Name: microfluidic model to mimic initial event of neovascularization
Uploaded: 2021-04-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization at JoVE.com

이 작품은 중국 보조금 지원의 국립 자연 과학 연구 재단에 의해 지원되었다 (보조금 Nos. 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 및 32071311), 중국의 국가 주요 연구 개발 프로그램 (2016YFC101110101 및 2016YFC102202), 111 프로젝트 (B130039), 111 프로젝트 (B130039), 111 프로젝트 (B130039)

1. 웨이퍼 준비
참고: 이 프로토콜은 이 연구 중에 사용되는 SU-8 2075 네거티브 포토레지스트에 특이적입니다.
<ol><li>다음과 같이 스핀 코터에 메탄올과 이소프로파놀로 실리콘 웨이퍼를 3~5회 청소합니다: 첫 번째 스핀은 500rpm에서 15s, 그리고 3,000rpm에서 60s로 회전합니다.</li>
	<li>실리콘 웨이퍼를 180°C로 예열된 핫플레이트로 옮기고 웨이퍼를 10분 동안 굽습니다.</li>
	<li>핫플?...

오랜 시간 동안, 신생아의 실시간 관찰은 문제가되었습니다. 최근22, 32,40,46,54의발아을 위해 EC와 인접한 중전성 선박을 만들기 위해 여러 가지 접근법이 개발되었지만 기계적 미세 환경은 여전히 지속적으로 유지되기 어렵다. 높은 발광 전단 응력과 경도 유동의 낮은 속도를...

신생 혈관 화는성인,혈관 신생 및 동맥 발생5에서두 가지 주요 과정을 포함하는 많은 정상 및 병리학 적 과정1,2,3,4에서발생합니다. 혈관 내피 성장 인자(VEGF)6,기계적 자극, 특히 혈류 유도 전단 응력과 같은 가장 잘 알려진 성장 인자 외에, 신생혈관화7의 조절에 중요하다. 우리가 알다시피, 전단 응력의 크기와 형태는 혈관 세포의 다른 부분에서 극적으로 그리고 동적으로 변화하여 혈관 세포8,9,10,11,12에중요한 영향을 미칩니다. 이전 연구는 전단 스트레스가 세포 표현성 변화, 신호 변환, 유전자 발현 및 벽화 세포와의통신(13,14,16, 17,17,18,19,20)을포함한 EC의 다양한 측면에 영향을 미칠 수 있음을 보여주었다. 따라서, 신생 혈관화를 조절21,22,23,24.
따라서, 신생 혈관화를 더 잘 이해하기 위해, 시험관 내의자연 세포 미세 환경에서 공정을 재구성하는 것이 중요하다. 최근에는 마이크로선박을 만들고 미세한 조형 및 미세유체 기술의 발전을 활용하여마이크로환경 25,26,27을정밀하게 제어하기 위해 많은 모델이 설립되었습니다. 이들 모델에서, 마이크로용기는하이드로겔(28,29),폴리디메틸실록산(PDMS) 미세유체칩30,31, 32또는3D 바이오프린팅33,34에의해 생성될 수 있다. 발광 전단 응력(22,23,35,36,경전 유동37,38,39,40,혈관신생 인자41,42,균주/스트레치43,44, 45)및 다른 유형의세포32,46k와공동 배양등의 미세 환경의 일부 측면이 대조되었다. 일반적으로 대형 저수지 또는 주사기 펌프를 사용하여 퍼퓨즈 배지를 제공하였다. 이들 모델의 환원유량은 저수지와마이크로튜브(22,23,38,40)사이의 압력 강하에 의해 만들어졌다. 그러나 기계적 미세 환경은 이러한 방식으로 지속적으로 유지하기 어려웠습니다. 전단 응력이 높은 높은 유속이 관류에 사용되는 경우 Transendothelial 흐름이 증가하고 생리 수준을 초과할 것입니다. 이전 연구는 신생아 혈관화의 초기 기간에, 경피성 흐름의 속도는 일반적으로 0.05 μm/ s8이하의 그대로 있는 IC 및 지하 막 때문에 아주 낮다는 것을 보여주었습니다. 한편, 혈관 계통의 발광 전단 응력은 크게 다르지만 평균 값인 5-20 dyn/cm2,11,47로비교적 높다. 현재, 전작의 경피흐름의 속도는 일반적으로 0.5-15 μm/s22,38,39,40사이로 유지되었으며, 발광 전단 응력은 보통 10dyn/cm222미만이었다. 높은 발광 전단 스트레스와 생리학적 수준의 경내 흐름을 동시에 지속적으로 노출시키기가 어려운 대상으로 남아 있습니다. 
본 연구에서는, 우리는 신생 혈관화 (MIEN)의 초기 사건을 모방하는 시험관 내 3D 모델을 설명합니다. 우리는 관류 마이크로 튜브를 형성하고48발아과정을 시뮬레이션하기 위해 미세 유체 칩과 자동 제어, 고효율 순환 시스템을 개발했습니다. MIEN 모델을 사용하면 신생 혈관화의 초기 기간에 자극된 EC의 미세 환경이 먼저 다시 회수됩니다. EC는 높은 발광 전단 스트레스, 생리학적 수준의 경위 흐름 및 다양한 VEGF 분포에 의해 동시에 자극될 수 있다. 우리는 MIEN 모델을 구체적으로 설정하는 단계와 다른 연구자에게 참조를 제공하기를 희망하여 주의를 기울여야 할 핵심 사항을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Genview</td>
			<td>GP3108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electromagnetic pinch valve</td>
			<td>Wokun Technology</td>
			<td>WK02-308-1/3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell medium (ECM)</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Every Green</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran</td>
			<td>Miragen</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphical programming environment</td>
			<td>Lab VIEW</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image editing software</td>
			<td>PhotoShop</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing program</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>91237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithography equipment</td>
			<td>Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences</td>
			<td>URE-2000/35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>82762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-peristaltic pump</td>
			<td>Lead Fluid</td>
			<td>BT101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-syringe pump</td>
			<td>Lead Fluid</td>
			<td>TYD01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma</td>
			<td>MING HENG</td>
			<td>PDC-MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent epoxy negative photoresist</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene</td>
			<td>Teflon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Program software</td>
			<td>MATLAB</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF-165</td>
			<td>StemImmune LLC</td>
			<td>HVG-VF5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.06498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Phalloidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic model to mimic initial event of neovascularization

