Name: microfluidic model to mimic initial event of neovascularization
Uploaded: 2021-04-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Research Foundation of China Grants-in-Aid (grant n. 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 e 32071311), Programma nazionale chiave di ricerca e sviluppo della Cina (sovvenzioni n. 2016YFC1101101 e 2016YFC1102202), il progetto 111 (B13003) e la Beijing Natural Science Foundation (4194079).

1. Preparazione del wafer
NOTA: Questo protocollo è specifico per il fotoresist negativo SU-8 2075 utilizzato durante questa ricerca.
<ol><li>Pulire il wafer di silicio da 3 a 5 volte con metanolo e isopropanolo su uno spin coater come segue: prima girare per 15 s a 500 giri/min, quindi girare per 60 s a 3.000 giri/min.</li>
	<li>Trasferire il wafer di silicio su una piastra calda, che viene preriscaldata a 180 °C e cuocere il wafer per 10 minuti.</li>
	<li>Rimuovere il wafer di silicio da...

Per molto tempo, l'osservazione in tempo reale della neovascolarizzazione è stata un problema. Recentemente sono stati sviluppati diversi approcci per creare vasi perfusi che si allineano con EC e adiacenti alla matrice extracellulare per germogliare22,32,40,46,54, ma il microambiente meccanico è ancora difficile da mantenere costantemente. Rimane un argomen...

La neovascolarizzazione avviene in molti processi normali e patologici1,2,3,4,che includono due processi principali negli adulti, angiogenesi e arteriogenesi5. Oltre ai più noti fattori di crescita, come il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF)6, le stimolazioni meccaniche, in particolare lo stress da taglio indotto dal flusso sanguigno, è importante nella regolazione della neovascolarizzazione7. Come sappiamo, la magnitudine e le forme di sollecitazione di taglio variano drammaticamente e dinamicamente in diverse parti della vascolarizzazione, con conseguenti effetti importanti sulle cellulevascolari 8,9,10,11,12. Studi precedenti hanno dimostrato che lo stress da taglio può influenzare vari aspetti degli EC, tra cui i cambiamenti fenotipici cellulari, la trasduzione del segnale, l'espressione genica e lacomunicazione con le cellule murali 13,14,15,16,17,18,19,20; quindi, regolare laneovascolarizzazione 21,22,23,24.
Pertanto, per comprendere meglio la neovascolarizzazione, è importante ricostruire il processo nel microambiente cellulare naturale in vitro. Recentemente, sono stati istituiti molti modelli per creare micro-vasi e fornire un controllo preciso del microambiente25,26,27, sfruttando i progressi della microfabbricazione e della tecnologia microfluidica. In questi modelli, i micro-vasi possono essere generati da idrogel28,29, polidimetilsiloxano (PDMS) chip microfluidici30,31,32 o 3D biostampa33,34. Alcuni aspetti del microambiente, come la sollecitazione di taglio luminale22,23,35,36, il flusso transendoteliale37,38,39,40,il gradiente biochimico dei fattori angiogenici41,42,ceppo/stiramento43,44,45e co-coltivato con altri tipi di cellule32,46 sono stati mimicked e controllati. Di solito, un grande serbatoio o pompa per siringhe è stato utilizzato per fornire mezzo perfuso. Il flusso transendoteliale in questi modelli è stato creato dalla caduta di pressione tra il serbatoio e ilmicrotubo 22,23,38,40. Tuttavia, il microambiente meccanico era difficile da mantenere costantemente in questo modo. Il flusso trasendoteliale aumenterebbe e quindi supererebbe il livello fisiologico se per la perfusione fosse utilizzata un'elevata portata con elevate sollecitazioni di taglio. Studi precedenti hanno dimostrato che nel periodo iniziale di neovascolarizzazione, la velocità del flusso transendoteliale è molto bassa a causa degli EC intatti e della membrana basale, di solito sotto 0,05 μm/s8. Nel frattempo, sebbene la sollecitazione di taglio luminare nel sistema vascolare vari notevolmente, è relativamente alta con valori medi di 5-20 dyn / cm2,11,47. Per ora, la velocità del flusso transendoteliale nei lavori precedenti è stata generalmente mantenuta tra 0,5-15 μm/s22,38,39,40e la sollecitazione di taglio luminale era solitamente inferiore a 10 dyn/cm223. Rimane un argomento difficile esporre costantemente gli EC ad un elevato stress da taglio luminare e a un livello fisiologico di flusso transendoteliale contemporaneamente. 
Nel presente studio, descriviamo un modello 3D in vitro per imitare l'evento iniziale di neovascolarizzazione (MIEN). Abbiamo sviluppato un chip microfluidico e un sistema di controllo automatico, di circolazione altamente efficiente per formare micro-tubi perfusione e simulare il processo di germinazione48. Con il modello MIEN, il microambiente degli EC stimolato nel periodo iniziale di neovascolarizzazione viene in primo luogo riassunto. I CES possono essere stimolati da un elevato stress da taglio luminare, da un livello fisiologico di flusso transendoteliale e da varie distribuzioni VEGF contemporaneamente. Descriviamo in dettaglio le fasi di definizione del modello MIEN e i punti chiave a cui prestare attenzione, sperando di fornire un riferimento per altri ricercatori.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Genview</td>
			<td>GP3108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electromagnetic pinch valve</td>
			<td>Wokun Technology</td>
			<td>WK02-308-1/3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell medium (ECM)</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Every Green</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran</td>
			<td>Miragen</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphical programming environment</td>
			<td>Lab VIEW</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image editing software</td>
			<td>PhotoShop</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing program</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>91237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithography equipment</td>
			<td>Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences</td>
			<td>URE-2000/35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>82762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-peristaltic pump</td>
			<td>Lead Fluid</td>
			<td>BT101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-syringe pump</td>
			<td>Lead Fluid</td>
			<td>TYD01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma</td>
			<td>MING HENG</td>
			<td>PDC-MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent epoxy negative photoresist</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene</td>
			<td>Teflon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Program software</td>
			<td>MATLAB</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF-165</td>
			<td>StemImmune LLC</td>
			<td>HVG-VF5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.06498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Phalloidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic model to mimic initial event of neovascularization

