Name: applying the ratwalker system for gait analysis in a genetic rat model of parkinson's disease
Uploaded: 2021-01-18T14:00:00
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KS e HF agradecem à Michael J Fox Foundation for Parkinson's Research pelo apoio ao seu trabalho sobre a doença de Parkinson.

Todos os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro Médico da Universidade de Nebraska (IACUC).
1. Aparelho de marcha
NOTA: Modelado a partir do MouseWalker14, o RatWalker foi projetado com dimensões proporcionais à diferença no comprimento do passo entre ratos e camundongos. Consiste em uma luz de fundo de iluminação lateral, gabinete de passarela, passarela de guia de onda óptic...

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	<li>Behari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease.">Parkinson's disease.</a> Annals of Indian Academy of Neurology. 14, 2-6 (2011).</li><li>Kalia, L. V., Lang, A. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+gait+parameters+in+freely+walking+rodents.">Quantification of gait parameters in freely walking rodents.</a> BMC Biology. 13, 50 (2015).</li><li>Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+quantitative+gait+analysis+during+overground+locomotion+in+the+rat:+its+application+to+spinal+cord+contusion+and+transection+injuries.">Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries.</a> Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).</li><li>Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin-deficient+mice+exhibit+nigrostriatal+deficits+but+not+loss+of+dopaminergic+neurons.">Parkin-deficient mice exhibit nigrostriatal deficits but not loss of dopaminergic neurons.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (44), 43628-43635 (2003).</li><li>Kitada, T., Tong, Y., Gautier, C. A., Shen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+nigral+degeneration+in+aged+parkin/DJ-1/PINK1+triple+knockout+mice.">Absence of nigral degeneration in aged parkin/DJ-1/PINK1 triple knockout mice.</a> Journal of Neurochemistry. 111 (3), 696-702 (2009).</li><li>Dave, K. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+assess+the+development+and+recovery+of+locomotor+function+after+spinal+cord+injury+in+rats.">Methods to assess the development and recovery of locomotor function after spinal cord injury in rats.</a> Experimental Neurology. 119 (2), 153-164 (1993).</li><li>Jacobs, B. Y., Kloefkorn, H. E., Allen, K. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+motor+function+before+and+after+engraftment+of+dopaminergic+neurons+in+a+rat+model+of+Parkinson's+disease.">Quantitative evaluation of motor function before and after engraftment of dopaminergic neurons in a rat model of Parkinson's disease.</a> Journal of Biomedical Science. 17, 9 (2010).</li><li>Baldwin, H. A., Koivula, P. P., Necarsulmer, J. C., Whitaker, K. W., Harvey, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step+Sequence+Is+a+Critical+Gait+Parameter+of+Unilateral+6-OHDA+Parkinson's+Rat+Models.">Step Sequence Is a Critical Gait Parameter of Unilateral 6-OHDA Parkinson's Rat Models.</a> Cell Transplantation. 26 (4), 659-667 (2017).</li></ol>

Distúrbios da marcha, incluindo diminuição do balanço do braço, velocidade de caminhada mais lenta e passos mais curtos, são uma característica definidora da DP e ocorrem precocemente durante o curso da doença 1,5. Vários métodos têm sido desenvolvidos ao longo dos anos para observar e registrar passos para análise de marcha em modelos de roedores de DP, com técnicas manuais para quantificar a posição do pisar levando a abordagens automatizadas mai...

