Name: crispr/cas9 editing of the c. elegans rbm-3.2 gene using the dpy-10 co-crispr screening marker and assembled ribonucleoprotein complexes.
Uploaded: 2020-12-11T14:00:00
Duration: 7 min 46 s
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इस काम को यूनिवर्सिटी ऑफ तुलसा (टीयू) स्टार्ट-अप फंड्स और टीयू फैकल्टी डेवलपमेंट समर फेलोशिप ने ज्योति अय्यर को सम्मानित किया । हम इस अध्ययन में शामिल छात्रों को वजीफे देने के लिए रसायन विज्ञान ग्रीष्मकालीन स्नातक अनुसंधान कार्यक्रम (CSURP) और तुलसा स्नातक अनुसंधान चैलेंज (TURC) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम सुश्री कैरोलीन डन को उनकी तकनीकी सहायता के लिए स्वीकार करना चाहेंगे । अंत में, हम डीआरएस जॉर्डन वार्ड, Aimee जारामिलो-लैम्बर्ट, अन्ना एलन, रॉबर्ट शेफ, विलियम पॉटर और सैली मोघे को इस पांडुलिपि पर उनकी आलोचनात्मक टिप्पणियों के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं ।

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

हमने आरबीएम-3.2 के अलावा कई जीन को संपादित करने के लिए उपरोक्त प्रोटोकॉल का उपयोग किया है। विभिन्न लोकी, गाइड आरएनए और मरम्मत टेम्पलेट्स (एकल-फंसे और डबल-फंसे) के लिए हमारी संपादन क्षमता 2% और 58% (डेटा नहीं दिखाए गए) के बीच भिन्न है। मनाया संपादन क्षमता इस प्रोटोकॉल27के लिए 2% से 70% की पहले से सूचित संपादन क्षमता के बराबर हैं। हम जीन विलोपन बनाने में भी इस तकनीक का इस्तेमाल करने में सफल रहे हैं । दो crRNAs का उपयोग करके हमने एक जीन को बदल दिया जो हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) (डेटा नहीं दिखाए गए) के लिए कोडिंग अनुक्रम के साथ लंबाई में 6 केबी के करीब है। इस प्रयोग के लिए, विश्लेषण किए गए रोल एफ 1 कीड़े के बारे में14% जीएफपी (डेटा नहीं दिखाए गए) के साथ जीन विलोपन और प्रतिस्थापन के लिए सकारात्मक पाए गए। हालांकि, इस तकनीक का उपयोग करके किए जा सकने वाले जीन विलोपन और प्रतिस्थापन की अधिकतम लंबाई निर्धारित करने के लिए अतिरिक्त प्रयोगों की आवश्यकता होती है।
इस तकनीक का उपयोग उन प्रविष्टियों को बनाने के लिए किया जा सकता है जो 19 लंबाई में लगभग1.6किलो हैं। हाल के एक अध्ययन से पता चला है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके लंबाई में 1.6 केबी से अधिक हैं, दो डबल-स्ट्रैंड ब्रेक उत्पन्न करने और लंबे समय तक होमोलॉजी हथियारों के साथ मरम्मत टेम्पलेट्स का उपयोग करने से डीएनए के बहुत बड़े टुकड़ों (~ 10 केबी)28के सम्मिलन को सक्षम किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, इस प्रोटोकॉल के साथ जीन संपादन के कई दौर बड़े संपादन उत्पन्न करने के लिए किए जा सकते हैं। अन्य प्लाज्मिड आधारित सी एलिगेंस CRISPR/Cas9 जीन संपादन प्रोटोकॉल भी CRISPR प्रयोगों के लिए अपनाया जा सकता है जिसमें १.६ केबी४६, ४७,४८से बड़े डीएनए टुकड़ों के सम्मिलन शामिल हैं ।
जीन संपादन के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने से पहले, यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि ब्याज का जीन गुणसूत्र II पर डीपीवाई-10 लोकस से जुड़ा हुआ नहीं है। एक लक्ष्य जीन को डीपीवाई-10से जोड़ा जा रहा है, यह डीपीवाई-10 उत्परिवर्तन को आपके ब्याज के संपादन से दूर अलग करने के लिए समस्याग्रस्त हो सकता है । इसलिए, इस घटना में कि ब्याज का जीन डीपीवाई-10 लोकस से जुड़ा हुआ है, अन्य सह-CRISPR मार्कर जैसे यूएनसी-58 (एक्स-क्रोमोसोम),अनसी-22 या जेन-4 (गुणसूत्रIV), और बेन-1 या पीएच-1 (गुणसूत्र III) जो विभिन्न गुणसूत्रों पर स्थितहैं,का उपयोग24,25, 26,28किया जा सकता है। मेयेर लैब के डेटा से पता चलता है कि बेन-1 और ज़ेन-4 म्यूटेशन को इस विधि28के साथ स्क्रीनिंग के लिए सफल सह-CRISPR मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सह-CRISPR मार्कर के रूप में ज़ेन-4 और पीएच-1 का उपयोग करने के लिए क्रमशः26,28गैर-जंगली प्रकार के ज़ेन-4 (cle10ts) या पीएच-1 (e2123ts) पृष्ठभूमि में CRISPR प्रयोग करने की आवश्यकता होती है । इसके अलावा, बेन-1 जैसे कुछ सह-CRISPR