijn homozygote toestand (Figuur 4B). Over het algemeen is het gunstig om meerdere homozygote wormlijnen te sequencen om ervoor te zorgen dat alle homozygoot bewerkte wormlijnen hetzelfde fenotype vertonen (als de nulmutatie een specifiek fenotype produceert). Verder kan het ook nodig zijn om gen knock-outs te valideren met behulp van een op expressie gebaseerde test zoals western blotting of RT-PCR of via fenotype-analyse. Dit komt omdat het mogelijk is dat, ondanks het introduceren van voortijdige stopcodons aan het begin van het gen, een alternatieve ATG aanwezig kan zijn stroomafwaarts van de voortijdige stopcodons. Deze ATG kan worden gebruikt om eiwitexpressie te initiëren, wat resulteert in een gedeeltelijk functioneel afgekapt eiwit.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Concentratie</td>
			<td>Volume om toe te voegen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cas9-eiwit in nucleasevrij water met 20% glycerol</td>
			<td>2 μg/μL</td>
			<td>5 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>tracrRNA in 5 mM Tris-Cl pH 7,5</td>
			<td>4 μg/μL</td>
			<td>5 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>
dpy-10 crRNA in 5 mM Tris-Cl pH 7,5</td>
			<td>8 μg/μL</td>
			<td>0,4 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>
rbm-3,2 crRNA in 5 mM Tris-Cl pH 7,5</td>
			<td>8 μg/μL</td>
			<td>1 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>
dpy-10 reparatie sjabloon in steriel nuclease-vrij water</td>
			<td>500 ng/μL</td>
			<td>0,55 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>
rbm-3.2 reparatie sjabloon in steriel nucleasevrij water</td>
			<td>1 μg/μL</td>
			<td>2,2 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl in steriel nucleasevrij water</td>
			<td>1 meter</td>
			<td>0,5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>steriel nucleasevrij water</td>
			<td>-</td>
			<td>5,35 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Componenten van de injectiemix voor CRISPR/Cas9-bewerking met ribonucleoproteïnecomplexen en dpy-10 als co-CRISPR-marker. Gebruik steriele technieken en RNase-vrije reagentia tijdens het maken van de injectiemix. Houd er rekening mee dat steriel, niet-DEPC-behandeld nucleasevrij water werd gebruikt om het injectiemengsel te maken.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Concentratie</td>
			<td>Volume om toe te voegen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>1 meter</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-HCl pH 8,3</td>
			<td>1 meter</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>1 meter</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>NP-40 (of IGEPAL CA-630)</td>
			<td>100%</td>
			<td>450 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tween-20</td>
			<td>100%</td>
			<td>450 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gelatine</td>
			<td>2%</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Water</td>
			<td>-</td>
			<td>92,35 ml</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Wormlysis buffer recept. De wormlysisbuffer kan in bulk worden gemaakt, geautoclaveerd, gefilterd en gealiquoteerd voor langdurige opslag (OPMERKING: de lysisbuffer kan meer dan een jaar bij kamertemperatuur worden bewaard). Voeg vlak voor elk gebruik een verdunning van 1:100 van 20 mg/ml proteïnase K toe aan de wormlysisbuffer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62001/62001fig1v2.jpg"> Figuur 1: Schematisch met crRNA en reparatiesjabloonontwerp voor rbm-3.2 voortijdige stop CRISPR. A. Schematiek met de coderende en sjabloonstrengen van het rbm-3.2-gen met de crRNA-sequentie en de PAM-motiefsequentie op de sjabloonstreng. B. Schematisch dat de verschillende kenmerken weergeeft van het reparatiesjabloon dat werd gesynthetiseerd om drie voortijdige stopcodons in het rbm-3.2-gen te introduceren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62001/62001fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62001/62001fig02.jpg"> Figuur 2: Experimentele tijdlijn voor het genereren van homozygoot bewerkte C. elegans door CRISPR/Cas9 editing met behulp van voorgemonteerde ribonucleoproteïne complexen en dpy-10 als co-CRISPR marker. Een dagelijkse uitsplitsing van de stappen die moeten worden uitgevoerd om homozygoot bewerkte C. elegans te genereren met behulp van deze methode van CRISPR / Cas9-bewerking. In het kort werden 30 wormen geïnjecteerd met de CRISPR-bewerkingsmix met behulp van micro-injectie en gescheiden op individuele MYOB-platen gezaaid met OP50 E. coli. Na 24 uur werden de geïnjecteerde P0-wormen overgebracht op verse nieuwe MYOB-platen en mochten ze doorgaan met het leggen van eieren. Op dag 3 en 4 na micro-injectie werden de platen onderzocht op de aanwezigheid van Rol F1-wormen. De platen met het maximale aantal Rol- en Dpy F1-wormen werden geselecteerd en 73 F1 Rol-wormen (we kiezen meestal tussen de 50 en 100 F1 Rolwormen per CRISPR-experiment) werden op nieuwe individuele MYOB-platen (1 worm per plaat) gekieperd en mochten ongeveer 2 dagen eieren leggen. Op dag 6 na micro-injectie werden wormlysaten bereid uit de F1-wormen die nakomelingen hadden geproduceerd (F2) en werden ze gescreend op de aanwezigheid van de bewerking door PCR gevolgd door restrictieve vertering met EcoRI en agarose gel-elektroforese. Op dag 7 werden 12 niet-Rol, niet-Dpy F2 wormen van de positieve platen overgebracht naar nieuwe individuele platen en mochten nakomelingen produceren (F3). Op dag 9 werden de F2-wormen gescreend op homozygositeit van de bewerking zoals eerder beschreven. Op dag 10 werden wormlysis, PCR en PCR-opruiming uitgevoerd voor de homozygote F3-wormen en werd de DNA-concentratie gemeten met behulp van een NanoDrop-spectrofotometer. Op dag 11 werden Sanger-sequencingreacties opgezet voor positieve monsters en de reacties werden verzonden voor DNA-sequencing. Op dag 12 werden de sequencingresultaten geanalyseerd en werd de aanwezigheid van de bewerking geverifieerd met behulp van een sequentieanalysesoftware (bijv. CLC-sequentieviewer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62001/62001fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62001/62001fig03.jpg"> Figuur 3: Screening op C. elegans die heterozygoot zijn voor de rbm-3.2 voortijdige stopcodons. Agarose gel elektroforese beelden van C. elegans genomisch PCR DNA verteerd met EcoRI. 73 individuele F1-wormen werden gegenotypeerd en gescreend op de aanwezigheid van de rbm-3.2-bewerking. Rode cijfers en sterretjes geven positief bewerkte wormen aan. Alle 7 geïdentificeerde positief bewerkte C. elegans waren heterozygoot voor de bewerking omdat ze één wild-type onbewerkt DNA-fragment van 445 bp en twee DNA-fragmenten van respectievelijk 265 bp en 166 bp vertoonden van de bewerkte kopie van het rbm-3.2-gen bij EcoRI-spijsvertering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62001/62001fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62001/62001fig04.jpg"> Figuur 4: Identificatie en verificatie van homozygoot bewerkte C. elegans die de rbm-3.2 voortijdige stopcodons dragen. Een. Screening op C. elegans die homozygoot zijn voor de rbm-3.2 voortijdige stopcodons. Agarose gel elektroforese beelden van C. elegans genomisch DNA verteerd met EcoRI. 12 individuele F2-wormen van positieve platen werden gegenotypeerd en gescreend op homozygositeit van de rbm-3.2-bewerking. Rood: homozygoot bewerkte wormen. 6 van de 12 gescreende F2-wormen (50%) waren homozygoot voor de rbm-3.2 voortijdige stopcodons. Er was geen PCR-product aanwezig voor worm 7. B. Bevestiging van het inbrengen van de voortijdige stopcodons in rbm-3.2 door DNA-sequencing. Schema dat de vergelijking van DNA- en eiwitsequenties van onbewerkte en bewerkte homozygoten weergeeft. Analyse van DNA-sequencingresultaten van genomisch DNA van homozygote wormen bevestigde de aanwezigheid van de drie voortijdige stopcodons in het rbm-3.2-gen bij CRISPR / Cas9-bewerking. Alle resulterende aminozuurveranderingen na CRISPR /Cas9-bewerking worden aangegeven in rode letters of rode sterretjes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62001/62001fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes. at JoVE.com

CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

Het doel van dit protocol is om naadloze CRISPR/Cas9-bewerking van het C. elegans-genoom mogelijk te maken met behulp van geassembleerde ribonucleoproteïnecomplexen en de dpy-10 co-CRISPR-marker voor screening. Dit protocol kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan genetische modificaties in C. elegans te maken, waaronder inserties, deleties, genvervangingen en codonsubstituties.

CRISPR/Cas9 Editing van het C. elegans rbm-3.2 Gen met behulp van de dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker en Geassembleerde Ribonucleoproteïne Complexen.

The bacterial Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) system has been ...

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping en CRISPR / Cas9 Editing om een ​​Drug Resistance Gene te identificeren<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Selectieafhankelijke en onafhankelijke generatie van CRISPR / Cas9-gemedieerde Gene Knockouts in zoogdiercellen

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Een standaard methodiek te onderzoeken ter plaatse mutageniteit als een functie van punt mutatie reparatie gekatalyseerd door CRISPR/Cas9 en SsODN in menselijke cellen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection van CRISPR/Cas9 eiwit in Channel Catfish, Ictalurus punctatus, embryo's voor Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Een snelle en Facile pijpleiding voor het genereren van Genomic punt mutanten in C. elegans met behulp van CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene bewerken te maken voorwaardelijke mutanten van menselijke malariaparasiet P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

SCHERPEr/Cas9 Ribonucleoproteã-gemedieerde nauwkeurige Gene bewerking door buis Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introductie van een gen knock-out direct in het Amastigote stadium van Trypanosoma cruzi met behulp van het crispr/Cas9 systeem

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generatie van gedefinieerde genomische modificaties met CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Onderzoek naar de transcriptionele rol van een RUNX1 Intronic geluiddemper door crispr/Cas9 Ribonucleoprotein in acute myeloïde leukemie cellen

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...