Name: microfluidic model to mimic initial event of neovascularization
Uploaded: 2021-04-10T13:00:00
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这项工作得到了中国国家自然科学研究基金会的资助（赠款号11827803，31971244，31570947，11772036， 61533016、U20A20390、32071311）、中国国家重点研究开发计划（2016年YFC1101101和2016YFC1102202）、111项目（B13003）和北京自然科学基金（4194079）。

1. 晶圆准备
注：此协议是针对本研究期间使用的 SU-2075 负光抗光片的特异性。
<ol><li>用甲醇和异丙醇在旋转涂层上清洁硅晶圆 3 到 5 次如下：先在 500 rpm 下旋转 15 s，然后在 3，000 rpm 下旋转 60 s。</li>
	<li>将硅晶圆转移到热板上，热板预热至 180 °C，并将晶圆烘烤 10 分钟。</li>
	<li>将硅晶圆从热板中取出，冷却至室温。在继续旋转涂层之前，用压缩空气再次清洁晶圆。将 SU-8 ...

长期以来，对神经血管化的实时观测一直是个问题。最近已开发出几种方法，以制造与ECs衬砌的香水容器，并毗邻细胞外矩阵，以发芽22，32，40，46，54，但机械微环境仍然难以持续。模仿ECs的初始生物力学微环境仍然是一个困难的课题，这些环境受到高光泽剪切应力和低速?...

神经血管化发生在许多正常和病理过程1，2，3，4，其中包括成人的两个主要过程，血管生成和动脉生成5。除了最知名的生长因子，如血管内皮生长因子（VEGF）6，机械刺激，特别是血流诱发的剪切应力，在调节血管化7方面非常重要。如我们所知，切变应力的大小和形式在血管的不同部位变化很大，动态变化，对血管细胞8、9、10、11、12有重要影响。先前的研究表明，剪切应力可能影响ECs的各个方面，包括细胞表型变化、信号转导、基因表达，以及与壁画细胞13、14、15、16、17、18、19、20的交流：因此，调节神经血管化21，22，23，24。
因此，为了更好地了解神经血管化，在体外重建自然细胞微环境的过程非常重要。最近，利用微制造和微流体技术的进步，建立了许多模型，以制造微型容器，并精确控制微环境25、26、27。在这些模型中，微容器可以产生水凝胶28，29，多二甲基硅氧烷（PDMS）微流体芯片30，31，32或3D生物打印33，34。微环境的某些方面， 如光切变应力22、23、35、36、转肠皮流37、38、39、40、生化梯度血管因子41、42、应变/拉伸43、44、45，并与其他类型的细胞共同培养32、46已被模仿和控制。通常，使用大型储水器或注射器泵提供灌注介质。这些模型中的跨内皮流是由水库和微管22、23、38、40之间的压力下降造成的。然而，机械微环境很难以这种方式持续保持。如果使用具有高剪切应力的高流速进行注水，横皮流将增加，然后超过生理水平。先前的研究表明，在血管化初期，由于完整的ECs和地下室膜，转皮流的速度非常低，通常低于0.05μm/s8。同时，虽然血管系统中的光刻剪压力差异很大，但平均值为5-20 dyn/cm2、11、47，相对较高。目前，以往作品的转肠皮流速一般保持在0.5-15微米/s 22、38、39、40之间，光切变应力一般在10~223以下。不断使ECs同时暴露在高光泽剪切应力和跨内皮流动的生理水平中仍然是一个困难的课题。 
在本研究中，我们描述了一个 体外 3D模型，以模拟神经血管化（MIEN）的初始事件。我们开发了微流体芯片和自动控制、高效循环系统，形成注水微管，模拟发芽过程48。通过 MIEN 模型，首先对神经血管化初期刺激的 IC 微环境进行了重新概括。EC 可以同时受到高光泽剪切应力、跨内皮流的生理水平和各种 VEGF 分布的刺激。我们详细描述了建立MIEN模型的步骤和需要注意的要点，希望为其他研究人员提供参考。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Genview</td>
			<td>GP3108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electromagnetic pinch valve</td>
			<td>Wokun Technology</td>
			<td>WK02-308-1/3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell medium (ECM)</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Every Green</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran</td>
			<td>Miragen</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphical programming environment</td>
			<td>Lab VIEW</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image editing software</td>
			<td>PhotoShop</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing program</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>91237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithography equipment</td>
			<td>Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences</td>
			<td>URE-2000/35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>82762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-peristaltic pump</td>
			<td>Lead Fluid</td>
			<td>BT101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-syringe pump</td>
			<td>Lead Fluid</td>
			<td>TYD01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma</td>
			<td>MING HENG</td>
			<td>PDC-MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent epoxy negative photoresist</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene</td>
			<td>Teflon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Program software</td>
			<td>MATLAB</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF-165</td>
			<td>StemImmune LLC</td>
			<td>HVG-VF5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.06498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Phalloidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic model to mimic initial event of neovascularization

神经血管化通常从现有的正常血管中初始化，初始阶段内皮细胞（ECs）的生物力学微环境与下一个神经血管化过程有显著差异。虽然有很多模型来模拟神经血管化的不同阶段，但仍然缺乏在正常血管微环境的相应刺激下投降神经血管化初始过程的 体外 3D模型。在这里，我们重建了一个 体外 3D模型，模仿神经血管化（MIEN）的初始事件。MIEN 模型包含微流体发芽芯片和自动控制、高效循环系统。形成了一个功能齐全、可喷水的微通道，涂有内皮，并在微流体发芽芯片中模拟发芽过程。神经血管化的最初生理微环境通过微流体控制系统进行回顾，通过该系统，IC将同时暴露在高光泽剪切应力、生理性转皮流和各种血管内皮生长因子（VEGF）分布中。MIEN模型可以很容易地应用于神经化机制的研究，并作为药物筛选和毒理学应用的低成本平台具有潜在的前景。

体外3D模型，以模拟神经血管化（MIEN）的初始事件在这里提出包括一个微流体发芽芯片和一个微流体控制系统。微流体发芽芯片是从以前的出版物22，23，37，40，51，52，53优化。简言之，它包含三个通道和六个端口?...

