Name: applying the ratwalker system for gait analysis in a genetic rat model of parkinson's disease
Uploaded: 2021-01-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applying the RatWalker System for Gait Analysis in a Genetic Rat Model of Parkinson's Disease at JoVE.com

KS e HF ringraziano la Michael J Fox Foundation for Parkinson's Research per il sostegno al loro lavoro sulla malattia di Parkinson.

Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università del Nebraska Medical Center.
1. Apparato di deambulazione
NOTA: Modellato dal MouseWalker14, il RatWalker è stato progettato con dimensioni proporzionali alla differenza di lunghezza del passo tra ratti e topi. È costituito da una retroilluminazione laterale, un involucro per passerella, una passerella ottic...

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	<li>Behari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease.">Parkinson's disease.</a> Annals of Indian Academy of Neurology. 14, 2-6 (2011).</li><li>Kalia, L. V., Lang, A. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+animal+models+of+Parkinson's+disease.">Genetic animal models of Parkinson's disease.</a> Neuron. 66 (5), 646-661 (2010).</li><li>Gispert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson+phenotype+in+aged+PINK1-deficient+mice+is+accompanied+by+progressive+mitochondrial+dysfunction+in+absence+of+neurodegeneration.">Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration.</a> PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).</li><li>Goldberg, M. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+assess+the+development+and+recovery+of+locomotor+function+after+spinal+cord+injury+in+rats.">Methods to assess the development and recovery of locomotor function after spinal cord injury in rats.</a> Experimental Neurology. 119 (2), 153-164 (1993).</li><li>Jacobs, B. Y., Kloefkorn, H. E., Allen, K. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+motor+function+before+and+after+engraftment+of+dopaminergic+neurons+in+a+rat+model+of+Parkinson's+disease.">Quantitative evaluation of motor function before and after engraftment of dopaminergic neurons in a rat model of Parkinson's disease.</a> Journal of Biomedical Science. 17, 9 (2010).</li><li>Baldwin, H. A., Koivula, P. P., Necarsulmer, J. C., Whitaker, K. W., Harvey, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step+Sequence+Is+a+Critical+Gait+Parameter+of+Unilateral+6-OHDA+Parkinson's+Rat+Models.">Step Sequence Is a Critical Gait Parameter of Unilateral 6-OHDA Parkinson's Rat Models.</a> Cell Transplantation. 26 (4), 659-667 (2017).</li></ol>

I disturbi dell'andatura, tra cui una diminuzione dell'oscillazione del braccio, una velocità di camminata più lenta e passi più brevi, sono una caratteristica distintiva della malattia di Parkinson e si verificano all'inizio del decorso della malattia 1,5. Nel corso degli anni sono stati sviluppati diversi metodi per osservare e registrare i passi per l'analisi dell'andatura nei modelli di PD dei roditori, con tecniche manuali per quantificare la posizione de...

