Name: microfluidic model to mimic initial event of neovascularization
Uploaded: 2021-04-10T13:00:00
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Ces travaux ont été appuyés par la National Natural Science Research Foundation of China Grants-in-Aid (subvention nos 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 et 32071311), Programme national clé de recherche et développement de la Chine (subvention nos 2016YFC1101101 et 2016YFC1102202), le projet 111 (B13003), et la Fondation des sciences naturelles de Beijing (4194079).

1. Préparation des gaufrettes
REMARQUE : Ce protocole est spécifique pour le photorésiste négatif SU-8 2075 utilisé au cours de cette recherche.
<ol><li>Nettoyez la plaquette de silicium 3 à 5 fois avec du méthanol et de l'isopropanol sur un revêtement de spin comme suit : d'abord tourner pendant 15 s à 500 rpm, puis tourner pendant 60 s à 3 000 tours.</li>
	<li>Transférer la plaquette de silicium sur une plaque chauffante, préchauffée à 180 °C et cuire la gaufrette pendant 10...

Pendant longtemps, l'observation en temps réel de la néovascularisation a été un problème. Plusieurs approches ont été développées récemment pour créer des vaisseaux perfusés tapissant avec des CE et adjacents à la matrice extracellulairepour germer 22,32,40,46,54, mais le microenvironnement mécanique est encore difficile à maintenir constamment...

La néovascularisation se produit dans de nombreux processus normaux et pathologiques1,2,3,4, qui comprennent deux processus majeurs chez les adultes, l'angiogenèse et l'artériogenèse5. Outre les facteurs de croissance les plus connus, tels que le facteur vasculaire de croissance endothéliale (VEGF)6, les stimulations mécaniques, en particulier le stress de cisaillement induit par le flux sanguin, est important dans la régulation de la néovascularisation7. Comme nous le savons, l'ampleur et les formes de stress de cisaillement varient considérablement et dynamiquement dans différentes parties de la vascularisation, entraînant des effets importants sur les cellulesvasculaires 8,9,10,11,12. Des études antérieures ont montré que le stress du cisaillement peut affecter divers aspects des CE, y compris les changements phénotypiques cellulaires, la transduction du signal, l'expression des gènes et la communicationavec les cellules murales 13,14,15,16,17,18,19,20; par conséquent, réglementer la néovascularisation21,22,23,24.
Par conséquent, pour mieux comprendre la néovascularisation, il est important de reconstruire le processus en microenvironnement cellulaire naturel in vitro. Récemment, de nombreux modèles ont été mis en place pour créer des micro-navires et fournir un contrôle précis du microenvironnement25,26,27, en profitant des progrès de la microfabrication et de la technologie microfluidique. Dans ces modèles, les micro-navires peuvent être générés par hydrogel28,29, polydimethylsiloxane (PDMS) puces microfluidiques30,31,32 ou bioimpression 3D33,34. Certains aspects du microenvironnement, tels que le stress de cisaillement luminal22,23,35,36, flux transendothelial37,38,39,40, gradient biochimique des facteurs angiogéniques41,42, souche / étirement43,44,45, et co-cultivé avec d'autres types de cellules32,46 ont été imités et contrôlés. Habituellement, un grand réservoir ou une pompe à seringues était utilisé pour fournir un milieu perfusé. Le flux transendothelial dans ces modèles a été créé par la baisse de pression entre le réservoir et le micro-tube22,23,38,40. Cependant, le microenvironnement mécanique était difficile à maintenir constamment de cette façon. Le débit transendothelial augmenterait et dépasserait alors le niveau physiologique si un taux d'écoulement élevé avec le stress élevé de cisaillement a été employé pour la perfusion. L'étude précédente a prouvé qu'à la période initiale de la néovascularisation, la vitesse du flux transendothelial est très basse en raison des CE intacts et de la membrane de sous-sol, habituellement sous 0.05 μm/s8. Pendant ce temps, bien que le stress de cisaillement luminal dans le système vasculaire varie considérablement, il est relativement élevé avec des valeurs moyennes de 5-20 dyn/cm2,11,47. Pour l'instant, la vitesse du flux transendothelial dans les travaux précédents ont été généralement maintenus entre 0,5-15 μm/s22,38,39,40, et le stress de cisaillement luminal était généralement inférieure à 10 dyn/cm2 23. Il reste un sujet difficile d'exposer constamment les CE à l'effort de cisaillement luminal élevé et au niveau physiologique du flux transendothelial simultanément.
Dans la présente étude, nous décrivons un modèle 3D in vitro pour imiter l'événement initial de la néovascularisation (MIEN). Nous avons développé une puce microfluidique et un système de circulation automatique, très efficace pour former des micro-tubes de perfusion et simuler le processus de germination48. Avec le modèle MIEN, le microenvironnement des CE stimulé à la période initiale de néovascularisation est d'abord récapitulé. Les CE peuvent être stimulés par un stress de cisaillement luminal élevé, un niveau physiologique de flux transendothelial et diverses distributions de VEGF simultanément. Nous décrivons en détail les étapes de l'établissement du modèle MIEN et les points clés à prendre en compte, dans l'espoir de fournir une référence à d'autres chercheurs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Genview</td>
			<td>GP3108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electromagnetic pinch valve</td>
			<td>Wokun Technology</td>
			<td>WK02-308-1/3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell medium (ECM)</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Every Green</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran</td>
			<td>Miragen</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphical programming environment</td>
			<td>Lab VIEW</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image editing software</td>
			<td>PhotoShop</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing program</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>91237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithography equipment</td>
			<td>Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences</td>
			<td>URE-2000/35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>82762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-peristaltic pump</td>
			<td>Lead Fluid</td>
			<td>BT101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-syringe pump</td>
			<td>Lead Fluid</td>
			<td>TYD01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma</td>
			<td>MING HENG</td>
			<td>PDC-MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent epoxy negative photoresist</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene</td>
			<td>Teflon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Program software</td>
			<td>MATLAB</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF-165</td>
			<td>StemImmune LLC</td>
			<td>HVG-VF5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.06498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Phalloidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic model to mimic initial event of neovascularization