La neovascolarizzazione viene solitamente inizializzata da una vascolarizzazione normale esistente e il microambiente biomeccanico delle cellule endoteliali (EC) nella fase iniziale varia drammaticamente dal seguente processo di neovascolarizzazione. Sebbene ci siano molti modelli per simulare diversi stadi di neovascolarizzazione, manca ancora un modello 3D in vitro che capitola il processo iniziale di neovascolarizzazione sotto le corrispondenti stimolazioni dei normali microambientati vascolari. Qui, abbiamo ricostruito un modello 3D in vitro che imita l'evento iniziale di neovascolarizzazione (MIEN). Il modello MIEN contiene un chip di germinazione microfluidico e un sistema di controllo automatico e di circolazione altamente efficiente. Si è formato un microcanale funzionale e perfusabile rivestito di endotelio e il processo di germinazione è stato simulato nel chip di germinazione microfluidico. Il microambiente inizialmente fisiologico della neovascolarizzazione è stato riassunto con il sistema di controllo microfluidico, con il quale gli EC sarebbero stati esposti contemporaneamente ad elevate sollecitazioni di taglio luminare, flusso transendoteliale fisiologico e varie distribuzioni del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF). Il modello MIEN può essere prontamente applicato allo studio del meccanismo di neovascolarizzazione e mantiene una potenziale promessa come piattaforma a basso costo per lo screening dei farmaci e le applicazioni tossicologiche.

Il modello 3D in vitro per imitare l'evento iniziale di neovascolarizzazione (MIEN) qui presentato consisteva in un chip di germinazione microfluidico e un sistema di controllo microfluidico. Il chip di germinazione microfluidico è stato ottimizzato dalle precedentipubblicazioni 22,23,37,40,51,52,<sup cla...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization at JoVE.com

Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization

Qui forniamo un chip microfluidico e un sistema microfluidico di circolazione automaticamente controllato e altamente efficiente che ricapitola il microambiente iniziale della neovascolarizzazione, consentendo alle cellule endoteliali (EC) di essere stimolate da elevate sollecitazioni di taglio luminali, livello fisiologico di flusso transendoteliale e distribuzione simultanea di vari fattori di crescita endoteliali vascolari (VEGF).

