Name: microfluidic model to mimic initial event of neovascularization
Uploaded: 2021-04-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Research Foundation of China Grants-in-Aid (stipend nr. 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 og 32071311), Kinas nasjonale viktige forsknings- og utviklingsprogram (stipendnr. 2016YFC1101101 og 2016YFC1102202), 111 Project (B13003) og Beijing Natural Science Foundation (4194079).

1. Wafer forberedelse
MERK: Denne protokollen er spesifikk for su-8 2075 negativ fotoresist som brukes under denne forskningen.
<ol><li>Rengjør silisiumwaferen 3 til 5 ganger med metanol og isopropanol på et spin-strøk som følger: første spinn for 15 s ved 500 o/min, og spinn deretter for 60 s ved 3000 o/min.</li>
	<li>Overfør silisiumwaferen til en kokeplate, som er forvarmet til 180 °C og stek waferen i 10 min.</li>
	<li>Fjern silisiumwaferen fra kokeplaten og avkjøl den til romtem...

I lang tid har sanntidsobservasjon av neovaskularisering vært et problem. Flere tilnærminger har blitt utviklet nylig for å skape perfused fartøy fôr med ECer og ved siden av ekstracellulær matrise for spirende22,32,40,46,54, men den mekaniske mikromiljøet er fortsatt vanskelig å opprettholde hele tiden. Det er fortsatt vanskelig å etterligne det før...

Neovaskularisering skjer i mange normale og patologiske prosesser1,2,3,4,som inkluderer to store prosesser hos voksne, angiogenese og arteriogenese5. Foruten de mest kjente vekstfaktorer, som vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF)6, mekaniske stimuleringer, spesielt blodstrømmen indusert skjær stress, er viktig i regulering av neovaskularisering7. Som vi vet, varierer størrelsen og formene for skjærstress dramatisk og dynamisk i forskjellige deler av vaskulaturen, noe som resulterer i viktige effekter på vaskulæreceller 8,9,10,11,12. Tidligere studier har vist at skjærstress kan påvirke ulike aspekter av EC, inkludert cellefenotypiske endringer, signaltransduksjon, genuttrykk og kommunikasjon med veggmalericeller13,14,15,16,17,18,19,20; dermed regulere neovaskularisering21,22,23,24.
Derfor, for å bedre forstå neovaskularisering, er det viktig å rekonstruere prosessen i naturlig cellulær mikromiljøin vitro. Nylig har mange modeller blitt etablert for å skape mikro-fartøy og gi presis kontroll over mikromiljø25,26,27, dra nytte av fremskritt i mikrofabrikasjon og mikrofluidisk teknologi. I disse modellene kan mikrobeholdere genereres av hydrogel28,29, polydimetylsiloxane (PDMS) mikrofluidiske chips30,31,32 eller 3D bioprinting33,34. Noen aspekter ved mikromiljøet, som luminal skjær stress22,23,35,36, transendothelial flyt37,38,39,40, biokjemisk gradient av angiogenefaktorer 41,42, belastning /strekk 43,44,45, og co-kultivert med andre typer celler32,46 har blitt etterlignet og kontrollert. Vanligvis ble et stort reservoar eller sprøytepumpe brukt til å gi perfundert medium. Transendothelial strømning i disse modellene ble opprettet av trykkfall mellom reservoaret og mikro-rør22,23,38,40. Imidlertid var det mekaniske mikromiljøet vanskelig å opprettholde hele tiden på denne måten. Transendothelial flyt ville øke og deretter overstige fysiologisk nivå hvis en høy strømningshastighet med høy skjær stress ble brukt for perfusjon. Forrige studie viste at i den første perioden av neovaskularisering er hastigheten på transendothelial strømning svært lav på grunn av intakte ECer og kjellermembran, vanligvis under 0,05 μm / s8. I mellomtiden, selv om luminal skjær stress i vaskulært system varierer sterkt, er det relativt høy med gjennomsnittlige verdier på 5-20 dyn / cm2,11,47. For nå har hastigheten på transendothelial flyt i tidligere arbeider generelt blitt holdt mellom 0,5-15 μm / s22,38,39,40, og luminal skjær stress var vanligvis under 10 dyn / cm223. Det er fortsatt vanskelig å stadig utsette ECer for høy luminal skjær stress og fysiologisk nivå av transendothelial flyt samtidig. 
I den nåværende studien beskriver vi en in vitro 3D-modell for å etterligne den første hendelsen av neovaskularisering (MIEN). Vi utviklet en mikrofluidisk chip og et automatisk kontrollsystem, svært effektivt sirkulasjonssystem for å danne perfusjonsmikrorør og simulere prosessen medspirende 48. Med MIEN-modellen blir mikromiljøet av ECer stimulert i den første perioden av neovaskularisering først rekakabilisert. ECer kan stimuleres av høy luminal skjær stress, fysiologisk nivå av transendothelial flyt og ulike VEGF distribusjon samtidig. Vi beskriver trinnene for å etablere MIEN-modellen i detalj og de viktigste punktene som skal tas hensyn til, i håp om å gi en referanse til andre forskere.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Genview</td>
			<td>GP3108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electromagnetic pinch valve</td>
			<td>Wokun Technology</td>
			<td>WK02-308-1/3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell medium (ECM)</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Every Green</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran</td>
			<td>Miragen</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphical programming environment</td>
			<td>Lab VIEW</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image editing software</td>
			<td>PhotoShop</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing program</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>91237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithography equipment</td>
			<td>Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences</td>
			<td>URE-2000/35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>82762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-peristaltic pump</td>
			<td>Lead Fluid</td>
			<td>BT101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-syringe pump</td>
			<td>Lead Fluid</td>
			<td>TYD01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma</td>
			<td>MING HENG</td>
			<td>PDC-MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent epoxy negative photoresist</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene</td>
			<td>Teflon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Program software</td>
			<td>MATLAB</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF-165</td>
			<td>StemImmune LLC</td>
			<td>HVG-VF5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.06498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Phalloidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic model to mimic initial event of neovascularization