मार्कर से जुड़े CRISPR प्रयोगों के लिए विशेष प्लेटों (जैसे बेंजिमिडाजोल युक्त प्लेटें)28की तैयारी की आवश्यकता हो सकती है। हमने इस विधि (डेटा नहीं दिखाए गए) का उपयोग करके डीपी-10 से जुड़े जीन के लिए सकारात्मक संपादन के लिए स्क्रीन करने के लिए यूएनसी-58 सह-CRISPR मार्कर का सफलतापूर्वक उपयोग किया है। यूएनसी-58 (e665) उत्परिवर्तन एक दृश्यमान फेनोटाइप (पक्षाघात) प्रदान करता है जिसका प्रभावी रूप से सकारात्मक रूप से संपादित कीड़े24के लिए स्क्रीन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, यदि फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप तक पहुंच उपलब्ध है, तो फ्लोरोसेंट रूप से टैग किए गए जीटीबीपी-1 जीन का उपयोग इस प्रोटोकॉल19के लिए सह-CRISPR मार्कर के रूप में भी किया जा सकता है।
जीनोम संपादन की इस विधि का उपयोग करते समय एक उच्च संपादन दक्षता के लिए, संपादन साइट Cas9 काटने साइट से 10 से 30 ठिकानों के भीतर होना चाहिए। यदि संपादन स्थल Cas9 कटिंग साइट से 30 से अधिक आधार दूर है, तो संपादन दक्षता19,35, 37से काफी कम होजातीहै। हालांकि, मेयेर लैब के एक हालिया अध्ययन से पता चला है कि एक-दूसरे से दूरी पर दो डबल-स्ट्रैंड ब्रेक बनाने से इस प्रोटोकॉल28का उपयोग करके Cas9 कट साइट से दूर संपादन की प्रविष्टि को सक्षम किया जा सकता है।
वर्तमान प्रोटोकॉल में, मरम्मत टेम्पलेट को डिजाइन किया गया था ताकि तीनों डाला गया स्टॉप कोडन एक ही रीडिंग फ्रेम में दिखाई दें। हालांकि, नल-म्यूटेंट बनाने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति एक सार्वभौमिक ४३-कुर्सियां लंबी दस्तक में स्टॉप-इन कैसेट का उपयोग करना होगा जिसे पहले५०वर्णित किया गया है । महत्वपूर्ण बात, इस कैसेट सभी तीन संभव पढ़ने के फ्रेम में codons बंद कर दिया है और फ्रेमशिफ्ट म्यूटेशन का कारण बनता है । यह संपादित स्थल पर अनुचित या अपूर्ण मरम्मत होने पर शून्य-म्यूटेंट उत्पन्न करने के लिए एक विशेष रूप से उपयोगी रणनीति है।
अंत में, इसकी छोटी अवधि और इस विधि में हाल की प्रगति के कारण, यह नियमित प्रयोगशाला प्रयोगों के लिए एक उत्कृष्ट विधि है जिसमें लघु इम्यूनोजेनिक एपिटोप टैग, फ्लोरोसेंट टैग, जीन विलोपन, जीन प्रतिस्थापन और कोडन प्रतिस्थापन शामिल हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Barcoded DNA sequencing tubes</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>SimpleSeq Kit Premixed</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein</td>
			<td>PNA Bio</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Lyophilized Cas9 protein was resuspended in 20%glycerol containing nuclease-free water, aliquoted and stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>crRNAs</td>
			<td>Horizon Discovery/ GE Dharmacon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Lyophilized crRNAs were resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td>Stored at -30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minelute PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>Spin columns stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyTaq Redmix</td>
			<td>Meridian Bioscience</td>
			<td>BIO-25043</td>
			<td>Stored at -30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard 20 nmol oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>P-480-SL4</td>
			<td>Stored at -30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repair template oligos</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>4 nmol Ultramer oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tracrRNA</td>
			<td>Horizon Discovery/ GE Dharmacon</td>
			<td>U-002005-50</td>
			<td>Lyophilized tracrRNA was resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 editing of the c. elegans rbm-3.2 gene using the dpy-10 co-crispr screening marker and assembled ribonucleoprotein complexes.