신생 혈관화는 일반적으로 초기 단계에서 내피 세포 (EC)의 기존 정상 혈관 및 생체 역학 미세 환경에서 초기화되어 신생아 혈관화의 다음 과정으로부터 크게 다릅니다. 신생 혈관화의 다른 단계를 시뮬레이션하는 모델이 많이 있지만, 정상적인 혈관 미세 환경의 해당 자극하에서 신생 혈관화의 초기 과정을 항복하는 시험관 내 3D 모델은 여전히 부족합니다. 여기서 는 신생 혈관화(MIEN)의 초기 이벤트를 모방한 체외 3D 모델을 재구성했습니다. MIEN 모델에는 미세 유체 발아 칩과 자동 제어, 고효율 순환 시스템이 포함되어 있습니다. 내피로 코팅된 기능적이고 난설성이 있는 마이크로채널이 형성되었고, 발아 공정은 미세유체 발아 칩에서 시뮬레이션되었다. 초기 생리학적 미세환경은 미세유체 조절 시스템으로 회수되었으며, 이 시스템은 높은 발광 전단 스트레스, 생리학적 경전혈, 다양한 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 분포에 동시에 노출될 것이다. MIEN 모델은 신생아 혈관화 메커니즘의 연구에 쉽게 적용 될 수 있으며 약물 선별 및 독성 응용 프로그램을위한 저렴한 플랫폼으로 잠재적 인 약속을 보유합니다.

여기에 제시된 신생혈관화(MIEN)의 초기 이벤트를 모방하는 시험관 내 3D 모델은 미세유체 발아 칩과 미세유체 제어 시스템으로 구성되었다. 미세유체 발아 칩은 이전 간행물22,23,37,40,51,52, 53에서최적화되었다. 간략?...

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Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization

여기서, 우리는 미세 유체 칩과 자동으로 제어되는 고효율 순환 미세 유체 시스템을 제공하여 신생 혈관화의 초기 미세 환경을 재구성하여 내피 세포 (EC)가 높은 발광 전단 응력, 생리학적 수준의 경내 연골 흐름 및 다양한 혈관 내막 성장 인자 (VEGF)에 의해 자극 될 수 있도록 합니다.