Neovaskularisering initialiseres vanligvis fra en eksisterende normal vaskulatur, og det biomekaniske mikromiljøet av endotelceller (ECer) i første fase varierer dramatisk fra følgende prosess med neovaskularisering. Selv om det er mange modeller for å simulere ulike stadier av neovaskularisering, mangler en in vitro 3D-modell som kapitulerer den første prosessen med neovaskularisering under tilsvarende stimuleringer av normale vaskulaturmikromiljøer fortsatt. Her rekonstruerte vi en in vitro 3D-modell som etterligner den første hendelsen av neovaskularisering (MIEN). MIEN-modellen inneholder en mikrofluidisk spirende chip og et automatisk kontrollsystem, svært effektivt sirkulasjonssystem. En funksjonell, perfuserbar mikrokanal belagt med endotel ble dannet og prosessen med spirende ble simulert i mikrofluidisk spirende chip. Det første fysiologiske mikromiljøet av neovaskularisering ble rekaitulert med mikrofluidisk kontrollsystem, der EC ville bli utsatt for høyt luminal skjærstress, fysiologisk transendothelial flyt og ulike vaskulære endotelvekstfaktor (VEGF) distribusjoner samtidig. MIEN-modellen kan lett brukes på studiet av neovaskulariseringsmekanisme og har et potensielt løfte som en rimelig plattform for narkotikascreening og toksikologiapplikasjoner.

