Name: microfluidic model to mimic initial event of neovascularization
Uploaded: 2021-04-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Research Foundation of China Grants-in-Aid (tilskud nr. 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 og 32071311), Kinas nationale nøgleprogram for forskning og udvikling (tilskud nr. 2016YFC1101101 og 2016YFC1102202), 111-projektet (B13003) og Beijing Natural Science Foundation (4194079).

1. Forberedelse af Wafer
BEMÆRK: Denne protokol er specifik for SU-8 2075 negative fotoresist, der anvendes i løbet af denne forskning.
<ol><li>Rengør silicium wafer 3 til 5 gange med methanol og isopropanol på en spin coater som følger: først spin for 15 s ved 500 omdrejninger i minuttet, og derefter spin for 60 s ved 3.000 rpm.</li>
	<li>Siliciumskiflen overføres til en kogeplade, som forvarmes til 180 °C, og skiven bages i 10 minutter.</li>
	<li>Fjern siliciumskiflen fra kogeplade...

I lang tid har realtidsobservation af neovascularisering været et problem. Flere tilgange er blevet udviklet for nylig for at skabe perfunderede fartøjer foring med ECs og støder op til ekstracellulære matrix forspiring 22,32,40,46,54, men den mekaniske mikromiljø er stadig svært at opretholde konstant. Det er fortsat et vanskeligt emne at efterligne det...

Neovascularization sker i mange normale og patologiske processer1,2,3,4, som omfatter to store processer hos voksne, angiogenese og arteriogenese5. Ud over de mest kendte vækstfaktorer, såsom vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF)6, er mekaniske stimuleringer, især blodgennemstrømningen induceret forskydningsstress, vigtig i reguleringen af neovascularisering7. Som vi ved, varierer størrelsen og formerne for forskydningsstress dramatisk og dynamisk i forskellige dele af vaskulaturen, hvilket resulterer i vigtige virkninger på vaskulære celler8,9,10,11,12. Tidligere undersøgelser har vist, at forskydningsstress kan påvirke forskellige aspekter af ECs, herunder cellefenotypiske ændringer, signaltransduktion, genekspression og kommunikation med vægmalericeller13,14,15,16,17,18,19,20; derfor regulere neovascularization21,22,23,24.
Derfor er det vigtigt at rekonstruere processen i naturlig cellulær mikromiljø in vitrofor bedre at forstå neovascularisering . For nylig er mange modeller blevet etableret for at skabe mikrobeholdere og give præcis kontrol af mikromiljø25,26,27, drage fordel af fremskridt inden for mikrofabrikation og mikrofluidisk teknologi. I disse modeller kan mikrobeholdere genereres af hydrogel28,29, polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidic chips30,31,32 eller 3D bioprint33,34. Nogle aspekter af mikromiljøet, såsom luminal shear stress22,23,35,36, transendotel flow37,38,39,40, biokemisk gradient af angiogene faktorer41,42, stamme / stretch43,44,45, og co-dyrket med andre typer af celler32,46 er blevet efterlignet og kontrolleret. Normalt blev et stort reservoir eller sprøjtepumpe brugt til at give perfunderet medium. Transendotelstrøm i disse modeller blev skabt ved trykfald mellem reservoiret og mikrorør22,23,38,40. Det mekaniske mikromiljø var imidlertid svært at opretholde konstant på denne måde. Transendotel flow ville stige og derefter overstige det fysiologiske niveau, hvis en høj strømningshastighed med høj forskydningsbelastning blev brugt til perfusion. Tidligere undersøgelse viste, at hastigheden af transendotelstrømmen i den indledende periode med neovascularisering er meget lav på grund af de intakte ECs og kældermembran, normalt under 0,05 μm/s8. I mellemtiden, selv om luminal forskydning stress i vaskulære system varierer meget, det er relativt højt med middelværdier på 5-20 dyn/cm2,11,47. Indtil videre er hastigheden af transendotelstrømmen i tidligere værker generelt blevet holdt mellem 0,5-15 μm/s22,38,39,40, og den luminale forskydningsbelastning var normalt under 10 dyn/cm2 23. Det er fortsat et vanskeligt emne til konstant at udsætte ECs for høj luminal forskydning stress og fysiologiske niveau af transendotel flow samtidigt.
I denne undersøgelse beskriver vi en in vitro 3D-model til at efterligne den første begivenhed af neovascularization (MIEN). Vi udviklede en mikrofluidic chip og en automatisk kontrol, meget effektivt cirkulationssystem til at danne perfusion mikrorør og simulere processen med spiring48. Med MIEN-modellen sammenfattes mikromiljøet af EC'er, der blev stimuleret i den indledende periode med neovascularisering, først. ECs kan stimuleres af høj luminal shear stress, fysiologiske niveau af transendotel flow og forskellige VEGF distribution samtidigt. Vi beskriver trinene til at etablere MIEN-modellen i detaljer og de vigtigste punkter, der skal tages hensyn til, i håb om at give en reference til andre forskere.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Genview</td>
			<td>GP3108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electromagnetic pinch valve</td>
			<td>Wokun Technology</td>
			<td>WK02-308-1/3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell medium (ECM)</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Every Green</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran</td>
			<td>Miragen</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphical programming environment</td>
			<td>Lab VIEW</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image editing software</td>
			<td>PhotoShop</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing program</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>91237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithography equipment</td>
			<td>Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences</td>
			<td>URE-2000/35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>82762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-peristaltic pump</td>
			<td>Lead Fluid</td>
			<td>BT101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-syringe pump</td>
			<td>Lead Fluid</td>
			<td>TYD01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma</td>
			<td>MING HENG</td>
			<td>PDC-MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent epoxy negative photoresist</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene</td>
			<td>Teflon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Program software</td>
			<td>MATLAB</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF-165</td>
			<td>StemImmune LLC</td>
			<td>HVG-VF5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.06498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Phalloidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic model to mimic initial event of neovascularization

