Name: crispr/cas9 editing of the c. elegans rbm-3.2 gene using the dpy-10 co-crispr screening marker and assembled ribonucleoprotein complexes.
Uploaded: 2020-12-11T14:00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes. at JoVE.com

Эта работа была поддержана стартовыми фондами Университета Талсы (TU) и летней стипендией TU Faculty Development Summer Fellowship, присужденной Джоти Айер. Мы хотели бы поблагодарить Летнюю исследовательскую программу бакалавриата по химии (CSURP) и Tulsa Undergraduate Research Challenge (TURC) за присуждение стипендий студентам, участвующим в этом исследовании. Мы хотели бы выразить признательность г-же Кэролайн Данн за ее техническую помощь. Наконец, мы хотели бы поблагодарить докторов Джордана Уорда, Эйми Харамильо-Ламберт, Анну Аллен, Роберта Шиффа, Уильяма Поттера и Сайли Моге за их критические комментарии к этой рукописи.

Авторам нечего раскрывать.

Мы использовали вышеупомянутый протокол для редактирования нескольких генов, помимо rbm-3.2. Эффективность редактирования для различных локусов, направляющих РНК и шаблонов восстановления (одноцепочечных и двухцепочечных) варьировалась от 2% до 58% (данные не показаны). Наблюдаемая эффективность редактирования сопоставима с ранее сообщенной эффективностью редактирования от 2% до 70% для данного протокола27. Мы также успешно использовали эту технику в делеции генов. Используя две crРНК, мы заменили ген длиной около 6 кб кодирующей последовательностью для зеленого флуоресцентного белка (GFP) (данные не показаны). Для этого эксперимента около 14% проанализированных червей RolF1 оказались положительными для делеции генов и замены GFP (данные не показаны). Однако необходимы дополнительные эксперименты для определения максимальной длины делеций генов и замен, которые могут быть выполнены с использованием этой методики.
Этот метод может быть использован для изготовления вставок длиной около 1,6 кб19. Недавнее исследование показало, что для создания вставок длиной более 1,6 КБ с использованием этого протокола, генерация двух двухцепочечных разрывов и использование шаблонов восстановления с более длинными гомологическими плечами может позволить вставлять гораздо большие фрагменты ДНК (~ 10 Кб)28. В качестве альтернативы, несколько раундов редактирования генов с помощью этого протокола могут быть выполнены для генерации более крупных изменений. Другие протоколы редактирования генов CRISPR/Cas9 на основе плазмид также могут быть приняты для экспериментов CRISPR, включающих вставку фрагментов ДНК размером более 1,6 кб46,47,48.
Прежде чем использовать этот протокол для редактирования генов, необходимо убедиться, что интересующие гены не связаны с локусом dpy-10 на хромосоме II. В случае, если ген-мишень связан с dpy-10,может быть проблематично отделить мутацию dpy-10 от интересующих вас правок. Следовательно, в случае, если интересуящий ген связан с локусом dpy-10, другие маркеры co-CRISPR, такие как unc-58 (X-хромосома),unc-22 или zen-4 (хромосомаIV) и ben-1 или pha-1 (хромосома III), которые расположены на разных хромосомах, могут быть использованы24,25,26,28. Данные лаборатории Мейера демонстрируют, что мутации бен-1 и дзен-4 могут быть использованы в качестве успешных маркеров co-CRISPR для скрининга с помощью этого метода28. Тем не менее, важно отметить, что использование zen-4 и pha-1 в качестве маркеров co-CRISPR требует проведения эксперимента CRISPR на фонах zen-4 (cle10ts) или pha-1(e2123ts) без дикого типа соответственно26, 28. Кроме того, эксперименты CRISPR с участием некоторых маркеров co-CRISPR, таких как бен-1, могут потребовать подготовки специальных пластин (например, пластин, содержащих бензимидазол)28. Мы успешно использовали маркер unc-58 co-CRISPR для скрининга положительных изменений для гена, который связан с dpy-10 с помощью этого метода (данные не показаны). Мутация unc-58(e665) дает видимый фенотип (паралич), который может быть эффективно использован для скрининга положительно отредактированных червей24. Альтернативно, если доступ к флуоресцентному микроскопу доступен, ген gtbp-1 с флуоресцентной меткой также может быть использован в качестве маркера co-CRISPR для этого протокола19.
Для высокой эффективности редактирования при использовании этого метода редактирования генома сайт редактирования должен находиться в пределах от 10 до 30 оснований от сайта резки Cas9. Если сайт редактирования находится на более чем 30 базах от сайта резки Cas9, эффективность редактирования резко падаетна 19,35,37. Тем не менее, недавнее исследование, проведенное в лаборатории Мейера, показало, что создание двух двухцепочечных разрывов на расстоянии друг от друга может позволить вставлять правки далеко от сайта резки Cas9 с использованием этого протокола28.
В текущем протоколе шаблон восстановления был разработан таким образом, чтобы все три вставленных стоп-кодона отображались в одном кадре чтения. Тем не менее, альтернативной стратегией создания нулевых мутантов было бы использование универсальной 43-базовой длинной кассеты STOP-IN, которая была описанаранее 50. Важно отметить, что эта кассета имеет стоп-кодоны во всех трех возможных кадрах чтения и вызывает мутации сдвига кадра. Это особенно полезная стратегия для генерации нулевых мутантов, когда на сайте редактирования происходит неправильное или неполное восстановление.
В заключение, благодаря своей короткой продолжительности и последним достижениям в этом методе, это отличный метод для рутинных лабораторных экспериментов, включающих добавление коротких иммуногенных эпитопных меток, флуоресцентных меток, проведение делеций генов, замен генов и замен кодонов.