A DP, o distúrbio do movimento neurodegenerativo relacionado à idade mais comum, é causada pela perda de neurônios DA na substância negra pars compacta. Essa perda de neurônios DA nigral e as entradas de DA no estriado levam aos comprometimentos da função motora observados em pacientes com DP 1,2. As características motoras definidoras de pacientes com DP, conhecidas coletivamente como parkinsonismo, incluem rigidez, tremor de repouso, bradicinesia, instabilidade postural e micrografia3. Além disso, os distúrbios da marcha, comuns em pacientes com DP, aparecem precocemente no curso da doença 1,4,5. Embora certos estilos de vida sejam sugeridos para ajudar a retardar a progressão da DP, como alimentação saudável e exercícios regulares, atualmente não há cura para a DP, apenas medicamentos para gerenciar os sintomas. Isso deixa espaço para a necessidade de uma investigação mais aprofundada na esperança de melhorar a terapêutica. Assim, a caracterização do padrão de marcha em modelos animais de DP é uma ferramenta crucial para caracterizar a relevância do modelo, bem como como os tratamentos terapêuticos voltados para o controle da DP estão prevenindo ou melhorando os comprometimentos motores.
Existem vários modelos animais de DP que têm sido utilizados para testar tratamentos terapêuticos, no entanto, cada um tem suas limitações. Por exemplo, modelos animais tratados com a neurotoxina 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) produziram uma grande riqueza de informações sobre processos importantes para a perda do neurônio DA nigral e subsequentes adaptações estriatais, e apontaram para o papel das mitocôndrias na patogênese da DP; no entanto, o contexto patogênico do modelo MPTP é de natureza tóxica e não neurodegenerativa, como na DP humana6. Modelos quimicamente induzíveis adicionais incluem 6-hidroxidopamina (6-OHDA) e rotenona. A 6-OHDA foi o primeiro agente usado para induzir a DP pelo acúmulo seletivo da droga nos neurônios DA, o que eventualmente mata os neurônios e leva a sintomas semelhantes aos da DP. Este modelo foi usado pela primeira vez para o rastreamento da depleção de DA, examinando o comportamento em resposta à anfetamina e apomorfina7. Esse método de indução da DP tem se mostrado útil para o rastreamento de agentes farmacológicos que impactam a AD e seus receptores8. Embora o modelo 6-OHDA seja um ótimo modelo para rastrear déficits motores quantificáveis, esse modelo não mostra como a perda gradual de neurônios e a formação de corpos de Lewy afetam o animal. O outro método de indução, a rotenona, demonstrou ter degeneração progressiva dos neurônios nigrostriatais com a perda de tirosina hidroxilase e transportador DA, permitindo um melhor modelo para rastrear a perda de neurônios ao longo do tempo9. Os ratos tratados com rotenona apresentaram bradicinesia, instabilidade postural e marcha instável10. No entanto, esse método tem se mostrado amplamente variável entre diferentes cepas de ratos, o que tem provocado questionamentos se a rotenona é ou não um modelo confiável de DP11,12,13. Embora a análise da marcha tenha demonstrado ser impactada pela indução de DP em ratos, até o momento, os modelos de ratos com DP geneticamente induzidos não foram prontamente usados para análise de marcha andando livremente por uma pista.
Uma maneira de analisar o comprometimento motor em roedores que caminham livremente é a análise cinemática da marcha, que pode ser realizada utilizando imagens FTIR. Esse método estabelecido utiliza um sensor óptico de toque baseado em FTIR, que registra e rastreia as pegadas dos roedores à medida que eles se movem pela pista14,15,16. Em comparação com outros métodos, o FTIR não depende de nenhum marcador no corpo do animal que possa interferir nas impressões das patas. A geração dos dados de vídeo produz impressões digitais de todas as quatro partes que podem ser combinadas para criar um padrão de caminhada dinâmico e reprodutível para vários modelos de roedores. O princípio da análise de marcha baseada em imagens é pegar cada pata individual e medir a área de contato ao longo do tempo enquanto o roedor caminha pela pista. Cada postura é representada por um aumento na área da pata (na fase de frenagem) e uma diminuição na área da pata (na fase de propulsão). Isso é prosseguido pela fase de balanço, que é quando não há sinal de pata detectado. Após a avaliação do vídeo, são gerados vários parâmetros que podem ser usados para comparar o tipo selvagem (WT) versus o modelo PD. Alguns exemplos dos parâmetros são o comprimento do passo (distância que a pata cobre em um passo), a duração do balanço (duração do tempo em que a pata não está em contato com a pista), a velocidade do balanço (comprimento do passo em função da duração do balanço) e o padrão do passo (passos diagonais, degraus laterais ou passos de cinto).