Neovascularisering initialiseres normalt fra en eksisterende normal vaskulatur, og det biomekaniske mikromiljø af endotelceller (ECs) i den indledende fase varierer dramatisk fra følgende proces med neovascularisering. Selv om der er masser af modeller til at simulere forskellige stadier af neovascularization, en in vitro 3D-model, der kapitulerer den indledende proces med neovascularization under de tilsvarende stimuleringer af normale vaskulatur mikromiljøer er stadig mangler. Her rekonstruerede vi en in vitro 3D-model, der efterligner den første begivenhed af neovascularization (MIEN). MIEN-modellen indeholder en mikrofluidisk spiringschip og et automatisk styrings-, højeffektivt cirkulationssystem. En funktionel, perfusable mikrokanal belagt med endotel blev dannet, og processen med spiring blev simuleret i den mikrofluidiske spirende chip. Det oprindeligt fysiologiske mikromiljø af neovascularisering blev sammenfattet med det mikrofluidiske kontrolsystem, hvorved EC'er ville blive udsat for høj luminal forskydningsbelastning, fysiologisk transendotelstrøm og forskellige vaskulære endotelvækstfaktor (VEGF) fordelinger samtidigt. MIEN-modellen kan let anvendes til undersøgelse af neovasculariseringsmekanisme og har et potentielt løfte som en billig platform for lægemiddelscreening og toksikologiapplikationer.

Den in vitro 3D-model til at efterligne den første tilfælde af neovascularization (MIEN) præsenteret her bestod af en mikrofluidisk spirende chip og et mikrofluidisk kontrolsystem. Den mikrofluidiske spirechip blev optimeret fra tidligere publikationer22,23,37,40,51,52,53. Kort s...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization at JoVE.com

Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization

Her leverer vi en mikrofluidisk chip og et automatisk kontrolleret, meget effektivt cirkulationsmikrobielt system, der opsummerer det oprindelige mikromiljø af neovascularisering, så endotelceller (ECs) stimuleres af høj lysforskydningsbelastning, fysiologisk niveau af transendotelstrøm og forskellige vaskulære endotelvækstfaktor (VEGF) samtidigt.