Технология Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR) / Streptococcus pyogenes CRISPR-ассоциированный белок (Cas) обеспечивает эффективное целенаправленное редактирование генома в широком спектре организмов1,2,3,4. Система CRISPR была впервые обнаружена как часть прокариотического противовирусного иммунного ответа5,6,7. Система CRISPR типа II использует эндонуклеазу, такую как Cas9, трансактивирующую РНК (тракрРНК) и короткую, специфическую для ДНК-мишени 20-нуклеотидную длиннонаправленную CRISPR-РНК (crРНК) для распознавания «NGG» протоспейсера смежный мотив (PAM) и совершения двухцепочечного разрыва в целевой ДНК5,6,7,8,9,10,11,12. Этот двухцепочечный разрыв распознается как поражение клеточным механизмом восстановления ДНК. Следовательно, сгенерированный двухцепочечный разрыв может быть восстановлен одним из двух путей- i) Немумологичным конечным соединением (NHEJ) или ii) Гомологически направленным восстановлением (HDR)13. NHEJ часто подвержен ошибкам, и поэтому, когда этот путь используется для восстановления двухцепочечного разрыва в целевой ДНК, он часто вызывает инактивирующие мутации (вставки, делеции) в интересуемом гене. С другой стороны, поставляя экзогенный шаблон восстановления с гомологией по обе стороны от двухцепочечного разрыва, механизм восстановления клеточной ДНК может быть направлен на использование HDR для восстановления разрыва13. Таким образом, метод HDR позволяет точно редактировать любой интересующие локусы.
Различные протоколы редактирования генов CRISPR/Cas9 были описаны для C. elegans14,15,16,17,18,19,20. Наиболее часто используемые методы редактирования CRISPR/Cas9 в C. elegans включают как протоколы на основе клонирования, так и протоколы без клонирования для создания шаблонов восстановления для редактирования CRISPR/Cas914,15,16,17,18,19,20. В этом протоколе подробно обсуждается протокол редактирования CRISPR/Cas9 без клонирования, основанный на использовании dpy-10 в качестве маркера co-CRISPR для скрининга. До сих пор единственный подробный C. elegans-ориентированныйна CRISPR / Cas9 видеопротокол, который существует, использует флуоресцентный маркер для скрининга21. Однако использование флуоресцентного маркера для скрининга требует доступа к флуоресцентному микроскопу, доступ к которому многие лаборатории в небольших учреждениях бакалавриата (PUI) могут найти труднодоступным. Отрадно отметить, что положительные корреляционные результаты были получены в предыдущих исследованиях между червями, несущих флуоресцентные маркеры, и наличием ред.21,22. Тем не менее, необходимы дополнительные исследования для определения общей эффективности метода скрининга на основе флуоресценции для редактирования широкого спектра локусов с различными направляющих РНК и шаблонами восстановления. Наконец, поскольку плазмиды, кодирующие эти флуоресцентные маркеры, образуют внехромосомные массивы, из этих массивов часто производится переменная флуоресценция, что может затруднить идентификацию положительных результатов23. Таким образом, хотя метод скрининга на основе флуоресценции может быть полезен для принятия, вышеупомянутые проблемы могут ограничивать его применимость.
Использование маркера co-CRISPR, который производит видимый фенотип, значительно уменьшает количество потомства, которое необходимо провести скрининг, чтобы найти положительно отредактированного червя23,24,25,26,27,28. Важно отметить, что фенотипы, которые производятся этими маркерами, могут быть легко обнаружены под простым рассекающим микроскопом23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. Маркер dpy-10 co-CRISPR является одним из наиболее характеризуемых и широко используемых маркеров co-CRISPR для выполнения редактирования генома C. elegans CRISPR / Cas924,27. Поэтому в данной статье будет рассмотрен способ выполнения редактирования CRISPR/Cas9 у C. elegans с использованием прямой доставки рибонуклеопротеиновых комплексов с dpy-10 в качестве ко-CRISPR-маркера27,35. В этом способе подготовленная редукционная инъекционная смесь для редактирования состоит из хорошо охарактеризованная dpy-10 crRNA и dpy-10 репарации шаблона для опосредования генерации наблюдаемого доминантного фенотипа «ролика» (Rol), который присваивается известной гетерозиготной мутацией dpy-10(cn64) в гене dpy-10 24,27,29. При наличии в гомозиготном состоянии мутация dpy-10(cn64) вызывает фенотип демпинга (Dpy), который производит более коротких и стуковых червей24,29. Фенотип Rol опосредован точной вставкой совместно поставляемого шаблона восстановления dpy-10 в одну копию гена dpy-10 с помощью HDR-опосредованного редактирования