La néovascularisation est habituellement paraphée à partir d'une vascularisation normale existante et le microenvironnement biomécanique des cellules endothéliales (CE) à l'étape initiale varie considérablement du processus suivant de néovascularisation. Bien qu'il existe de nombreux modèles pour simuler les différentes étapes de la néovascularisation, un modèle 3D in vitro qui capitule le processus initial de néovascularisation sous les stimulations correspondantes des microenvironnements vasculature normale fait encore défaut. Ici, nous avons reconstruit un modèle 3D in vitro qui imite l'événement initial de la néovascularisation (MIEN). Le modèle MIEN contient une puce de germination microfluidique et un système de circulation automatique et très efficace. Un microcanal fonctionnel et perfusable recouvert d'endothélium a été formé et le processus de germination a été simulé dans la puce de germination microfluidique. Le microenvironnement initialement physiologique de la néovascularisation a été récapitulé avec le système de contrôle microfluidique, par lequel les CE seraient exposés à l'effort élevé de cisaillement luminal, au flux transendothelial physiologique, et à diverses distributions vasculaires de facteur de croissance endothéliale (VEGF) simultanément. Le modèle MIEN peut être facilement appliqué à l'étude du mécanisme de néovascularisation et détient une promesse potentielle en tant que plate-forme à faible coût pour le dépistage des médicaments et les applications toxicologiques.

Le modèle 3D in vitro pour imiter l'événement initial de néovascularisation (MIEN) présenté ici se composait d'une puce de germination microfluidique et d'un système de contrôle microfluidique. La puce de germination microfluidique a été optimisée à partir des publicationsprécédentes 22,23,37,40,51,52<s...

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Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization

Ici, nous fournissons une puce microfluidique et un système microfluidique de circulation automatiquement contrôlé et très efficace qui récapitule le microenvironnement initial de la néovascularisation, permettant aux cellules endothéliales (CE) d'être stimulées simultanément par un stress de cisaillement luminal élevé, un niveau physiologique de flux transendothelial et diverses distributions simultanées du facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF).

Modèle microfluidique pour imiter l&apos;événement initial de la néovascularisation

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the ...