뇌혈관화의 초기 이벤트를 모방하는 미세 유체 모델

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the ...

신생 혈관, 새로운 혈관의 생성은 정상 및 병리학 적 사건 모두에서 매우 규제 되는 과정입니다. 신생 혈관화를 더 잘 이해하려면 체외에서 자연 세포 미세 환경에서 프로세스를 재구성하는 것이 중요합니다. 우리는 미세 유체 칩과 자동 제어를 개발했습니다.고효율 순환은 관류 마이크로 튜브를 형성하고 새로운 혈관화의 초기 이벤트에 재현하기 위해 단백질을 사용하는 시뮬레이션하기 위해 수행됩니다. 미세 유체 발아 칩은 세 개의 채널로 구성되었다. 내피 세포 배양 채널과 액체 채널은 넓은 중앙 하이드로겔 채널에 의해 분리되었다.미세 유체 제어 시스템은 미세 사기 펌프 및 전자기 핀치 밸브로 구성되었다. 버블 트랩 칩, 미세 유체 발아 칩, 마이크로 연동 펌프 및 배양 매체 저수지. 미세 유체 시스템으로, 내피 세포는 높은 발광 전단 스트레스, 생리학적 수준의 경내 피류 및 다양한 혈관 내피 성장 인자 분포에 의해 동시에 자극될 수 있다.파이펫 20 마이크로리터 의 125 섬유넥틴의 밀리리터 당 마이크로 그램 세포 배양 채널의 하나의 미디어 주입 포트로. 파이펫 팁을 잘라 세포 배양 채널의 포트에 가위를 넣습니다. 파이펫 팁을 세포 배양 채널의 다른 배지 주입 포트에 삽입합니다.그런 다음, 세포 배양 채널에서 공기를 피펫하여 섬유네틴으로 채웁니다. 칩을 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 세포 파종 전에, 각 배지 주입 포트에 내피 세포 배지의 파이펫 20 마이크로 리터와 30 분 동안 섭씨 37도에서 칩을 배양.그런 다음 모든 미디어 주입 포트의 모든 미디어를 피펫합니다. 다음으로, 세포 배양 채널의 하나의 배지 주입 포트로 세포 현탁액의 파이펫 5 마이크로리터. 그런 다음 내피 세포는 차동 유수압하에서 전체 채널에 빠르게 확산됩니다.다른 포트에 ECM 매체의 약 4~6마이크로리터를 추가하여 정압 압력을 조정하고 세포 이동을 중지합니다. 칩을 인큐베이터셀로 리모컨합니다. 그런 다음 내피 세포가 세포 배양 채널의 내부 표면 주위에 코팅 될 때까지 30 분마다 칩을 뒤집습니다.파이펫 팁을 사용하여 사출 포트에 부착된 셀을 매우 신중하게 제거합니다. 그런 다음 4개의 가시 암컷 Luer 어댑터를 미디어 사출 포트에 삽입하고 ECM 매체로 채웁니다. 칩을 분리하여 인큐베이터에 적용하고, 12시간마다 ECM 미디어와 루어 어댑터를 변경합니다.미세 유체 제어 시스템을 조립하려면 폴리테트라플루오로틸렌 튜브 2개, 짧은 실리콘 튜브 2개, 긴 실리콘 튜브 3개, 가시 암컷 루어 어댑터 1개, Y형 커넥터 1개, L형 커넥터 3개를 준비합니다. 주사기를 예열된 ECM 배지10밀리리터로 채웁니다. 철제 여성 루어 어댑터로 폴리테트라플루오로틸렌 튜브를 주사기에 연결합니다.그런 다음 폴리테트라플루오로틸렌 튜브의 다른 끝을 Y 형 커넥터에 연결합니다. 다음으로, 두 개의 긴 실리콘 튜브를 Y 형 커넥터의 다른 두 단에 연결합니다. 우리는 하나의 튜브를 사용하여 저수지와 다른 튜브에 연결하여 버블 트랩 칩에 연결합니다.또 다른 긴 실리콘 튜브를 저수지에 연결합니다. 다음으로 두 개의 짧은 실리콘 튜브를 사용하여 버블 트랩 칩의 상단 레이어에 있는 모든 입구와 콘센트 구멍을 연결합니다. 폴리테트라플루오로틸렌 튜브를 칩의 백엔드에 연결합니다.다음으로 주사기를 마이크로시링펌프에 고정합니다. 전자기 핀치 밸브에 두 개의 긴 실리콘 튜브를 클립. 다음으로 전자기 핀치 밸브를 전환하여 주사기와 저수지 사이의 파이프라인을 엽니다.마이크로시링펌프를 사용하여 저장소에 미디어를 주입하여 튜브의 공기를 배출합니다. 그런 다음 밸브를 다시 전환하여 주사기와 버블 트랩 칩 사이의 파이프라인을 엽니다. 거품 트랩 칩의 액체 챔버와 백 엔드 튜브를 채우기 위해 미디어를 주입합니다.