La PD, la più comune malattia neurodegenerativa del movimento legata all'età, è causata dalla perdita di neuroni DA nella substantia nigra pars compacta. Questa perdita di neuroni DA nigrali e gli input di DA nello striato portano alle compromissioni osservate della funzione motoria osservate nei pazienti con PD 1,2. Le caratteristiche motorie che definiscono i pazienti con PD, note collettivamente come parkinsonismo, includono rigidità, tremore a riposo, bradicinesia, instabilità posturale e micrografia3. Inoltre, i disturbi dell'andatura, che sono comuni nei pazienti con PD, compaiono precocemente nel corso della malattia 1,4,5. Mentre alcuni stili di vita sono suggeriti per aiutare a rallentare la progressione del PD, come un'alimentazione sana e un regolare esercizio fisico, attualmente non esiste una cura per il PD, solo farmaci per gestire i sintomi. Ciò lascia spazio alla necessità di ulteriori indagini nella speranza di migliorare le terapie. Pertanto, la caratterizzazione del modello di andatura nei modelli animali di PD è uno strumento cruciale per caratterizzare la rilevanza del modello e il modo in cui i trattamenti terapeutici volti a controllare il PD stanno prevenendo o migliorando le menomazioni motorie.
Ci sono vari modelli animali PD che sono stati utilizzati per testare trattamenti terapeutici, tuttavia ognuno ha i suoi limiti. Ad esempio, modelli animali trattati con la neurotossina 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP) hanno prodotto una grande quantità di informazioni sui processi importanti per la perdita dei neuroni DA nigrale e i successivi adattamenti striatali, e hanno indicato il ruolo dei mitocondri nella patogenesi della PD; tuttavia, il background patogenetico del modello MPTP è di natura tossica piuttosto che un processo neurodegenerativo come nel PD 6umano. Ulteriori modelli chimicamente inducibili includono 6-idrossidopamina (6-OHDA) e rotenone. 6-OHDA è stato il primo agente utilizzato per indurre PD mediante accumulo selettivo del farmaco nei neuroni DA, che alla fine uccide i neuroni e porta a sintomi simili a PD. Questo modello è stato utilizzato per la prima volta per il monitoraggio della deplezione di DA esaminando il comportamento in risposta all'anfetamina e all'apomorfina7. Questo metodo di induzione del PD si è dimostrato utile per lo screening di agenti farmacologici che hanno un impatto su DA e sui suoi recettori8. Mentre il modello 6-OHDA è un ottimo modello per tracciare i deficit motori quantificabili, questo modello non mostra come la graduale perdita di neuroni e la formazione di corpi di Lewy influiscano sull'animale. L'altro metodo di induzione, il rotenone, ha dimostrato di avere una progressiva degenerazione dei neuroni nigrostriatali con la perdita di tirosina idrossilasi e trasportatore DA, consentendo un modello migliore per tracciare la perdita di neuroni nel tempo9. I ratti trattati con rotenone hanno mostrato bradicinesia, instabilità posturale e andatura instabile10. Tuttavia, questo metodo è risultato essere ampiamente variabile tra diversi ceppi di ratti, il che ha provocato dubbi sul fatto che il rotenone sia o meno un modello PD affidabile11,12,13. Mentre l'analisi dell'andatura ha dimostrato di essere influenzata dall'induzione del PD nei ratti, fino ad oggi, i modelli di ratto PD geneticamente indotti non sono stati prontamente utilizzati per l'analisi dell'andatura camminando liberamente lungo una pista.
Un modo per analizzare la compromissione motoria nei roditori che camminano liberamente è l'analisi cinematica dell'andatura, che può essere eseguita utilizzando l'imaging FTIR. Questo metodo consolidato utilizza un sensore tattile ottico basato su FTIR, che registra e traccia le impronte dei roditori mentre si muovono lungo la pista14,15,16. Rispetto ad altri metodi, FTIR non dipende da alcun marcatore sul corpo dell'animale che potrebbe interferire con le impronte delle zampe. La generazione dei dati video produce impronte digitali di zampe di tutti e quattro gli arti che possono essere combinate per creare un modello di camminata dinamico e riproducibile per vari modelli di roditori. Il principio dell'analisi dell'andatura basata sull'imaging è quello di prendere ogni singola zampa e misurare l'area di contatto nel tempo mentre il roditore cammina lungo la pista. Ogni posizione è rappresentata da un aumento dell'area della zampa (nella fase di frenata) e una diminuzione dell'area della zampa (nella fase di propulsione). Questo è proceduto dalla fase di oscillazione, che è quando non viene rilevato alcun segnale di zampa. Dopo la valutazione del video, vengono generati diversi parametri che possono essere utilizzati per confrontare il modello wild-type (WT) rispetto al modello PD. Alcuni esempi di parametri sono la lunghezza del passo (distanza che la zampa copre in un passo), la durata dell'oscillazione (durata del tempo in cui la zampa non è in contatto con la pista), la velocità di oscillazione (lunghezza del passo in funzione della durata dell'oscillazione) e il modello di passo (passi diagonali, gradini laterali o gradini della cintura).
Per dimostrare l'utilità della FTIR per scoprire i primi cambiamenti del modello di andatura nei ratti, abbiamo usato un modello genetico di ratto di PD. Mentre la maggior parte dei casi di PD sono idiopatici; l'identificazione di forme ereditarie di mutazioni e varianti genetiche scoperte per il PD, come le mutazioni con perdita di funzione in Pink1 e Parkin, due proteine coinvolte nel controllo della qualità mitocondriale17, che potrebbero essere sfruttate per creare modelli animali18. Sfortunatamente, i topi sono resistenti alla neurodegenerazione per perdita di queste proteine (singole e combinate)19,20,21. Nei ratti, il Pink1 ma non il deficit di Parkin porta alla perdita del neurone DA nigrale e a menomazioni motorie22, ma senza penetranza completa. Pertanto, abbiamo generato un modello combinato di ratto Pink1 / Parkin double knockout (DKO), che mostra il fenotipo di trascinamento degli arti posteriori visivamente evidente riportato nei ratti maschi Pink1 KO22, ma ora a un tasso più elevato: 100% contro 30-50% dei maschi tra 4-6 mesi.
Mentre questo metodo funziona bene per analizzare i deficit motori nei topi14, le specifiche del sistema di andatura di imaging FTIR per adattarsi alle dimensioni e al peso dei ratti non erano precedentemente disponibili non commerciali. Qui spieghiamo come costruire il RatWalker, un sistema di imaging dell'andatura FTIR modificato modellato sul MouseWalker14, tranne adattato per le dimensioni e il peso dei ratti. Questo sistema utilizza un effetto ottico, FTIR, per fornire un metodo per visualizzare e successivamente registrare le impronte degli animali per l'analisi. Il contatto del piede di un animale con la guida d'onda ottica (piattaforma) provoca interruzioni nel percorso della luce con conseguente effetto di dispersione visibile, che viene catturato utilizzando videografia domestica ad alta velocità ed elaborazione utilizzando software open source. Questo studio dimostra il potere dell'imaging FTIR nello studio dei cambiamenti dell'andatura nei modelli genetici di ratto di PD. Ad esempio, mentre i cambiamenti motori palesi visivamente evidenti (cioè il trascinamento degli arti posteriori) sono osservati nei ratti DKO maschi al più presto a 4 mesi, utilizzando FTIR siamo in grado di scoprire anomalie del gate nei ratti DKO maschi a 2 mesi di età.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5&#8221; Aluminum Angle (1/8&#8221; - 6063)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dimensions: 8&#39; 
			Qty: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#8221; Aluminum Square Tube (1/16&#8221; - 6063)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dimensions: 8&#39; 
			Qty: 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 Gauge Aluminum Sheet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dimensions: 10&#39; 
			Qty: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#8221; Aluminum Tube (1/8&#8221; - 6063)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dimensions: 8&#39; 
			Qty: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7/32&#8221; Clear Acrylic Sheet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dimensions: 4&#39;x8&#39; 
			Qty: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#8221; White Acrylic Sheet 55% (2447)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dimensions: 4&#39;x8&#39; 
			Qty: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirror</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7/32&#8221; Glass Mirror</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dimensions: 60&#34;x12&#34; 
			Qty: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5050 LED Tape Light (Green)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dimensions: 16.4&#39; 
			Qty: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5050 LED Tape Light (Red)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dimensions: 16.4&#39; 
			Qty: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoPro Hero 6 Black</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Qty: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripod</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dimensions: 57&#34; 
			Qty: 1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying the ratwalker system for gait analysis in a genetic rat model of parkinson's disease