La néovascularisation, la génération de nouveaux vaisseaux sanguins est un processus très réglementé dans les événements normaux et pathologiques. Pour mieux comprendre la néovascularisation, il est important de reconstruire le processus en microenvironnement cellulaire naturel in vitro. Nous avons développé une puce microfluidique et un contrôle automatique.Des circulations très efficaces sont effectuées pour former des micro-tubes de perfusion et simuler l’utilisation de la protéine pour récapituler à l’événement initial d’une nouvelle vascularisation. La puce germinante microfluidique était composée de trois canaux. Un canal de culture cellulaire endothéliale et un canal liquide ont été séparés par un large canal hydrogel central.Le système de commande microfluidique était composé d’une pompe à microsyringe et d’une valve électromagnétique de pincement. Une puce de piège à bulles, une puce de germination microfluidique, une pompe micro-périssaltique et un réservoir moyen de culture. Avec un système microfluidique, les cellules endothéliales pourraient être stimulées par le stress de cisaillement luminal élevé, le niveau physiologique du flux transendothelial et diverses distributions vasculaires de facteur de croissance endothéliale simultanément.Pipette 20 microlitres de 125 microgrammes par millilitre de fibronectine dans un port d’injection médiatique du canal de culture cellulaire. Couper une pointe de pipette pour s’adapter au canal de culture cellulaire avec des ciseaux. Insérez la pointe pipette dans l’autre port d’injection multimédia du canal de culture cellulaire.Ensuite, pipette de l’air du canal de culture cellulaire pour le remplir de fibronectine. Incuber les copeaux à 37 degrés Celsius pendant une heure. Avant l’ensemencement cellulaire, pipette 20 microlitre de milieu cellulaire endothélial dans chaque port d’injection médiatique et incuber les copeaux à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.Ensuite, pipette tous les médias dans tous les ports d’injection des médias. Ensuite, pipette cinq microlitres de suspension cellulaire dans un port d’injection de médias de canal de culture cellulaire. Ensuite, les cellules endothéliales se propagent rapidement sur l’ensemble du canal sous pression hydrostatique différentielle.Ajouter environ quatre à six microlitres de supports ECM à l’autre port pour ajuster la pression hydrostatique et arrêter le déplacement des cellules. Éloignez les puces à l’incubateur cellulaire. Ensuite, retournez les copeaux toutes les 30 minutes jusqu’à ce que les cellules endothéliales s’enrobent autour de la surface interne du canal de culture cellulaire, deux heures plus tard.Utilisez la pointe pipette pour enlever très soigneusement les cellules attachées dans les ports d’injection. Ensuite, insérez quatre adaptateurs Luer femelles barbelés dans les ports d’injection des médias et remplissez-les de supports ECM. Retirez les puces dans l’incubateur cellulaire, changez les supports ECM et les adaptateurs Luer toutes les 12 heures.Pour assembler le système de commande microfluidique, préparez deux tubes en polytétrafluoroéthylène, deux tubes courts en silicone, trois longs tubes en silicone, un adaptateur Luer femelle barbelé, un connecteur de type Y, puis trois connecteurs de type L. Remplissez la seringue de 10 millilitres de milieu ECM préchauffé. Connectez un tube de polytétrafluoroéthylène à la seringue par un adaptateur Luer femelle barbelé.Ensuite, connectez l’autre extrémité du tube de polytétrafluoroéthylène à un connecteur de type Y. Ensuite, connectez deux longs tubes en silicone aux deux autres extrémités du connecteur de type Y. Nous utilisons un tube pour nous connecter au réservoir et à l’autre tube pour nous connecter à la puce du piège à bulles.Connectez un autre long tube de silicone au réservoir. Ensuite, utilisez deux courts tubes en silicone pour connecter tous les trous d’entrée et de sortie sur la couche supérieure de puce piège à bulles. Connectez un tube de polytétrafluoroéthylène à l’arrière de la puce.Ensuite, fixez une seringue sur la pompe à microsyringe. Clip deux longs tubes de silicone dans la valve de pincement électromagnétique. Ensuite, passez la valve de pincement électromagnétique pour ouvrir le pipeline entre la seringue et le réservoir.Injecter des supports dans le réservoir à l’aide d’une pompe à microsyringe pour épuiser l’air dans le tube. Ensuite, changez à nouveau la vanne pour ouvrir le pipeline entre la seringue et la puce du piège à bulles. Injecter des supports pour remplir la chambre liquide et le tube de backend de la puce de piège à bulles.Sortez les copeaux de germination endothéliale de l’incubateur cellulaire, puis retirez les adaptateurs Luer du côté de la culture cellulaire. Insérez deux bouchons de tuyaux dans les ports d’injection d’hydrogel de la puce de germination microfluidique. Connectez le tube arrière de la puce de piège à bulles à un port de canal de culture cellulaire.Insérez un connecteur de type T à l’autre port et connectez-le à un long tube de silicium relié au réservoir. Couper le long tube de silicone dans la pompe micro périssaltique. Ensuite, insérez un filtre à air dans le réservoir.Ensuite, assemblez la puce de germination microfluidique à l’incubateur supérieur de scène. Ensuite, connectez la pompe à vide aux trous dans la couche inférieure de la puce de piège à bulles par un tube TPU. Réglez simultanément le volume de circulation opposé et un débit dans le programme personnalisé qui contrôle simultanément la pompe à microsyringe et la soupape électromagnétique de pincement.Ensuite, configurer le débit de la pompe micro périsaltique. Allumez la pompe à microsyringe. Ensuite, le système de contrôle de la circulation est établi.Nous testons la fonction barrière de certains micro-vaisseaux de notre modèle en mesurant le coefficient de perméabilité diffusionnelle de 40 kDa F-I-T-C dextrine. Comme il est indiqué dans la figure, le coefficient de perméabilité diffusionnelle de la puce de culture statique avec doublure cellulaire est de 0,1 plus ou moins 0,3 micromètre par seconde. Et le coefficient de perméabilité diffusionnelle du canal vide sans doublure cellulaire est de 5,4 plus ou moins 0,7 micromètre par seconde.L’essai endothélial de germination a prouvé que les cellules endothéliales ont germé dans l’hydrogel central en grande partie après 24 heures de culture statique, alors que le degré de germination a sensiblement diminué avec l’augmentation du stress de cisaillement luminal. Quantitativement, le stress de cisaillement luminal a diminué la germination endothéliale de manière significative en termes de zone de germination, de longueur moyenne de germination, et de la plus longue longueur de pousse. Avec notre système, le stress de cisaillement sur les cellules endothéliales pourrait être changé en option à tout moment pendant l’expérience tandis que le flux transendothelial est resté au niveau physiologique.Ce modèle biomimétique 3D in vitro peut être directement appliqué à l’étude du mécanisme de néosularisation, et tient la promesse potentielle comme plate-forme à faible coût pour le dépistage des médicaments et les applications toxicologiques.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

Recherche

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