Para demonstrar a utilidade do FTIR para descobrir mudanças precoces no padrão de marcha em ratos, usamos um modelo genético de DP em ratos. Enquanto a maioria dos casos de DP são idiopáticos; a identificação de formas hereditárias de DP revelou mutações e variantes genéticas, como mutações de perda de função em Pink1 e Parkin, duas proteínas envolvidas no controle de qualidade mitocondrial17, que poderiam ser aproveitadas para criar modelos animais18. Infelizmente, camundongos são resistentes à neurodegeneração após a perda dessas proteínas (únicas e combinadas)19,20,21. Em ratos, a deficiência de Pink1, mas não de Parkin, leva à perda do neurônio DA nigral e a deficiências motoras22, mas sem penetrância completa. Portanto, geramos um modelo combinado de ratos Pink1/Parkin double knockout (DKO), que exibe o fenótipo de arrasto do membro posterior visualmente aparente relatado em ratos machos Pink1 KO22, mas agora em uma taxa mais alta: 100% versus 30-50% dos machos entre 4-6 meses.
Embora esse método funcione bem para analisar déficits motores em camundongos14, as especificações do sistema de marcha de imagem FTIR para acomodar o tamanho e o peso dos ratos anteriormente não estavam disponíveis comercialmente. Aqui explicamos como construir o RatWalker, um sistema de imagem de marcha FTIR modificado modelado após o MouseWalker14, exceto adaptado para o tamanho e peso dos ratos. Este sistema utiliza um efeito óptico, FTIR, para fornecer um método para visualizar e, posteriormente, registrar pegadas de animais para análise. O contato do pé de um animal com o guia de ondas ópticas (plataforma) causa interrupção no caminho da luz, resultando em um efeito de dispersão visível, que é capturado usando videografia doméstica de alta velocidade e processamento usando software de código aberto. Este estudo demonstra o poder da imagem FTIR no estudo de alterações na marcha em modelos genéticos de DP em ratos. Por exemplo, enquanto alterações motoras visualmente aparentes evidentes (ou seja, arrasto dos membros posteriores) são observadas em ratos machos com DKO aos 4 meses no mínimo, usando FTIR somos capazes de descobrir anormalidades de porta em ratos machos DKO aos 2 meses de idade.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5&#8221; Aluminum Angle (1/8&#8221; - 6063)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dimensions: 8&#39; 
			Qty: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#8221; Aluminum Square Tube (1/16&#8221; - 6063)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dimensions: 8&#39; 
			Qty: 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 Gauge Aluminum Sheet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dimensions: 10&#39; 
			Qty: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#8221; Aluminum Tube (1/8&#8221; - 6063)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dimensions: 8&#39; 
			Qty: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7/32&#8221; Clear Acrylic Sheet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dimensions: 4&#39;x8&#39; 
			Qty: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#8221; White Acrylic Sheet 55% (2447)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dimensions: 4&#39;x8&#39; 
			Qty: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirror</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7/32&#8221; Glass Mirror</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dimensions: 60&#34;x12&#34; 
			Qty: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5050 LED Tape Light (Green)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dimensions: 16.4&#39; 
			Qty: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5050 LED Tape Light (Red)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dimensions: 16.4&#39; 
			Qty: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoPro Hero 6 Black</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Qty: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripod</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dimensions: 57&#34; 
			Qty: 1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying the ratwalker system for gait analysis in a genetic rat model of parkinson's disease