Modello microfluidico per imitare l&apos;evento iniziale di neovascolarizzazione

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the ...

Neovascolarizzazione, la generazione di nuovi vasi sanguigni è un processo altamente regolamentato sia in eventi normali che patologici. Per comprendere meglio la neovascolarizzazione, è importante ricostruire il processo in microambiente cellulare naturale in vitro. Abbiamo sviluppato un chip microfluidico e un controllo automatico.Circolazioni altamente efficienti vengono fatte per formare micro-tubi perfusione e simulare di utilizzare la proteina per ricapitolare all'evento iniziale di nuova vascolarizzazione. Il chip di germinazione microfluidico era costituito da tre canali. Un canale di coltura cellulare endoteliale e un canale liquido erano separati da un ampio canale centrale di idrogel.Il sistema di controllo microfluidico era costituito da una pompa a microsiringa e da una valvola di pizzico elettromagnetica. Un chip a trappola a bolle, un chip di germinazione microfluidico, una pompa micro-peristaltica e un serbatoio di mezzo di coltura. Con un sistema microfluidico, le cellule endoteliali potrebbero essere stimolate da un elevato stress da taglio luminare, da un livello fisiologico di flusso transendoteliale e da varie distribuzioni vascolari del fattore di crescita endoteliale contemporaneamente.Pipetta 20 microliter di 125 microgrammi per millilitro di fibronectina in un'unica porta di iniezione multimediale del canale di coltura cellulare. Tagliare una punta di pipetta per adattarsi alla porta del canale di coltura cellulare con le forbici. Inserire la punta della pipetta nell'altra porta di iniezione multimediale del canale di coltura cellulare.Quindi, pipettare l'aria dal canale di coltura cellulare per riempirla di fibronectina. Incubare i trucioli a 37 gradi Celsius per un'ora. Prima della semina cellulare, pipettare 20 microliter di mezzo cellulare endoteliale in ogni porta di iniezione del mezzo e incubare i trucioli a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Quindi, pipettare tutti i supporti in tutte le porte di iniezione dei supporti. Successivamente, pipettare cinque microliter di sospensione cellulare in un'unica porta di iniezione multimediale del canale di coltura cellulare. Quindi, le cellule endoteliali si diffondono rapidamente su tutto il canale sotto pressione idrostatica differenziale.Aggiungere circa quattro o sei microlitri di supporti ECM all'altra porta per regolare la pressione idrostatica e fermare lo spostamento della cella. Remote i trucioli all'incubatore di celle. Quindi, girare i trucioli ogni 30 minuti fino a quando le cellule endoteliali non si rovano intorno alla superficie interna del canale di coltura cellulare, due ore dopo.Utilizzare la punta della pipetta per rimuovere le celle attaccate nelle porte di iniezione con molta attenzione. Quindi, inserire quattro adattatori Luer femmina spinati nelle porte di iniezione dei supporti e riempire con supporti ECM. Rimuovere i chip nell'incubatore di celle, cambiare i supporti ECM e gli adattatori Luer ogni 12 ore.Per assemblare il sistema di controllo microfluidico, preparare due tubi in politetrafluoroetilene, due tubi corti in silicone, tre lunghi tubi in silicone, un adattatore Luer femmina spinato, un connettore di tipo Y e quindi tre connettori di tipo L. Riempire la siringa con 10 millilitri di mezzo ECM preriscaldato. Collegare un tubo di politetrafluoroetilene alla siringa da un adattatore Luer femmina spinato.Quindi, collegare l'altra estremità del tubo di politetrafluoroetilene a un connettore di tipo Y. Successivamente, collegare due lunghi tubi in silicone alle altre due estremità del connettore di tipo Y. Usiamo un tubo per connetterci al serbatoio e all'altro tubo per connetterci al chip trappola a bolle.Collegare un altro lungo tubo di silicone al serbatoio. Successivamente, utilizzare due tubi brevi in silicone per collegare tutti i fori di ingresso e uscita sullo strato superiore del chip a trappola a bolle. Collegare un tubo di politetrafluoroetilene al back-end del chip.Quindi, fissare una siringa sulla pompa a microsiringa. Agganciare due lunghi tubi in silicone alla valvola elettromagnetica di avvicinamento delle dita. Quindi, cambiare la valvola di avvicinamento elettromagnetica per aprire la tubazione tra la siringa e il serbatoio.Iniettare mezzi al serbatoio utilizzando la pompa microsiringa per esaurire l'aria nel