Name: microfluidic model to mimic initial event of neovascularization
Uploaded: 2021-04-10T13:00:00
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この研究は、中国補助金援助の国立自然科学研究財団(助成金11827803、31971244、31570947、31570947、援助の国立自然科学研究財団によって支援されました。 11772036、61533016、U20A20390および32071311)、中国の国家主要研究開発プログラム(助成金2016YFC11011101および2016YFC1102202)、111プロジェクト(B13003)、自然科学4104(北京4104年)

1. ウエハ準備
注:このプロトコルは、この研究で使用されるSU-8 2075陰性フォトレジストに固有のものです。
<ol><li>スピンコーターにメタノールとイソプロパノールを使用してシリコンウエハを3~5回洗浄します:最初に500rpmで15 sスピンし、3,000rpmで60s回転します。</li>
	<li>シリコンウェーハをホットプレートに移し、180°Cに予熱し、ウエハを10分間焼きます。</li>
	<li>ホット?...

長い間、新生血管のリアルタイム観察が問題となっていた。最近では、22,32,40,46,54を発芽させるために、ICと並ぶ透過血管を作り出すアプローチが開発されていますが、機械的微小環境は常に維持するのが難しいです。高い光のせん断応力と経皮流の低速度を受けるICの?...

新血管新生は、成人における2つの主要なプロセス、血管新生および動脈新生5を含む多くの正常および病理学的プロセス1、2、3、4で起こる。血管内皮成長因子(VEGF)6のような最もよく知られた成長因子のほかに、機械的刺激、特に血流誘発せん断ストレスは、新血管新生7の調節において重要である。我々が知っているように、せん断応力の大きさと形態は脈管構造の異なる部分で劇的かつ動的に変化し、血管細胞8、9、10、11、12に重要な影響を及ぼす。これまでの研究では、せん断応力が、細胞表現型の変化、シグナル伝達、遺伝子発現、および壁画細胞13、14、15、16、17、18、19、20を含むECsの様々な側面に影響を及ぼす可能性があることを示している。したがって、新血管新血管化21、22、23、24を調節する。
したがって、新血管新生をよりよく理解するためには、自然細胞微小環境でのプロセスをvitroで再構築することが重要である。近年、マイクロ血管を作り、微細構造とマイクロ流体技術の進歩を生かして、マイクロ環境25、26、27を精密に制御するモデルが確立されています。これらのモデルでは、マイクロ血管は、ヒドロゲル28、29、ポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロ流体チップ30、31、32または3Dバイオプリンティング33、34によって生成することができる。光性せん断応力22、23、35、36、経内皮流量37、38、39、40、血管新生因子41、42、株/ストレッチ43、44、45、および他のタイプの細胞との共培養など、微小環境のいくつかの側面が模倣および制御されている。通常、大きな貯留層またはシリンジポンプを用い、浸透媒体を提供した。これらのモデルの経皮流は、リザーバーとマイクロチューブ22、23、38、40の間の圧力降下によって作成された。しかし、機械的な微小環境は、このように絶えず維持するのが難しかった。高い剪断応力を伴う高い流量を灌流に使用すると、経年皮流の流れが増加し、その後生理学的レベルを超える。以前の研究では、新血管新生の初期の時期に、経内皮流の速度は、通常0.05 μm/s 8の下で、無傷のECと基部膜のために非常に低いことが示されました。一方、血管系における発光せん断応力は大きく異なりますが、5-20 dyn/cm2、11、47の平均値で比較的高い。今のところ、以前の作品における経皮流の速度は、一般的に0.5-15 μm/s22、38、39、40の間に保たれているが、発光せん断応力は通常10 dyn/cm223の下にあった。高い発光せん断応力と経経皮流の生理学的レベルに同時にICを常に曝露することは困難な対象です。 
本研究では、新血管新生(MIEN)の初期事象を模倣する in vitro 3Dモデルについて説明する。マイクロ流体チップと自動制御、高効率循環システムを開発し、灌流マイクロチューブを形成し、発芽プロセスをシミュレートしました。MIENモデルでは、新血管新生の初期に刺激されたICの微小環境が最初に再現される。高い発光せん断応力、経経皮流の生理学的レベル、および様々なVEGF分布によって同時に、ICを刺激することができます。MIENモデルを確立するステップと注意点を説明し、他の研究者への参考文献を提供することを期待しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Genview</td>
			<td>GP3108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electromagnetic pinch valve</td>
			<td>Wokun Technology</td>
			<td>WK02-308-1/3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell medium (ECM)</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Every Green</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran</td>
			<td>Miragen</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphical programming environment</td>
			<td>Lab VIEW</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image editing software</td>
			<td>PhotoShop</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing program</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>91237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithography equipment</td>
			<td>Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences</td>
			<td>URE-2000/35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>82762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-peristaltic pump</td>
			<td>Lead Fluid</td>
			<td>BT101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-syringe pump</td>
			<td>Lead Fluid</td>
			<td>TYD01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma</td>
			<td>MING HENG</td>
			<td>PDC-MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent epoxy negative photoresist</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene</td>
			<td>Teflon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Program software</td>
			<td>MATLAB</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF-165</td>
			<td>StemImmune LLC</td>
			<td>HVG-VF5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.06498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Phalloidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic model to mimic initial event of neovascularization