CRISPR/Cas9. Таким образом, появление Rol C. elegans указывает на успешную инъекцию, а также на успешное HDR-опосредованное событие редактирования в клетках введенного червя. Поскольку crRNA и шаблон репарации интересуемого гена-мишени находятся в одной и той же инъекционной смеси с шаблоном репарации dpy-10 crRNA и dpy-10, существует большая вероятность того, что идентифицированные черви Rol также были одновременно отредактированы в интересуемом гене-мишени. Следовательно, эти черви Rol затем проверяются на редактирование, представляющий интерес, с помощью таких методов, как полимеразная цепная реакция (ПЦР) (для правок более 50 bp) или ПЦР с последующим ограничением пищеварения (для правок менее 50 bp).
Преимуществами использования этого метода для редактирования генома являются: i) редактирование CRISPR может быть сгенерировано с относительно высокой эффективностью (от 2% до 70%) с использованием этого метода27; ii) шаблоны ремонта и направляющие РНК, которые используются в данном методе, не предполагают клонирования, тем самым сокращая время, необходимое для их генерации; iii) путем сборки рибонуклеопротеиновых комплексов in vitroконцентрации собранных монтажных комплексов могут поддерживаться относительно постоянными, тем самым улучшая воспроизводимость; iv) было показано, что некоторые направляющие РНК, которые не генерируют изменения при экспрессии из плазмид, работают для редактирования генома CRISPR/Cas9 при поставке в виде транскрибированных crRNAs27 in vitro; v) включение маркера dpy-10 co-CRISPR позволяет легко проводить скрининг с помощью рассекающего микроскопа и уменьшает количество потомства, которое необходимо провести скрининг для нахождения положительных результатов24,27; и vi) секвенирование ДНК проверенных гомозиготно-отредактированных линий червей может быть получено этим методом в течение пары недель19,27.
Отличные главы книги, относящиеся ко многим различным методам CRISPR C. elegans, были опубликованы14,15,16,17,18,19,20,43. Однако демонстрация метода dpy-10 co-CRISPR в видеоформате в лабораторных условиях в настоящее время отсутствует. В этой статье мы опишем и продемонстрируем процесс использования метода dpy-10 co-CRISPR для редактирования репрезентативного гена-мишени под названием rbm-3.2, предполагаемого РНК-связывающего белка (WormBase:https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10).  В частности, здесь мы подробно описываем метод введения трех преждевременных стоп-кодонов в ген C. elegans rbm-3.2 с использованием собранных in vitro рибонуклеопротеиновых комплексов и экзогенно поставляемого линейного одноцепочечного шаблона репарации. Эти исследования были успешными в генерации первого штамма C. elegans CRISPR с преждевременными стоп-кодонами в гене rbm-3.2. Поскольку в настоящее время мало что известно о функции этого гена у C. elegans, этот штамм будет служить полезным инструментом в препарировки функции RMB-3.2. Этот метод также может быть принят для вставок, замен и делеций в любом локусе в геноме C. elegans.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Barcoded DNA sequencing tubes</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>SimpleSeq Kit Premixed</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein</td>
			<td>PNA Bio</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Lyophilized Cas9 protein was resuspended in 20%glycerol containing nuclease-free water, aliquoted and stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>crRNAs</td>
			<td>Horizon Discovery/ GE Dharmacon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Lyophilized crRNAs were resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td>Stored at -30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minelute PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>Spin columns stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyTaq Redmix</td>
			<td>Meridian Bioscience</td>
			<td>BIO-25043</td>
			<td>Stored at -30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard 20 nmol oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>P-480-SL4</td>
			<td>Stored at -30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repair template oligos</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>4 nmol Ultramer oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tracrRNA</td>
			<td>Horizon Discovery/ GE Dharmacon</td>
			<td>U-002005-50</td>
			<td>Lyophilized tracrRNA was resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 editing of the c. elegans rbm-3.2 gene using the dpy-10 co-crispr screening marker and assembled ribonucleoprotein complexes.