tubo. Quindi, cambiare di nuovo la valvola per aprire la tubazione tra la siringa e il chip trappola per bolle. Iniettare i supporti per riempire la camera liquida e il tubo di back-end del chip bubble trap.Estraere i trucioli endoteliali dall'incubatrice cellulare, quindi rimuovere gli adattatori Luer sul lato della coltura cellulare. Inserire due tappi di tubo nelle porte di iniezione dell'idrogel del chip di germinazione microfluidico. Collegare il tubo back-end del chip bubble trap a una porta del canale di coltura cellulare.Inserire un connettore di tipo T all'altra porta e collegarlo a un lungo tubo di silicio collegato al serbatoio. Agganciare il lungo tubo di silicone alla pompa micro peristaltica. Quindi, inserire un filtro dell'aria nel serbatoio.Quindi, assemblare il chip di germinazione microfluidico nell'incubatore superiore del palco. Quindi, collegare la pompa del vuoto ai fori nello strato inferiore del chip a bolle da un tubo TPU. Impostare il volume di circolazione opposto e una portata nel programma personalizzato che controlla contemporaneamente la pompa a microsiringa e la valvola di avvicinamento delle dita elettromagnetica.Impostare quindi la portata della pompa micro peristaltica. Accendere la pompa a microsiringa. Quindi, viene stabilito il sistema di controllo della circolazione.Testiamo la funzione barriera di alcuni micro-vasi nel nostro modello misurando il coefficiente di permeabilità diffusionale di 40 kDa F-I-T-C destrina. Come mostrato nella figura, il coefficiente di permeabilità diffusione del chip di coltura statica con rivestimento cellulare è 0,1 più o meno 0,3 micrometri al secondo. E il coefficiente di permeabilità alla diffusione del canale vuoto senza rivestimento cellulare è di 5,4 più o meno 0,7 micrometri al secondo.Il saggio di germinazione endoteliale ha mostrato che le cellule endoteliali germogliate nell'idrogel centrale in gran parte dopo 24 ore di lavorazione statica, mentre il grado di germogliatura è diminuito significativamente con l'aumento della sollecitazione di taglio luminare. Quantitativamente, la sollecitazione di taglio luminare ha diminuito significativamente la germinazione endoteliale in termini di area di germogliatura, lunghezza media di germogliatura e lunghezza del germoglio più lunga. Con il nostro sistema, lo stress da taglio sulle cellule endoteliali potrebbe essere facoltativamente cambiato in qualsiasi momento durante l'esperimento mentre il flusso transendoteliale è rimasto a livello fisiologico.Questo modello biomimetico 3D in vitro può essere applicato direttamente allo studio del meccanismo di neovascolarizzazione e mantiene la potenziale promessa come piattaforma a basso costo per lo screening farmacologico e le applicazioni tossicologiche.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

Tri-strato Electrospinning di Mimic nativa Architettura arteriosa utilizzando Policaprolactone, elastina e collagene: uno studio preliminare

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

Ricerca

Bioingegneria

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Progettazione di un bioreattore per la pressione ciclica Ex Vivo Studio delle valvole cardiache aortica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Chip Fabrication Microfluidic e metodo per rilevare l&#39;influenza

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Una tecnica Microfluidic per sondare deformabilità cellulare

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

A Microfluidic Model of Biomimetically Breathing Pulmonary Acinar Airways

Un modello di Microfluidic Biomimetically respirazione polmonare acinose Airways

Quantifying respiratory flow characteristics in the pulmonary acinar depths and how they influence inhaled aerosol transport is critical towards ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

Utilizzando adesivo Patterning per costruire dispositivi microfluidici di carta 3D

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flusso Camere con sangue ricostituito al modello Emostasi e piastrine Transfusion<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Multi-step altezza variabile fotolitografia per Valvolati multistrato microfluidici Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Valutazione iniziale di anticorpo-coniugati modificate con peptidi virali-derivati per accumulo cellulare di aumentare e migliorare il Targeting tumorale

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...