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Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization

在这里，我们提供了一个微流体芯片和一个自动控制的、高效的循环微流体系统，它回顾了血管化的初始微环境，使内皮细胞（ECs）能够同时受到高光泽剪切应力、跨内皮流动的生理水平和各种血管内皮生长因子（VEGF）分布的刺激。

模仿神经血管化初始事件的微流体模型

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the ...

血管化，产生新的血管是一个高度规范的过程，在正常和病理事件。为了更好地了解神经血管化，在体外自然细胞微环境中重建这个过程非常重要。我们开发了微流体芯片和自动控制。高效循环是为了形成灌注微管，并模拟使用蛋白质来重新概括到新血管化的初始事件。微流体发芽芯片由三个通道组成。内皮细胞培养通道和液体通道由宽阔的中央水凝胶通道隔开。微流体控制系统由微注射泵和电磁捏阀组成。气泡陷阱芯片、微流体发芽芯片、微渗透泵和培养介质储层。通过微流体系统，内皮细胞可以同时受到高发光剪切应力、跨内皮流的生理水平和各种血管内皮生长因子分布的刺激。派佩特20微升每毫升纤维素125微克进入细胞培养通道的一个介质注入口。切一个移液器尖端，用剪刀安装细胞培养通道的端口。将移液器尖端插入细胞培养通道的其他介质注入端口。然后，从细胞培养通道中吹出空气，用纤维素填充空气。在37摄氏度下孵化芯片一小时。在细胞播种之前，移液器将20微升的内皮细胞介质放入每个介质注入端口，并在37摄氏度下孵育芯片30分钟。然后，在所有媒体注入端口中移出所有介质。接下来，移液器将五微升细胞悬浮进入一个介质注入端口的细胞培养通道。然后，内皮细胞在微分静水压下迅速扩散到整个通道上。将大约四到六微升的 ECM 介质添加到另一端口，以调整静水压力并阻止电池移动。将芯片远程到细胞孵化器。然后，每30分钟翻一次芯片，直到两小时后内皮细胞覆盖在细胞培养通道的内部表面。使用移液器尖端非常小心地去除注射端口中的附加细胞。然后，将四个带刺的女 Luer 适配器插入介质注入端口，并填充 ECM 介质。将芯片移到细胞孵化器中，每 12 小时更换 ECM 介质和 Luer 适配器。组装微流体控制系统，准备两个聚二氟乙烯管，两个短硅管，三个长硅胶管，一个带刺的雌性Luer适配器，一个Y型连接器，然后三个L型连接器。用10毫升预热的 ECM 介质填充注射器。用带刺的女 Luer 适配器将聚氨酯乙烯管连接到注射器。然后，将聚二甲苯管的另一端连接到 Y 型连接器。接下来，将两个长硅胶管连接到 Y 型连接器的其他两端。我们使用一根管连接到储层，另一根管连接到气泡陷阱芯片。将另一根长硅胶管连接到储层。接下来，使用两个短硅胶管连接气泡陷阱芯片顶层的所有入口和出口孔。将聚氨酯乙烯管连接到芯片的后端。接下来，将注射器固定在微注射器泵上。将两根长硅胶管夹入电磁捏阀中。接下来，切换电磁捏阀，打开注射器和储液库之间的管道。使用微注射器泵将介质注入储液池，以排出管内的空气。然后，再次切换阀门，打开注射器和气泡陷阱芯片之间的管道。注入介质以填充液体室和气泡陷阱芯片的后端管。从细胞孵化器中取出内皮发芽芯片，然后从细胞培养侧取出Luer适配器。将两个管道插头插入微流体发芽芯片的水凝胶注入端口。将气泡陷阱芯片的后端管连接到一个细胞培养通道端口。将 T 型连接器插入其他端口，并将其连接到与储液层相连的长硅管。将长硅胶管夹入微渗透泵中。然后，在储层中插入空气过滤器。接下来，将微流体发芽芯片组装到舞台顶部孵化器。接下来，通过 TPU 管将真空泵连接到气泡陷阱芯片底部层的孔。在同时控制微注射器泵和电磁捏阀的自定义程序中设置相反的循环体积和流速。其次，设置微渗透泵的流速。打开微注射器泵。然后，建立循环控制系统。通过测量40 kDa F-I-T-C dextrin的扩散渗透系数，测试模型中某些微容器的阻隔功能。如图所示，带细胞衬里的静态培养芯片的扩散渗透系数为每秒0.1正负0.3微米。没有细胞衬里的空通道的扩散渗透系数为每秒5.4正负0.7微米。内皮发芽检测表明，内皮细胞在24小时静态培养后主要发芽到中央水凝胶中，而发芽程度随着发光剪切应力的增加而显著降低。从数量上来说，发光剪切应力在发芽面积、平均发芽长度和最长发芽长度方面显著减少内皮发芽。通过我们的系统，在实验期间，内皮细胞的切变应力可以随时改变，而跨内皮流则保持在生理水平。这种体外3D生物仿生模型可直接应用于新血管化机制的研究，作为药物筛选和毒理学应用的低成本平台，具有潜在的前景。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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科研

生物工程

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