Name: microfluidic model to mimic initial event of neovascularization
Uploaded: 2021-04-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית לחקר מדעי הטבע של סין מענקים בסיוע (מענק מס ' 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 ו- 32071311), תוכנית מחקר ופיתוח מפתח לאומית של סין (מענק מס ' 2016YFC110110101 ו- 2016YFC102202), פרויקט 111 (B13003) והקרן למדעי הטבע של בייג'ינג (4194079).

1. הכנת וופל
הערה: פרוטוקול זה הוא ספציפי עבור SU-8 2075 פוטורסיסט שלילי בשימוש במהלך מחקר זה.
<ol><li>נקה את רקיק הסיליקון 3 עד 5 פעמים עם מתנול ואיזופרופנול על מעיל ספין כדלקמן: ספין ראשון במשך 15 שניות ב 500 סל"ד, ולאחר מכן להסתובב במשך 60 s ב 3,000 סל"ד.</li>
	<li>מעבירים את רקיק הסיליקון לפירה,...

במשך זמן רב, התבוננות בזמן אמת של neovascularization כבר בעיה. מספר גישות פותחו לאחרונה כדי ליצור רירית כלי perfused עם ECs וצמוד מטריצה חוץ תאית עבורנבטים 22,32,40,46,54, אבל microenvironment מכני עדיין קשה לשמור כל הזמן. זה נשאר ...

Neovascularization קורה בתהליכים נורמליים ופתולוגיים רבים1,2,3,4, הכוללים שני תהליכים עיקריים במבוגרים, אנגיוגנזה ו arteriogenesis5. מלבד גורמי הגדילה הידועים ביותר, כגון גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF)6, גירויים מכניים, במיוחד את זרימת הדם המושרה מתח גזירה, חשוב ברגולציה של neovascularization7. כידוע, סדר הגודל וצורות הלחץ הגזירה משתנים באופן דרמטי ודינמי בחלקים שונים של כלי הדם, וכתוצאה מכך השפעות חשובות על תאי כלי הדם8,9,10,11,12. מחקרים קודמים הראו כי מתח גזירה עשוי להשפיע על היבטים שונים של ECs, כולל שינויים פנוטיפיים של התא, התמרות אותות, ביטוי גנים, ואת התקשורת עם תאים ציורי קיר13,14,15,16,17,18,19,20; לפיכך, לווסת neovascularization21,22,23,24.
לכן, כדי להבין טוב יותר neovascularization, חשוב לשחזר את התהליך microenvironment הסלולר הטבעי במבחנה. לאחרונה, מודלים רבים הוקמו כדי ליצור מיקרו כלי ולספק שליטה מדויקת של microenvironment25,26,27, ניצול ההתקדמות microfabrication וטכנולוגיה microfluidic. בדגמים אלה, מיקרו-כלי יכול להיווצר על ידי הידרוג'ל28,29, polydimethylsiloxane (PDMS) שבבים מיקרופלואידיים30,31,32 או 3D bioprinting33,34. היבטים מסוימים של המיקרו-ווירונימנט, כגון מתח גזירה זוהר22,23,35,36, זרימה transendothelial37,38,39,40, שיפוע ביוכימי של גורמים אנגיוגניים41,42, זן / מתיחה43,44,45, ושיתוף עם סוגים אחרים של תאים32,46 כבר חיקו ונשלטו. בדרך כלל, מאגר גדול או משאבת מזרק שימש לספק מדיום perfused. זרימה טרנסנדותלאלית בדגמים אלה נוצרה על ידי ירידה בלחץ בין המאגר למיקרו צינור22,23,38,40. עם זאת, microenvironment מכני היה קשה לשמור כל הזמן בדרך זו. זרימת Transendothelial יגדל ולאחר מכן יעלה על הרמה הפיזיולוגית אם קצב זרימה גבוה עם מתח גזירה גבוה שימש זלוף. מחקר קודם הראה כי בתקופה הראשונית של neovascularization, המהירות של זרימה transendothelial הוא נמוך מאוד בשל ECs שלמים קרום המרתף, בדרך כלל תחת 0.05 מיקרומטר / s8. בינתיים, למרות מתח גזירה זוהר במערכת כלי הדם משתנה מאוד, הוא גבוה יחסית עם ערכים ממוצעים של 5-20 dyn / cm2,11,47. לעת עתה, המהירות של זרימה transendothelial בעבודות קודמות נשמרו בדרך כלל בין 0.5-15 מיקרומטר / s22,38,39,40, ואת הלחץ גזירה זוהר היה בדרך כלל תחת 10 dyn / cm2 23. זה נשאר נושא קשה כל הזמן לחשוף ECs ללחץ גזירה זוהר גבוה ורמה פיזיולוגית של זרימה transendothelial בו זמנית.
במחקר הנוכחי, אנו מתארים מודל 3D במבחנה לחקות את האירוע הראשוני של neovascularization (MIEN). פיתחנו שבב מיקרופלואידי ומערכת שליטה אוטומטית ויעילה ביותר ליצירת מיקרו-צינורות זלוף ולדמות את תהליך הנבטה48. עם מודל MIEN, microenvironment של ECs מגורה בתקופה הראשונית של neovascularization הם תחילה recapitulated. ECs יכול להיות מגורה על ידי מתח גזירה זוהר גבוה, רמה פיזיולוגית של זרימה transendothelial והתפלגות VEGF שונים בו זמנית. אנו מתארים את השלבים של ביסוס מודל MIEN בפירוט ואת נקודות המפתח שיש לשים לב אליהן, בתקווה לספק התייחסות לחוקרים אחרים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Genview</td>
			<td>GP3108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electromagnetic pinch valve</td>
			<td>Wokun Technology</td>
			<td>WK02-308-1/3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell medium (ECM)</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Every Green</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran</td>
			<td>Miragen</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphical programming environment</td>
			<td>Lab VIEW</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image editing software</td>
			<td>PhotoShop</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing program</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>91237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithography equipment</td>
			<td>Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences</td>
			<td>URE-2000/35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>82762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-peristaltic pump</td>
			<td>Lead Fluid</td>
			<td>BT101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-syringe pump</td>
			<td>Lead Fluid</td>
			<td>TYD01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma</td>
			<td>MING HENG</td>
			<td>PDC-MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent epoxy negative photoresist</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene</td>
			<td>Teflon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Program software</td>
			<td>MATLAB</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF-165</td>
			<td>StemImmune LLC</td>
			<td>HVG-VF5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.06498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Phalloidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic model to mimic initial event of neovascularization