जैविक रूप से प्रासंगिक महत्वपूर्ण समस्याओं का अध्ययन करने के लिए शोधकर्ताओं द्वारा नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट(CRISPR)/स्ट्रेप्टोकोकस पायोजीन्स CRISPR-संबद्ध प्रोटीन (कैस) प्रणाली का उपयोग किया गया है । CRISPR/कैस जीनोम संपादन विधि की अद्वितीय शक्ति शोधकर्ताओं को ठीक से उनके चयन के किसी भी लोकस को संपादित करने की अनुमति देता है, जिससे जीन समारोह की वृद्धि की समझ की सुविधा । CRISPR/Cas9 द्वारा सी एलिगेंस जीनोम के संपादन के लिए कई तरीकों को पहले वर्णित किया गया है । यहां, हम एक विधि पर चर्चा और प्रदर्शन करते हैं जो स्क्रीनिंग के लिए विट्रो असेंबल रिबोन्यूक्लिकोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स और डीपीवाई-10 सह-CRISPR मार्कर का उपयोग करता है। विशेष रूप से, इस लेख में, हम CRISPR/Cas9 संपादन की इस विधि का उपयोग करते हुए होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत द्वारा सी एलिगेंस आरबीएम-3.2 जीन में समय से पहले स्टॉप कोडन शुरू करने की चरण-दर-चरण प्रक्रिया से गुजरते हैं। इस अपेक्षाकृत सरल संपादन विधि का उपयोग ब्याज के किसी भी जीन के कार्य का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है और दो सप्ताह से भी कम समय में CRISPR/Cas9 संपादन द्वारा होमोज़िगस-संपादित सी एलिगेंस की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है ।

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CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य सी एलिगेंस जीनोम के निर्बाध CRISPR/Cas9 संपादन को इकट्ठे राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स और स्क्रीनिंग के लिए डीपीवाई-10 सह-CRISPR मार्कर का उपयोग करके सक्षम करना है । इस प्रोटोकॉल का उपयोग सी एलिगेंस में विभिन्न प्रकार के आनुवंशिक संशोधनों को करने के लिए किया जा सकता है जिसमें सम्मिलन, विलोपन, जीन प्रतिस्थापन और कोडन प्रतिस्थापन शामिल हैं।

CRISPR/Cas9 सी Elegans आरबीएम-३.२ जीन के संपादन dpy-10 सह CRISPR स्क्रीनिंग मार्कर और इकट्ठे Ribonucleoprotein परिसरों का उपयोग कर ।

The bacterial Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) system has been ...

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

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