新血管新生は、通常、既存の正常血管系から初期化され、初期段階における内皮細胞(ECs)の生体力学的微小環境は、次の新血管化の過程から劇的に変化する。新血管新生の異なる段階をシミュレートするモデルはたくさんありますが、正常な血管系微小環境の対応する刺激の下で新血管新生の初期プロセスをキャピテーションする in vitro 3Dモデルはまだ欠けています。ここでは、新血管新生(MIEN)の初期事象を模倣した インビトロ 3Dモデルを再構築しました。MIENモデルはマイクロ流体発芽の破片および自動制御、非常に能率的な循環システムを含んでいる。内皮でコーティングされた機能的で透過性のマイクロチャネルが形成され、マイクロ流体発芽チップで発芽のプロセスをシミュレートした。新血管形成の初期の生理学的微小環境は、マイクロ流体制御システムで再現され、それによって、ECは高い発光せん断応力、生理学的経皮流、および様々な血管内皮成長因子(VEGF)分布に同時に曝露されるであろう。MIENモデルは新血管新生メカニズムの研究に容易に適用することができ、薬物スクリーニングおよび毒物学の適用のための低コストのプラットホームとして潜在的な約束を保持する。

ここで提示した新血管新生(MIEN)の初期事象を模倣するin vitro 3Dモデルは、マイクロ流体発芽チップとマイクロ流体制御システムで構成されていました。マイクロ流体発芽チップは、以前の出版物22、23、37、40、51、52、53から最適化されました。<sup class="xref"...

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Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization

ここでは、マイクロ流体チップと、新生血管形成の初期微小環境を再現する、自動制御された高効率循環マイクロ流体システムを提供し、高い発光せん断応力、経経皮流の生理学的レベル、および様々な血管内皮成長因子(VEGF)分布によって内皮細胞(ECs)を同時に刺激することを可能にする。

新血管新生初期事象を模倣する微発性モデル

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the ...