In vitro 3D-modellen for å etterligne den første hendelsen av neovaskularisering (MIEN) presentert her besto av en mikrofluidisk spirende chip og et mikrofluidisk kontrollsystem. Den mikrofluidiske spirende chip ble optimalisert fra tidligerepublikasjoner 22,23,37,40,51,52,53. Kor...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization at JoVE.com

Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization

Her gir vi en mikrofluidisk chip og et automatisk kontrollert, svært effektivt sirkulasjonsmikrofluidisk system som rekastatiserer det første mikromiljøet av neovaskularisering, slik at endotelceller (ECer) stimuleres av høyt luminalskjærstress, fysiologisk nivå av transendothelial flyt og ulike vaskulære endotelvekstfaktor (VEGF) distribusjon samtidig.

Mikrofluidisk modell for å etterligne første hendelse av neovaskularisering

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the ...

Neovascularization, generering av nye blodkar er en svært regulert prosess i både normale og patologiske hendelser. For bedre å forstå neovascularization, er det viktig å rekonstruere prosessen i naturlig cellulær mikromiljø in vitro. Vi har utviklet en mikrofluidisk chip og automatisk kontroll.Svært effektive sirkulasjoner gjøres for å danne perfusjonsmikrorør og simulere for å bruke proteinet til å rekapitulere til den første hendelsen av ny vaskularisering. Den mikrofluidiske spirebrikken besto av tre kanaler. En endotelcellekulturkanal og en flytende kanal ble skilt av en bred sentral hydrogelkanal.Det mikrofluidiske kontrollsystemet besto av en mikrosyringpumpe og elektromagnetisk klemmeventil. En boblefellebrikke, en mikrofluidisk spirende chip, en mikroperistaltisk pumpe og et kulturmediumreservoar. Med et mikrofluidisk system kan endotelceller stimuleres av høy luminal skjærspenning, fysiologisk nivå av transendotelial strømning og ulike vaskulære endoteliale vekstfaktorfordelinger samtidig.Pipette 20 mikroliter på 125 mikrogram per milliliter fibronectin i en medieinjeksjonsport for cellekulturkanal. Klipp en pipettespiss for å passe til porten til cellekulturkanalen med saks. Sett pipettespissen inn i den andre medieinjeksjonsporten til cellekulturkanalen.Deretter pipetter du ut luft fra cellekulturkanalen for å fylle den med fibronectin. Inkuber sjetongene ved 37 grader Celsius i en time. Før cellesåing, pipette 20 mikroliter endotelcellemedium i hver medieinjeksjonsport og inkuber sjetongene ved 37 grader Celsius i 30 minutter.Deretter pipetterer du ut alle mediene i alle medieinjeksjonsporter. Deretter pipette fem mikroliter celle suspensjon i ett medium injeksjon port av celle kultur kanal. Deretter spredte endotelceller seg raskt over hele kanalen under differensialhydrostatisk trykk.Tilsett omtrent fire til seks mikroliter ECM-medier til den andre porten for å justere det hydrostatiske trykket og stoppe celleflyttingen. Fjern sjetongene til celleinkubatoren. Snu deretter sjetongene hvert 30.Bruk pipettespissen til å fjerne vedlagte celler i injeksjonsportene svært nøye. Sett deretter fire piggede kvinnelige Luer-adaptere inn i medieinjeksjonsportene og fyll med ECM-medier. Fjern sjetongene til celleinkubatoren, bytt ECM-medier og Luer-adaptere hver 12.For å montere det mikrofluidiske kontrollsystemet, lag to polytetrafluoretylenrør, to korte silikonrør, tre lange silikonrør, en piggete kvinnelig Luer-adapter, en Y-type kontakt og deretter tre L-typekontakter. Fyll sprøyten med 10 milliliter forvarmet ECM-medium. Koble et polytetrafluoretylenrør til sprøyten med en piggete, kvinnelig Luer-adapter.Koble deretter den andre enden av polytetrafluoretylenrøret til en Y-type kontakt. Deretter kobler du to lange silikonrør til de to andre endene av Y-kontakten. Vi bruker ett rør for å koble til reservoaret og det andre røret for å koble til boblefellebrikke.Koble et annet langt silikonrør til reservoaret. Deretter bruker du to korte silikonrør for å koble alle