Neovascularization הוא בדרך כלל מאותחל מן כלי הדם הנורמלי הקיים ואת microenvironment biomechanical של תאי אנדותל (ECs) בשלב הראשוני משתנה באופן דרמטי מן התהליך הבא של neovascularization. אמנם יש שפע של מודלים כדי לדמות שלבים שונים של neovascularization, מודל 3D במבחנה כי נכנע את התהליך הראשוני של neovascularization תחת הגירויים המתאימים של microenvironments כלי דם נורמלי עדיין חסר. כאן, שיחזרנו מודל 3D במבחנה המחקה את האירוע הראשוני של neovascularization (MIEN). דגם ה-MIEN מכיל שבב נבט מיקרופלואידי ומערכת מחזור אוטומטית ויעילה ביותר. מיקרוצ'נל פונקציונלי וניתן לחלחל מצופה אנדותל נוצר ותהליך הנבטה היה מדומה בשבב הנבט המיקרופלואידי. המיקרו-ווירוניזציה הפיזיולוגית הראשונית של הניאו-סקולריזציה סוכם מחדש עם מערכת הבקרה המיקרופלואידית, שבאמצעותה ECs ייחשפו ללחץ גזירה לומינלי גבוה, זרימה טרנסנדותליאלית פיזיולוגית, והתפלגויות שונות של גורם גדילה אנדותל בכלי הדם (VEGF) בו זמנית. מודל MIEN יכול להיות מיושם בקלות על המחקר של מנגנון neovascularization ומחזיק הבטחה פוטנציאלית כפלטפורמה בעלות נמוכה עבור סינון תרופות ויישומי טוקסיקולוגיה.

מודל 3D במבחנה לחקות את האירוע הראשוני של neovascularization (MIEN) המוצג כאן כלל שבב נבטי מיקרופלואידי ומערכת בקרה מיקרופלואידית. שבב הנבט המיקרופלואידי היה אופטימיזציה מפרסומיםקודמים 22,23,37,40,51,<sup clas...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization at JoVE.com

Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization

כאן, אנו מספקים שבב microfluidic ומערכת מיקרופלואידית במחזור מבוקרת ויעילה מאוד באופן אוטומטי, כי מסכם את microenvironment הראשונית של neovascularization, המאפשר לתאי אנדותל (ECs) להיות מגורה על ידי מתח גזירה זוהר גבוה, רמה פיזיולוגית של זרימה transendothelial, גורם צמיחה אנדותל כלי דם שונים (VEGF) הפצה בו זמנית.

מודל מיקרופלואידי לחקות אירוע ראשוני של ניאו-סקולריזציה

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the ...