Mikrofluidisk model til at efterligne indledende hændelse af Neovascularization

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the ...

Neovascularization, generering af nye blodkar er en stærkt reguleret proces i både normale og patologiske begivenheder. For bedre at forstå neovascularization, er det vigtigt at rekonstruere processen i naturlige cellulære mikromiljø in vitro. Vi har udviklet en mikrofluidic chip og automatisk kontrol.Meget effektive cirkulationer er gjort for at danne perfusion mikro-rør og simulere at bruge proteinet til at opsummere til den oprindelige begivenhed af nye vaskularisering. Den mikrofluidiske spirende chip bestod af tre kanaler. En endotelcellekulturkanal og en flydende kanal blev adskilt af en bred central hydrogelkanal.Det mikrofluidiske kontrolsystem bestod af en mikrosyringepumpe og en elektromagnetisk klemmeventil. En boblefældechip, en mikrofluidisk spirende chip, en mikroperistaltisk pumpe og et kulturmediumreservoir. Med et mikrofluidisk system kunne endotelceller stimuleres af høj luminal forskydningsstress, fysiologisk niveau af transendotelstrøm og forskellige vaskulære endotelvækstfaktorfordelinger samtidigt.Pipette 20 mikroliter på 125 mikrogram pr milliliter fibronectin i et medie injektion port cellekultur kanal. Skær en pipette spids til at passe havnen i celle kultur kanal med en saks. Sæt pipettespidsen i den anden medieindsprøjtningsport på cellekulturkanalen.Derefter pipette ud luft fra celle kultur kanal til at fylde den med fibronectin. Inkuber chipsene ved 37 grader Celsius i en time. Før cellesåning pipetter 20 mikroliter endotelcellemedie ind i hver medieindsprøjtningsport og inkuberer chipsene ved 37 grader Celsius i 30 minutter.Derefter pipette alle medier i alle medier injektion porte. Dernæst pipette fem microliter af celle suspension i et medie injektion port cellekultur kanal. Derefter spredte endotelceller sig hurtigt over hele kanalen under differentieret hydrostatisk tryk.Tilføj omkring fire til seks mikroliter ECM-medier til den anden port for at justere det hydrostatiske tryk og stoppe celleflytning. Fjern chipsene til celleinkubatoren. Drej derefter chipsene hvert 30. minut, indtil endotelcellerne frakker rundt om den indre overflade af cellekulturkanalen, to timer senere.Brug pipettespidsen til at fjerne vedhæftede celler i injektionsportene meget omhyggeligt. Indsæt derefter fire piggede kvindelige Luer-adaptere i medieindsprøjtningsportene og fyld med ECM-medier. Fjern chipsene til celleinkubatoren, skift ECM-medier og Luer-adaptere hver 12. time.For at samle det mikrofluidiske kontrolsystem skal du forberede to polytetrafluorethylenrør, to korte silikonerør, tre lange silikonerør, en pigtrådshun Luer-adapter, et stik af Y-typen og derefter tre L-stik. Fyld sprøjten med 10 milliliter forvarmet ECM-medium. Tilslut et polytetrafluorethylenrør til sprøjten af en barbed kvindelig Luer-adapter.Tilslut derefter den anden ende af polytetrafluorethylenrøret til et stik af typen Y. Tilslut derefter to lange silikonerør til de to andre ender af Y-typestik. Vi bruger et rør til at oprette forbindelse til reservoiret og det andet rør til at oprette forbindelse til boblefældechip.Tilslut et andet langt silikonerør til reservoiret. Derefter skal du bruge to korte silikonerør til at forbinde alle indløbs- og udløbshuller på det øverste lag af boblefældechip. Tilslut et polytetrafluorethylenrør til chippens bagende.Derefter fastgøres en sprøjte på microsyringe-pumpen. Klip to lange silikonerør ind i den elektromagnetiske klemmeventil. Skift derefter den elektromagnetiske klemmeventil for at åbne rørledningen mellem sprøjten