A doença de Parkinson (DP) é um distúrbio neurodegenerativo progressivo causado pela perda de neurônios dopaminérgicos (DA) na substância negra pars compacta. Anormalidades na marcha, incluindo diminuição do balanço do braço, velocidade de caminhada mais lenta e passos mais curtos são comuns em pacientes com DP e aparecem no início do curso da doença. Assim, a quantificação de padrões motores em modelos animais de DP será importante para a caracterização fenotípica durante o curso da doença e no tratamento terapêutico. A maioria dos casos de DP é idiopática; no entanto, a identificação de formas hereditárias de DP revelou mutações e variantes genéticas, como mutações de perda de função em Pink1 e Parkin, duas proteínas envolvidas no controle de qualidade mitocondrial que poderiam ser aproveitadas para criar modelos animais. Enquanto os ratos são resistentes à neurodegeneração após a perda de Pink1 e Parkin (deleção única e combinada), em ratos, a deficiência de Pink1, mas não de Parkin, leva à perda do neurônio DA nigral e ao comprometimento motor. Aqui, relatamos a utilidade da imagem FTIR para descobrir alterações na marcha em ratos machos jovens (2 meses de idade) com perda combinada de Pink1 e Parkin antes do desenvolvimento de anormalidade motora visualmente aparente grosseira à medida que esses ratos envelhecem (observada aos 4-6 meses), caracterizada pelo arrasto dos membros posteriores, conforme relatado anteriormente em ratos Pink1 knockout (KO).