Neovascularization, יצירת כלי דם חדשים הוא תהליך מוסדר מאוד באירועים נורמליים ופתולוגיים כאחד. כדי להבין טוב יותר את הניאו-סקולריזציה, חשוב לשחזר את התהליך במיקרו-וירוס תאי טבעי במבחנה. פיתחנו שבב מיקרופלואידי ובקרה אוטומטית.מחזורים יעילים מאוד נעשה כדי ליצור מיקרו צינורות זלוף לדמות להשתמש בחלבון כדי recapitulate לאירוע הראשוני של כלי דם חדשים. שבב הנבט המיקרופלואידי היה מורכב משלושה ערוצים. ערוץ תרבית תאי אנדותל וערוץ נוזלי הופרדו על ידי ערוץ הידרוג'ל מרכזי רחב.מערכת הבקרה המיקרופלואידית הורכבה ממשאבת מיקרו-סירינג ושסתום צביטה אלקטרומגנטי. שבב מלכודת בועה, שבב נבט מיקרופלואידי, משאבה מיקרו-פריסטלית ומאגר תרבות בינוני. עם מערכת microfluidic, תאים אנדותל יכול להיות מגורה על ידי מתח גזירה זוהר גבוה, רמה פיזיולוגית של זרימה transendothelial והתפלגות גורם גדילה אנדותל כלי דם שונים בו זמנית.פיפט 20 מיקרוליטר של 125 מיקרוגרם למיליליטר של פיברונקטין ליציאת הזרקת מדיה אחת של ערוץ תרבות התא. חותכים קצה פיפטה כדי להתאים את היציאה של ערוץ תרבות התא עם מספריים. הכנס את קצה הפיפט ליציאת הזרקת המדיה האחרת של ערוץ תרבות התאים.לאחר מכן, פיפטה את האוויר מערוץ תרבות התא כדי למלא אותו עם פיברונקטין. דגירה השבבים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לפני זריעת תאים, פיפטה 20 מיקרוליטר של מדיום תא אנדותל לתוך כל יציאת הזרקת מדיה להדגיר את השבבים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.לאחר מכן, פיפטה הוציאה את כל המדיה בכל יציאות הזרקת המדיה. לאחר מכן, פיפטה חמש מיקרוליטר של השעיית תאים ליציאת הזרקת מדיה אחת של ערוץ תרבות התא. לאחר מכן, תאי אנדותל התפשטו במהירות על פני התעלה כולה תחת לחץ הידרוסטטי דיפרנציאלי.הוסף כארבעה עד שישה מיקרוליטר של מדיה ECM ליציאה השנייה כדי להתאים את הלחץ ההידרוסטטי ולהפסיק את נעת התא. תריח את השבבים לחממה הסלולרית. לאחר מכן, להפוך את השבבים כל 30 דקות עד תאי אנדותל מעיל סביב פני השטח הפנימיים של ערוץ תרבות התא, שעתיים מאוחר יותר.השתמש טיפ פיפטה כדי להסיר תאים מחוברים ביציאות ההזרקה בזהירות רבה. לאחר מכן, הכנס ארבעה מתאמי Luer נקבה דוקרני לתוך יציאות הזרקת מדיה ולמלא עם מדיה ECM. הסר את השבבים לאינקובטור התא, לשנות מדיה ECM ומתאמי לור כל 12 שעות.כדי להרכיב את מערכת הבקרה המיקרופלואידית, הכינו שני צינורות פוליטרה-פלואורותילן, שני צינורות סיליקון קצרים, שלושה צינורות סיליקון ארוכים, מתאם לואר נקבה דוקרני אחד, מחבר אחד מסוג Y ולאחר מכן שלושה מחברים מסוג L. ממלאים את המזרק ב-10 מיליליטר של מדיום ECM שחומם מראש. חבר צינור פוליטרפלואורותילן למזרק על ידי מתאם לואר נקבה דוקרני.לאחר מכן, חבר את הקצה השני של צינור פוליטרה-פלואוראתילן למחבר מסוג Y. לאחר מכן, חבר שני צינורות סיליקון ארוכים לשני הקצוות האחרים של מחבר מסוג Y. אנחנו משתמשים בצינור אחד כדי להתחבר למאגר ולצינור השני כדי להתחבר לשבב מלכודת בועה.חבר צינור סיליקון ארוך נוסף למאגר. לאחר מכן, השתמש בשני צינורות סיליקון קצרים כדי לחבר את כל חורי כניסת ושקע בשכבה העליונה של שבב מלכודת בועה. חבר צינור פוליטרה-פלואורותילן לחלק האחורי של השבב.לאחר מכן, לתקן מזרק על משאבת מזרק מיקרו. תקצץ שני צינורות סיליקון ארוכים לתוך שסתום הצביטה האלקטרומגנטית. לאחר מכן, החלף את שסתום הצביטה האלקטרומגנטית כדי לפתוח את הצינור בין המזרק למאגר.להזריק מדיה למאגר באמצעות משאבת microsyringe כדי למצות את האוויר בצינור. לאחר מכן, החלף שוב את השסתום כדי לפתוח את הצינור בין המזרק לשבב מלכודת הבועה. להזריק מדיה כדי למלא את התא הנוזלי צינור backend של שבב מלכודת בועה.מוציאים שבבי נבטי אנדותל מאינקובטור התאים, ואז מסירים מתאמי לור בצד תרבות התא. הכנס שני תקעי צינור ליציאות הזרקת הידרוג'ל של שבב נבט מיקרופלואידי. חבר את הצינור האחורי של שבב מלכודת בועה ליציאה אחת של ערוץ תרבות התא.הכנס מחבר מסוג T ליציאה האחרת וחבר אותו לצינור סיליקון ארוך המחובר למאגר. חותכים את צינור הסיליקון הארוך לתוך משאבת מיקרו פריסטלית. לאחר מכן, הכנס מסנן אוויר למאגר.לאחר מכן, להרכיב את שבב נבטי מיקרופלואידי לחממה העליונה הבמה. לאחר מכן, חבר את משאבת הוואקום לחורים בשכבה התחתונה של שבב מלכודת בועה על ידי צינור TPU. הגדר נפח מחזור הפוך וקצב זרימה בתוכנית המותאמת אישית השולטת במשאבת microsyringe ושסתום קמצוץ אלקטרומגנטי בו זמנית.לאחר מכן, הגדר את קצב הזרימה של משאבה מיקרו פריסטלית. הפעל את משאבת המיקרו-מזרק. לאחר מכן, מערכת בקרת זרימת הדם הוקמה.אנו בודקים את פונקציית המחסום של כמה מיקרו-כלי במודל שלנו על ידי מדידת מקדם החדירות הדיפוזינלי של 40 kDa F-I-T-C dextrin. כפי שמוצג באיור, מקדם החדירות הדיפוזיונית של שבב תרבות סטטית עם רירית התא הוא 0.1 פלוס או מינוס 0.3 מיקרומטר לשנייה. ומקדם החדירות הדיפוזינלי של ערוץ ריק ללא בטנת תאים הוא 5.4 פלוס או מינוס 0.7 מיקרומטר לשנייה.בדיקת נבטי אנדותל הראתה כי תאי אנדותל צמחו לתוך הידרוג'ל המרכזי בעיקר לאחר 24 שעות של פולחן סטטי, בעוד מידת הנבטים ירדה באופן משמעותי עם העלייה של מתח גזירה זוהר. מבחינה כמותית, לחץ גזירה זוהר ירד נבטי אנדותל באופן משמעותי במונחים של שטח נבטים, אורך נבט ממוצע, ואת אורך הנבט הארוך ביותר. עם המערכת שלנו, לחץ גזירה על תאי אנדותל יכול להיות שונה באופן אופציונלי בכל עת במהלך הניסוי בעוד זרימת transendothelial נשאר ברמה הפיזיולוגית.מודל זה במבחנה 3D ביומימטי יכול להיות מיושם ישירות על המחקר של מנגנון neovasularization, ומחזיק את ההבטחה הפוטנציאלית כפלטפורמה בעלות נמוכה עבור סינון תרופות ויישומי טוקסיקולוגיה.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