Бактериальная система Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR) /Streptococcus pyogenes CRISPR-ассоциированный белок (Cas) была использована исследователями для изучения важных биологически значимых проблем. Непревзойденная сила метода редактирования генома CRISPR / Cas позволяет исследователям точно редактировать любой локус по своему выбору, тем самым способствуя более глубокому пониманию функции генов. Несколько методов редактирования генома C. elegans с помощью CRISPR/Cas9 были описаны ранее. Здесь мы обсуждаем и демонстрируем метод, который использует собранные in vitro рибонуклеопротеиновые комплексы и маркер dpy-10 co-CRISPR для скрининга. В частности, в этой статье мы рассмотрим пошаговый процесс введения преждевременных стоп-кодонов в ген C. elegans rbm-3.2 путем гомологического репарации с использованием этого метода редактирования CRISPR / Cas9. Этот относительно простой метод редактирования может быть использован для изучения функции любого гена, представляющий интерес, и позволяет генерацию гомозиготно отредактированных C. elegans путем редактирования CRISPR / Cas9 менее чем за две недели.

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes. at JoVE.com

CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

Целью этого протокола является обеспечение бесшовного редактирования генома C. elegans в формате CRISPR/Cas9 с использованием собранных рибонуклеопротеиновых комплексов и маркера dpy-10 co-CRISPR для скрининга. Этот протокол может быть использован для создания различных генетических модификаций у C. elegans, включая вставки, делеции, замены генов и замены кодонов.

CRISPR/Cas9 Редактирование гена C. elegans rbm-3.2 с использованием скринингового маркера dpy-10 Co-CRISPR и собранных рибонуклеопротеиновых комплексов.

The bacterial Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) system has been ...

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping и CRISPR / Cas9 для определения гена резистентности к лекарственным средствам в<em&gt; Токсоплазма гондии</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Отборочное и независимое генерирование CRISPR / Cas9-опосредованных генов-нокаутов в клетках млекопитающих

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Стандартная методология для изучения на месте мутагенность как функция Точечная мутация ремонта, катализируемые ТРИФОСФАТЫ/Cas9 и SsODN в клетках человека

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Микроинъекции ТРИФОСФАТЫ/Cas9 белка в канал сома, сомик punctatus, эмбрионы для редактирования гена

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Быстрое и поверхностным трубопровода для генерации геномной мутантов точки в C. elegans с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена редактирования чтобы сделать условное мутантов из человека малярийного паразита P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Рибонуклеопротеин-опосредовано Точное редактирование генов трубэлектрогенерации

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Представляя ген нокаут непосредственно в Amastigote Этап trypanosoma cruzi Использование CRISPR / Cas9 системы

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Поколение определенных геномных модификаций с использованием CRISPR-CAS9 в стволовых клетках человека

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Исследование транскрипционной роли интронического глушителя RUNX1 от CRISPR/Cas9 Рибонуклеопротеин в острых миелоидных клеток лейкемии

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...