Manutenção da Colônia de Ratos A geração e caracterização de ratos Pink1 e Parkin single KO já foram descritas anteriormente22. Os ratos Pink1 e Parkin single KO foram obtidos do SAGE Labs (e agora disponíveis no Envigo). Ratos DKO foram gerados pelo cruzamento de ratos Pink1-/- com ratos Parkin-/- para obtenção de ratos Pink1+/-/Parkin+/- que foram cruzados para obtenção de ratos Pink1-/-/Parkin-/<s...

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Applying the RatWalker System for Gait Analysis in a Genetic Rat Model of Parkinson's Disease

Aqui descrevemos o sistema RatWalker, construído redesenhando o aparelho MouseWalker para acomodar o aumento do tamanho e peso dos ratos. Este sistema usa reflexão interna total frustrada (FTIR), captura de vídeo de alta velocidade e software de análise de acesso aberto para rastrear e quantificar os parâmetros da marcha.

Aplicando o Sistema RatWalker para Análise de Marcha em um Modelo de Rato Genético da Doença de Parkinson

Parkinson's disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder caused by the loss of dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars ...

Este método permite quantificar de forma reprodutível as diferenças nos parâmetros da marcha. Os parâmetros da marcha podem ser avaliados em roedores que caminham livremente, e a técnica não depende de etapas invasivas, como mergulhar os pés com tinta. Demonstrando o procedimento estará Ben Lamberty.Comece colocando uma gaiola doméstica no final da passarela antes do início de cada corrida, para servir como uma sugestão positiva para o rato atravessar a passarela. Desligue as luzes do quarto. Ligue a câmera e comece a gravar vários segundos antes que o rato seja colocado na plataforma.Com o recinto instalado, coloque o rato no final da passarela, em frente à gaiola doméstica, e permita que ele atravesse a passarela de maneira não forçada. Pare de registrar assim que o animal chegar ao término da passarela. Limpe a passarela usando etanol a 70% e uma toalha não abrasiva entre as corridas e depois que um animal urinar ou defecar.Em seguida, deixe o etanol evaporar antes de introduzir outro animal. Execute os ratos pela passarela um total de sete vezes durante cada período de observação, tomando as três primeiras corridas que pontuam como passagem para análise. Marque uma corrida como passageira se o animal der quatro ou mais passos consecutivos na direção da gaiola doméstica sem interrupção devido a cuidados com a tosa, pausa ou movimentos errantes.A análise da marcha foi realizada em ratos machos do tipo selvagem e Parkin DKO aos dois meses de idade para determinar se o uso da análise cinemática da marcha poderia revelar deficiências motoras sutis antes do aparecimento de problemas motores grossos. Apesar do aumento do peso dos ratos DKO, a pressão do pé aplicada à superfície de caminhada não foi alterada. Após a avaliação de vários parâmetros de marcha em função da velocidade de caminhada, a velocidade de caminhada e o comprimento dos passos foram semelhantes entre ratos selvagens e DKO.A variação entre ratos selvagens e DKO tornou-se aparente na fase de postura e duração do balanço em velocidades de caminhada mais lentas. A fração do ciclo de passos em que a perna está na fase de postura foi o fator de serviço. Gastou-se mais tempo na fase de oscilação do que na fase de postura, à medida que o fator de imposto diminuiu.Além disso, enquanto as velocidades de balanço aumentaram com o aumento da velocidade em animais do tipo selvagem, a correlação foi atenuada em ratos DKO. A análise da marcha FTIR também foi usada para criar gráficos de traços de fase de postura de cada perna em relação ao corpo em ratos que caminham livremente. Ao comparar o posicionamento da pata, observaram-se alterações significativas no PEP e PEP.Vários parâmetros adicionais foram significativamente alterados nos ratos DKO em comparação com o tipo selvagem. A velocidade de balanço dos membros posteriores esquerdo e direito foi aumentada em ratos DKO, enquanto a duração do balanço dos membros posteriores esquerdo e direito foi diminuída. A configuração consistente do equipamento, incluindo a posição da câmera em relação ao RatWalker, é importante para a implementação bem-sucedida deste protocolo.Após a realização deste protocolo, os animais estão disponíveis para qualquer comportamento adicional ou desfechos experimentais necessários. Por exemplo, as alterações da marcha podem ser correlacionadas com alterações histológicas. Essa técnica pode ser usada para avaliar a marcha em outros modelos de roedores não DP, como modelos de ansiedade e depressão.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualização e manipulação genética de dendritos e espinhas no córtex cerebral e hipocampo do rato usando<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Neurociência

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Análise imuno-histoquímica no sistema nervoso central e periférico Rat linfonodo Tissue Secções

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Methods to Characterize Spontaneous and Startle-induced Locomotion in a Rotenone-induced Parkinson's Disease Model of Drosophila

Methods to Characterize Spontaneous and Startle-induced Locomotion in a Rotenone-induced Parkinson's Disease Model of Drosophila

Métodos para caracterizar espontânea e surpreender-induzida Locomotion em um modelo de doença de Parkinson induzida por Rotenone de<em&gt; Drosophila</em

Parkinson&#8217;s disease is a neurodegenerative disorder that results from the degeneration of dopaminergic neurons in the central nervous system, ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Análise Cinética 3D para a Avaliação Funcional no modelo de rat da lesão ciática de esmagamento nervoso

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Semi-Quantitative Determination of Dopaminergic Neuron Density in the Substantia Nigra of Rodent Models using Automated Image Analysis

Determinação semi-quantitativa da densidade do neurônio dopaminérgico na Substantia Nigra dos Modelos de Roedores usando análise automatizada de imagem

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased ...

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

Um modelo de rato de infecção cerebral ecohiv

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

Motor Dual-Tasks for Gait Analysis and Evaluation in Post-Stroke Patients

Dupla tarefa motora para análise e avaliação da marcha em pacientes pós-AVE

Eighteen stroke patients were recruited for this study involving the evaluation of cognition and walking ability and multitask gait analysis. Multitask ...

The 6-hydroxydopamine Rat Model of Parkinson's Disease

O Modelo de Rato de 6-hidroxidopamina da Doença de Parkinson

Motor symptoms of Parkinson's disease (PD)-bradykinesia, akinesia, and tremor at rest-are consequences of the neurodegeneration of dopaminergic neurons in ...

Induction and Assessment of Levodopa-induced Dyskinesias in a Rat Model of Parkinson's Disease

Indução e Avaliação de Dyskinesias induzidas por Levodopa em um modelo de rato da doença de Parkinson

Levodopa (L-DOPA) remains the gold-standard therapy used to treat Parkinson&#39;s disease (PD) motor symptoms. However, unwanted involuntary movements ...