og reservoiret.Injicer medier til reservoiret ved hjælp af microsyringe pumpe til udstødningsluft i røret. Skift derefter ventilen igen for at åbne rørledningen mellem sprøjten og boblefældechippen. Injicer medier for at fylde væskekammeret og bagrøret af boblefældechippen.Tag ud endotel spirende chips fra celle inkubator, og fjern derefter Luer-adaptere på cellekultursiden. Sæt to rørpropper i hydrogelindsprøjtningsportene af mikrofluidisk spiringschip. Tilslut bagenden rør boble fælde chip til en port af celle kultur kanal.Sæt et T-stik til den anden port, og tilslut det til et langt siliciumrør, der er forbundet med reservoiret. Klip det lange silikonerør ind i mikroperistaltisk pumpe. Indsæt derefter et luftfilter til reservoiret.Derefter samles den mikrofluidiske spiringschip til scenepladeinkubatoren. Tilslut derefter vakuumpumpen til hullerne i det nederste lag af boblefældechippen med et TPU-rør. Sæt modsatte cirkulation volumen og en strømningshastighed i det brugerdefinerede program, der styrer microsyringe pumpe og elektromagnetisk knivspids ventil samtidigt.Dernæst skal du indstille strømningshastigheden af mikroperistaltisk pumpe. Tænd for microsyringe pumpen. Derefter etableres cirkulationskontrolsystemet.Vi tester barrierefunktionen for nogle mikrobeholdere i vores model ved at måle den diffusionelle permeabilitetskoefficient på 40 kDa F-I-T-C dextrin. Som det fremgår af figuren, er diffusionskoefficienten for statisk dyrkningschip med celleforing 0,1 plus eller minus 0,3 mikrometer pr. sekund. Og den diffusionelle permeabilitetskoefficient for tom kanal uden celleforing er 5,4 plus eller minus 0,7 mikrometer pr. Sekund.Endotelspirende analyse viste, at endotelceller spirede ind i den centrale hydrogel stort set efter 24 timers statisk dyrkning, mens graden af spiring faldt betydeligt med stigningen i luminal forskydningsstress. Kvantitativt faldt luminal shear stress endotelspiring betydeligt med hensyn til spiringsområde, gennemsnitlig spiringslængde og den længste spirelængde. Med vores system kan forskydningsbelastning på endotelceller eventuelt ændres når som helst under eksperimentet, mens transendotelflowet forblev på fysiologisk niveau.Denne in vitro 3D biomimetiske model kan anvendes direkte til undersøgelse af neovasularisering mekanisme, og holder det potentielle løfte som en billig platform for narkotika screening og toksikologi applikationer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Mikrofluid chip fabrikation og metode til at påvise Influenza

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

En Mikrofluid Teknik til sonde Cell deformerbarhed

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

A Microfluidic Model of Biomimetically Breathing Pulmonary Acinar Airways

Mikrofluidapparat Model of Biomimetically Breathing Pulmonal Acinar Airways

Quantifying respiratory flow characteristics in the pulmonary acinar depths and how they influence inhaled aerosol transport is critical towards ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

Brug Adhesive mønstret Konstruér 3D Paper mikrofluidenheder

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikrofluid Flow Chambers Brug Rekonstitueret Blood til Model Hæmostase og trombocytinfusion<em&gt; In vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Multi-trins Variabel Højde Fotolitografi for med ventiler Multilayer mikrofluidenheder

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Indledende vurdering af antistof-konjugater modificeret med Viral-afledte peptider til at øge cellulære ophobning og forbedring af Tumor målretning

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...