La malattia di Parkinson (PD) è una malattia neurodegenerativa progressiva causata dalla perdita di neuroni dopaminergici (DA) nella pars compacta substantia nigra. Le anomalie dell'andatura, tra cui la diminuzione dell'oscillazione del braccio, la velocità di camminata più lenta e i passi più brevi sono comuni nei pazienti con PD e compaiono precocemente nel corso della malattia. Pertanto, la quantificazione dei pattern motori in modelli animali di PD sarà importante per la caratterizzazione fenotipica durante il decorso della malattia e dopo il trattamento terapeutico. La maggior parte dei casi di PD sono idiopatici; tuttavia, l'identificazione di forme ereditarie di PD ha scoperto mutazioni e varianti genetiche, come mutazioni con perdita di funzione in Pink1 e Parkin, due proteine coinvolte nel controllo della qualità mitocondriale che potrebbero essere sfruttate per creare modelli animali. Mentre i topi sono resistenti alla neurodegenerazione dopo la perdita di Pink1 e Parkin (delezione singola e combinata), nei ratti, Pink1 ma non la carenza di Parkin porta alla perdita del neurone DA nigrale e alla compromissione motoria. Qui, riportiamo l'utilità dell'imaging FTIR per scoprire i cambiamenti dell'andatura in ratti maschi giovani (2 mesi di età) che camminano liberamente con perdita combinata di Pink1 e Parkin prima dello sviluppo di una grossolana anomalia motoria visivamente apparente quando questi ratti invecchiano (osservati a 4-6 mesi), caratterizzati da trascinamento degli arti posteriori come precedentemente riportato nei ratti knockout (KO) Pink1.

Manutenzione delle colonie di ratti La generazione e la caratterizzazione dei ratti Pink1 e Parkin single KO sono state descritte in precedenza22. I ratti KO singoli Pink1 e Parkin sono stati ottenuti da SAGE Labs (e ora disponibili da Envigo). I ratti DKO sono stati generati incrociando ratti Pink1-/- con ratti Parkin-/- per ottenere ratti Pink1+/-/Parkin+/-, che sono stati incrociati per ottenere ratti Pink1-/-/Parkin-<su...