新血管新血管の発生は、正常および病理学的事象の両方において高度に調節されたプロセスである。新血管新生をよりよく理解するためには、自然細胞微小環境の中でプロセスを再構築することが重要です。マイクロ流体チップと自動制御を開発しました。非常に効率的な循環は、灌流マイクロチューブを形成し、新しい血管化の最初のイベントに再現するためにタンパク質を使用するようにシミュレートするために行われます。マイクロ流体発芽チップは3つのチャネルで構成されていました。内皮細胞培養チャネルと液体チャネルを広い中央ヒドロゲルチャネルで分離した。マイクロ流体制御システムは、マイクロシリンジポンプと電磁ピンチバルブで構成されていました。バブルトラップチップ、マイクロ流体発芽チップ、マイクロ蠕動ポンプ、および培地貯留部。マイクロ流体システムでは、内皮細胞は高い発光せん断応力、経経皮流の生理学的レベル、および様々な血管内皮成長因子分布によって同時に刺激され得る。ピペット20マイクロリットルのフィブロネクチン1ミリリットル当たり125マイクログラムを細胞培養チャネルの1つの培地注入口に入る。細胞培養チャネルのポートにハサミを合わせるようにピペットチップを切ります。ピペットチップを細胞培養チャネルの他の培地注入口に挿入します。次いで、細胞培養チャネルから空気を出してピペットをフィブロネクチンで満たす。チップを摂氏37度で1時間インキュベートします。細胞播種前に、各培地注入口に20マイクロリットルの内皮細胞培地をピペットし、30分間摂氏37度でチップをインキュベートする。次に、すべてのメディアインジェクションポート内のすべてのメディアをピペットアウトします。次に、5マイクロリットルの細胞懸濁液を、細胞培養チャネルの1つの培地注入口にピペットする。その後、内皮細胞は、差動静圧下でチャネル全体に急速に広がった。他のポートに約4〜6マイクロリットルのECM培地を加え、静水圧を調整し、セルの移動を停止します。チップを細胞インキュベーターにリモートします。その後、2時間後に内皮細胞が細胞培養チャネルの内部表面の周りにコートするまで、30分ごとにチップをひっくり返す。ピペットチップを使用して、注入ポートに取り付けられたセルを非常に慎重に取り除きます。次に、4 つの有刺鉄線の女性 Luer アダプターをメディアインジェクション ポートに挿入し、ECM メディアで埋めます。チップをセルインキュベーターに取り出し、ECMメディアとLuerアダプタを12時間ごとに交換します。マイクロ流体制御システムを組み立てるには、2つのポリテトラフルオロエチレンチューブ、2つの短いシリコンチューブ、3つの長いシリコンチューブ、1つの有刺鉄線の女性ルアーアダプター、1つのYタイプコネクタ、そして3つのLタイプコネクタを準備します。シリンジに予熱ECM培地10ミリリットルを充填します。ポリテトラフルオロエチレンチューブを有刺鉄ブされた女性ルアーアダプターで注射器に接続します。次に、ポリテトラフルオロエチレンチューブの他端をY型コネクタに接続します。次に、2本の長いシリコンチューブをY型コネクタの他の両端に接続します。1本のチューブを使用してリザーバに接続し、もう1つのチューブを使用してバブルトラップチップに接続します。別の長いシリコンチューブをリザーバに接続します。次に、バブルトラップチップの最上層上の全ての入口と出口穴を接続するために2つの短いシリコンチューブを使用します。ポリテトラフルオロエチレンチューブをチップのバックエンドに接続します。次に、注射器をマイクロシリンジポンプに固定します。2本の長いシリコンチューブを電磁ピンチバルブにクリップします。次に、電磁ピンチバルブを切り替えて、シリンジとリザーバの間のパイプラインを開きます。マイクロシリンジポンプを使用して、チューブ内の空気を排気するために、リザーバに媒体を注入します。次に、再度バルブを切り替えて、シリンジとバブルトラップチップの間でパイプラインを開きます。液体チャンバーとバブルトラップチップのバックエンドチューブを充填するためにメディアを注入します。細胞インキュベーターから内皮発芽チップを取り出し、次に細胞培養側のルアーアダプターを取り除きます。マイクロ流体発芽チップのハイドロゲル注入口に2つのパイププラグを挿入します。バブルトラップチップのバックエンドチューブを細胞培養チャネルの1つのポートに接続します。T型コネクタを他のポートに挿入し、リザーバに接続された長いシリコンチューブに接続します。長いシリコンチューブをマイクロペリスタチックポンプにクリップします。次に、エアフィルターを貯留槽に挿入します。次に、マイクロ流体発芽チップをステージ上のインキュベーターに組み立てます。次に、TPUチューブでバブルトラップチップの底層の穴に真空ポンプを接続します。マイクロシリンジポンプと電磁ピンチバルブを同時に制御するカスタムプログラムで、反対の循環量と流量を設定します。次に、マイクロ蠕動ポンプの流量を設定する。マイクロシリンジポンプをオンにします。そして、循環制御システムが確立される。40kDa F-I-T-Cデキストリンの拡散透過係数を測定することで、モデル内の一部のマイクロ血管のバリア機能をテストします。図に示すように、細胞内層を有するスタティック培養チップの拡散透過係数は、毎秒0.1プラスマイナス0.3マイクロメートルである。そして、細胞内層のない空流路の拡散透過係数は、毎秒5.4プラスマイナス0.7マイクロメートルである。内皮発芽アッセイは、内皮細胞が主に24時間の静的培養後に中央ヒドロゲルに芽を出し、発芽度は、発光せん断応力の増加に伴って有意に減少することを示した。また、発芽の面積、平均芽芽長、最長の芽長の点から、内皮芽の発芽が有意に減少した。我々のシステムでは、内皮細胞のせん断応力は、経内皮流が生理学的レベルにとどまっている間、実験中にいつでも任意に変化することができる。このin vitro 3Dバイオミメティックモデルは、ネオア眼ラライゼーション機構の研究に直接適用することができ、薬物スクリーニングおよび毒物学アプリケーションのための低コストプラットフォームとしての潜在的な約束を保持しています。

Research

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