세포 인큐베이터에서 내피 발아 칩을 꺼내서 세포 배양 측의 Luer 어댑터를 제거하십시오. 미세 유체 발아 칩의 하이드로겔 사출 포트에 두 개의 파이프 플러그를 삽입합니다. 버블 트랩 칩의 백 엔드 튜브를 세포 배양 채널의 한 포트에 연결합니다.T 형 커넥터를 다른 포트에 삽입하고 저장소와 연결된 긴 실리콘 튜브에 연결합니다. 긴 실리콘 튜브를 마이크로 연동 펌프에 잘라냅니다. 그런 다음 공기 필터를 저수지에 삽입합니다.다음으로, 미세 유체 발아 칩을 스테이지 탑 인큐베이터에 조립합니다. 다음으로, 진공 펌프를 TPU 튜브로 버블 트랩 칩의 하단 층의 구멍에 연결합니다. 미세 주 펌프와 전자기 핀치 밸브를 동시에 제어하는 사용자 정의 프로그램에서 반대 순환 볼륨과 유량을 설정합니다.다음으로, 마이크로 연동 펌프의 유량을 설정합니다. 마이크로 시링주 펌프를 켭니다. 이어서 순환 제어 시스템이 구축된다.우리는 40 kDa F-I-T-C 덱스트린의 확산 투과성 계수를 측정하여 모델에서 일부 마이크로 선박의 장벽 기능을 테스트합니다. 그림에 나타난 바와 같이, 세포 안대기를 가진 정적 배양 칩의 확산 투과성 계수는 초당 0.1 플러스 또는 마이너스 0.3 마이크로미터이다. 그리고 세포 안대기없이 빈 채널의 확산 투과성 계수는 초당 5.4 플러스 또는 마이너스 0.7 마이크로미터이다.내피 발아 분석은 내피 세포가 24 시간 의 정적 배양 후 중앙 하이드로겔로 크게 발아되는 반면 발광 정도는 발광 전단 응력의 증가와 함께 현저히 감소하는 것으로 나타났다. 정량적으로, 발광 전단 응력은 발아 의 영역에서 크게 내피 발아를 감소, 평균 발아 길이, 그리고 가장 긴 새싹 길이. 우리의 시스템으로, 내피 세포에 전단 응력은 생리적 수준에 머무르는 동안 실험 도중 언제든지 선택적으로 변경될 수 있었습니다.이 시험관 내 3D 생체 모방 모델은 neovasularization 메커니즘의 연구에 직접 적용 될 수 있으며 약물 선별 및 독성 응용 프로그램을위한 저렴한 비용 플랫폼으로서의 잠재적 인 약속을 보유합니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

Polycaprolactone, 엘라스틴, 콜라겐을 사용하여 네이티브 아티 건축을 모방하기 위해 트라이 - 계층 Electrospinning : 예비 연구

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

연구

생체공학

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

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Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

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Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

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Quantifying respiratory flow characteristics in the pulmonary acinar depths and how they influence inhaled aerosol transport is critical towards ...

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미세 유체 흐름 챔버 지혈 및 혈소판 수혈을 모델링하기 위해 재구성 된 혈액을 사용하여<em&gt; 체외</em

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세포 축적을 증가 하 고 종양을 대상으로 개선에 대 한 바이러스 성 파생 된 펩 티 드 항 체 어원이 같은 말의 초기 평가 수정

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...