innløps- og utløpshull på det øverste laget av boblefellebrikke. Koble et polytetrafluoretylenrør til baksiden av brikken.Deretter fikser du en sprøyte på mikrosyringpumpen. Fest to lange silikonrør inn i den elektromagnetiske klemmeventilen. Deretter bytter du den elektromagnetiske klemmeventilen for å åpne rørledningen mellom sprøyten og reservoaret.Injiser medier i reservoaret ved hjelp av mikrosyringpumpe for å avtrekke luft i røret. Bytt deretter ventilen igjen for å åpne rørledningen mellom sprøyten og boblefellebrikken. Injiser medier for å fylle væskekammeret og bakrøret til boblefellebrikken.Ta ut endotelspirerende sjetonger fra celleinkubator, og fjern deretter Luer-adaptere på cellekultursiden. Sett inn to rørplugger i hydrogelinjeksjonsportene til mikrofluidspirerende spon. Koble bakrøret til boblefellebrikken til én port med cellekulturkanal.Sett inn en T-type kontakt i den andre porten og koble den til et langt silisiumrør som er koblet til reservoaret. Fest det lange silikonrøret inn i den mikroperistaltiske pumpen. Sett deretter inn et luftfilter i reservoaret.Deretter monterer du den mikrofluidiske spirebrikken til scenens toppinkubator. Deretter kobler du vakuumpumpen til hullene i det nederste laget av boblefellebrikke med et TPU-rør. Still inn motsatt sirkulasjonsvolum og en strømningshastighet i det tilpassede programmet som styrer mikrosyringpumpen og elektromagnetisk klemmeventil samtidig.Deretter setter du opp strømningshastigheten til mikroperistaltisk pumpe. Slå på mikrosyringepumpen. Deretter etableres sirkulasjonskontrollsystemet.Vi tester barrierefunksjonen til noen mikrofartøy i vår modell ved å måle diffusjonspermeabilitetskoeffisienten til 40 kDa F-I-T-C dextrin. Som det fremgår av figuren, er diffusjonskoeffisienten til statisk kulturbrikke med celleforing 0,1 pluss eller minus 0,3 mikrometer per sekund. Og diffusjonspermeabilitetskoeffisienten til tom kanal uten celleforing er 5,4 pluss eller minus 0,7 mikrometer per sekund.Endotelspireringsanalyse viste at endotelceller spiret inn i den sentrale hydrogelen, hovedsakelig etter 24 timer med statisk dyrking, mens graden av spiring ble betydelig redusert med økningen av luminal skjærspenning. Kvantitativt reduserte luminal skjærspenning endotelspirering betydelig når det gjelder spireområde, gjennomsnittlig spirelengde og den lengste spirelengden. Med vårt system kan skjærspenning på endotelceller endres når som helst under eksperimentet mens transendotelstrømmen holdt seg på fysiologisk nivå.Denne in vitro 3D biomimetiske modellen kan brukes direkte på studiet av neovasulariseringsmekanisme, og holder det potensielle løftet som en lavkostnadsplattform for narkotikascreening og toksikologiapplikasjoner.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Microfluidic Chip Fabrikasjon og metode for å oppdage Influensa

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

En mikrofluid Technique å sondere Cell Fleksibilitet

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

A Microfluidic Model of Biomimetically Breathing Pulmonary Acinar Airways

En mikrofluid Model of Biomimetically Breathing Lunge acinar Airways

Quantifying respiratory flow characteristics in the pulmonary acinar depths and how they influence inhaled aerosol transport is critical towards ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

Ved hjelp av lim Mønstring å konstruere 3D Paper microfluidic enheter

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Bruke Rekonstituert Blood Model Hemostase og platetransfusjon<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Multi-trinns variabel Høyde Fotolitografi for Valved Multilayer microfluidic enheter

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Innledende vurdering av antistoff-conjugates endret med Viral-avledet peptider for øke mobilnettet akkumulering og forbedre svulst målretting

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...