Tri-שכבתית Electrospinning לחקות ארכיטקטורה העורקים באמצעות שפת Polycaprolactone, אלסטין, קולגן ו: מחקר ראשוני

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

עיצוב של bioreactor לחץ על מחזורי Ex Vivo מחקר של מסתמי הלב אבי העורקים

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

ייצור שבבים microfluidic ושיטה לגילוי שפעת

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

טכניקת Microfluidic לחקור deformability הסלולרי

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

A Microfluidic Model of Biomimetically Breathing Pulmonary Acinar Airways

מודל Microfluidic של Biomimetically נשימה ריאתי acinar איירווייס

Quantifying respiratory flow characteristics in the pulmonary acinar depths and how they influence inhaled aerosol transport is critical towards ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

באמצעות דפוסים דבקים כדי לבנות התקני 3D נייר Microfluidic

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic זרימה צ&#39;יימברס שימוש מחדש דם למודל המוסטאסיס ואת טסיות עירוי<em&gt; במבחנה</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

פוטו-ליתוגרפיה גובה רב שלבי משתנה עבור Valved רב שכבתי מכשירים microfluidic

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

ההערכה הראשונית של נוגדן-conjugates שונה עם פפטידים ויראלי-derived הגדלת לצבירה התאית ושיפור הגידול מיקוד

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...