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Applying the RatWalker System for Gait Analysis in a Genetic Rat Model of Parkinson's Disease

Qui descriviamo il sistema RatWalker, costruito riprogettando l'apparato MouseWalker per adattarsi alle maggiori dimensioni e peso dei ratti. Questo sistema utilizza la riflessione interna totale frustrata (FTIR), l'acquisizione video ad alta velocità e il software di analisi ad accesso aperto per tracciare e quantificare i parametri dell'andatura.

Applicazione del sistema RatWalker per l'analisi dell'andatura in un modello genetico di ratto della malattia di Parkinson

Parkinson's disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder caused by the loss of dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars ...

Questo metodo consente di quantificare in modo riproducibile le differenze nei parametri dell'andatura. I parametri dell'andatura possono essere valutati nei roditori che camminano liberamente e la tecnica non si basa su passaggi invasivi come immergere i piedi con l'inchiostro. A dimostrare la procedura sarà Ben Lamberty.Inizia posizionando una gabbia domestica alla fine della passerella prima dell'inizio di ogni corsa, per servire come spunto positivo per il topo per attraversare la passerella. Spegni le luci della stanza. Accendi la fotocamera e inizia a registrare alcuni secondi prima che il topo venga posizionato sulla piattaforma.Con il recinto installato, posizionare il topo alla fine della passerella, di fronte alla gabbia domestica, e consentirgli di attraversare la passerella in modo non forzato. Interrompi la registrazione una volta che l'animale raggiunge il capolinea della passerella. Pulire la passerella utilizzando il 70% di etanolo e un asciugamano non abrasivo tra una corsa e l'altra e dopo che un animale urina o defeca.Quindi, lasciare evaporare l'etanolo prima di introdurre un altro animale. Fai correre i ratti attraverso la passerella per un totale di sette volte durante ogni periodo di osservazione, prendendo le prime tre corse che segnano come passaggio per l'analisi. Segna una corsa come passaggio se l'animale fa quattro o più passi consecutivi in direzione della gabbia domestica senza interruzioni a causa di toelettatura, pause o movimenti erranti.L'analisi dell'andatura è stata eseguita su ratti maschi wild-type e Parkin DKO a due mesi di età per determinare se l'uso dell'analisi cinematica dell'andatura potesse rivelare sottili menomazioni motorie prima della comparsa di grossolani problemi motori. Nonostante l'aumento di peso dei ratti DKO, la pressione del piede applicata alla superficie di calpestio era inalterata. Dopo la valutazione di diversi parametri dell'andatura in funzione della velocità di camminata, la velocità di camminata e le lunghezze dei passi sono risultate simili tra ratti wild-type e DKO.La variazione tra ratti wild-type e DKO è diventata evidente nella fase di posizione e nella durata dell'oscillazione a velocità di camminata più lente. La frazione del ciclo di passi in cui la gamba è nella fase di posizione era il fattore di dovere. È stato speso più tempo nella fase di oscillazione che nella fase di posizione poiché il fattore di servizio è diminuito.Inoltre, mentre le velocità di oscillazione aumentavano con l'aumentare della velocità negli animali selvatici, la correlazione era smussata nei ratti DKO. L'analisi dell'andatura FTIR è stata utilizzata anche per creare grafici di tracce di fase di posizione di ciascuna gamba rispetto al corpo in ratti che camminano liberamente. Dopo aver confrontato il posizionamento della zampa, sono stati osservati cambiamenti significativi in AEP e PEP.Diversi parametri aggiuntivi sono stati significativamente modificati nei ratti DKO rispetto al wild-type. La velocità di oscillazione di entrambi gli arti posteriori sinistro e destro è aumentata nei ratti DKO, mentre la durata dell'oscillazione di entrambi gli arti posteriori sinistro e destro è diminuita. La configurazione coerente delle apparecchiature, compresa la posizione della telecamera rispetto a RatWalker, è importante per la corretta implementazione di questo protocollo.Dopo aver eseguito questo protocollo, gli animali sono disponibili per qualsiasi comportamento aggiuntivo o endpoint sperimentale necessari. Ad esempio, i cambiamenti dell'andatura possono essere correlati con alterazioni istologiche. Questa tecnica può essere utilizzata per valutare l'andatura in altri modelli di roditori non PD, come i modelli di ansia e depressione.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Ricerca

Neuroscienze

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