Name: microfluidic model to mimic initial event of neovascularization
Uploaded: 2021-04-10T13:00:00
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Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Research Foundation of China Grants-in-Aid (grant nº 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 e 32071311), programa nacional de pesquisa e desenvolvimento da China (grant nº 2016YFC110101 e 2016YFC1102202), o Projeto 111 (B13003) e a Fundação de Ciências Naturais de Pequim (4194079).

1. Preparação de wafer
NOTA: Este protocolo é específico para o fotoresist negativo SU-8 2075 utilizado durante esta pesquisa.
<ol><li>Limpe o wafer de silício 3 a 5 vezes com metanol e isopropanol em um revestimento de giro da seguinte forma: primeiro gire por 15 s a 500 rpm, e depois gire por 60 s a 3.000 rpm.</li>
	<li>Transfira o wafer de silício para uma placa de aquecimento, que é pré-aquecido a 180 °C e asse o wafer por 10 minutos.</li>
	<li>Remova o wafer de silício da plac...

Por muito tempo, a observação em tempo real da neovascularização tem sido um problema. Várias abordagens foram desenvolvidas recentemente para criar forro de vasos perfumados com CEs e adjacentes à matriz extracelular para brotar22,32,40,46,54, mas o microambiente mecânico ainda é difícil de manter constantemente. Continua sendo um sujeito difícil de...

A neovascularização acontece em muitos processos normais e patológicos1,2,3,4, que incluem dois processos importantes em adultos, angiogênese e arteriogênese5. Além dos fatores de crescimento mais conhecidos, como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)6, estimulações mecânicas, em especial o estresse da cisalhamento induzido pelo fluxo sanguíneo, é importante na regulação da neovascularização7. Como sabemos, a magnitude e as formas de estresse de tesoura variam de forma dramática e dinâmica em diferentes partes da vasculatura, resultando em efeitos importantes sobre as células vasculares8,9,10,11,12. Estudos anteriores mostraram que o estresse da tesoura pode afetar vários aspectos das CE, incluindo alterações fenotípicas celulares, transdução de sinal, expressão genética e a comunicação com células mural13,14,15,16,17,18,19,20; portanto, regular a neovascularização21,22,23,24.
Portanto, para entender melhor a neovascularização, é importante reconstruir o processo no microambiente celular natural in vitro. Recentemente, muitos modelos foram estabelecidos para criar microestinas e fornecer controle preciso do microambiente25,26,27, aproveitando os avanços na microfabagem e tecnologia microfluida. Nesses modelos, os microimpostos podem ser gerados por chips microfluidos de hidrogel28,29, polidimtilsiloxano (PDMS)30,31,32 ou 3D bioimpressora33,34. Alguns aspectos do microambiente, tais como o estresse da cisalhamento luminal22,23,35,36, fluxo transendotelial37,38,39,40, gradiente bioquímico de fatores angiogênicos41,42, tensão/estiramento43,44,45, e co-cultivado com outros tipos de células32,46 foram imitados e controlados. Normalmente, um grande reservatório ou bomba de seringa era usado para fornecer meio perfumado. O fluxo transendotelial nesses modelos foi criado pela queda de pressão entre o reservatório e o micro-tubo22,23,38,40. No entanto, o microambiente mecânico era difícil de manter constantemente desta forma. O fluxo transendotelial aumentaria e, em seguida, excederia o nível fisiológico se uma alta taxa de fluxo com alto estresse de cisalhamento fosse usada para perfusão. Estudo anterior mostrou que, no período inicial de neovascularização, a velocidade do fluxo transendotelial é muito baixa devido às CEs intactas e membrana do porão, geralmente abaixo de 0,05 μm/s8. Enquanto isso, embora o estresse luminal do corte no sistema vascular varie muito, é relativamente alto com valores médios de 5-20 dyn/cm2,11,47. Por enquanto, a velocidade do fluxo transendotelial em trabalhos anteriores tem sido geralmente mantida entre 0,5-15 μm/s22,38,39,40, e o estresse da cisalhamento luminal foi geralmente inferior a 10 dyn/cm223. Continua sendo um assunto difícil de expor constantemente as CEs ao alto estresse luminal da cisalhamento e ao nível fisiológico do fluxo transendotelial simultaneamente. 
No presente estudo, descrevemos um modelo 3D in vitro para imitar o evento inicial de neovascularização (MIEN). Desenvolvemos um chip microfluido e um sistema de circulação automático, altamente eficiente para formar micro-tubos de perfusão e simular o processo de brotaçãode 48. Com o modelo MIEN, o microambiente das CE estimulados no período inicial de neovascularização são, em primeiro lugar, recapitulados. As CE podem ser estimuladas pelo alto estresse luminal da cisalhamento, nível fisiológico de fluxo transendotelial e distribuição de vários VEGF simultaneamente. Descrevemos os passos de estabelecer o modelo MIEN em detalhes e os pontos-chave a serem prestados atenção, na esperança de fornecer uma referência para outros pesquisadores.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Genview</td>
			<td>GP3108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electromagnetic pinch valve</td>
			<td>Wokun Technology</td>
			<td>WK02-308-1/3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell medium (ECM)</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Every Green</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran</td>
			<td>Miragen</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphical programming environment</td>
			<td>Lab VIEW</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image editing software</td>
			<td>PhotoShop</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing program</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>91237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithography equipment</td>
			<td>Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences</td>
			<td>URE-2000/35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>82762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-peristaltic pump</td>
			<td>Lead Fluid</td>
			<td>BT101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-syringe pump</td>
			<td>Lead Fluid</td>
			<td>TYD01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma</td>
			<td>MING HENG</td>
			<td>PDC-MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent epoxy negative photoresist</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene</td>
			<td>Teflon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Program software</td>
			<td>MATLAB</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF-165</td>
			<td>StemImmune LLC</td>
			<td>HVG-VF5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.06498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Phalloidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic model to mimic initial event of neovascularization

A neovascularização é geralmente inicializada a partir de uma vasculatura normal existente e o microambiente biomecânico das células endoteliais (CES) no estágio inicial varia drasticamente do processo seguinte de neovascularização. Embora existam muitos modelos para simular diferentes estágios de neovascularização, ainda falta um modelo 3D in vitro que capitula o processo inicial de neovascularização sob as estimulações correspondentes de microambientes normais de vasculatura. Aqui, reconstruímos um modelo 3D in vitro que imita o evento inicial de neovascularização (MIEN). O modelo MIEN contém um chip de brotação microfluido e um sistema de circulação de controle automático e altamente eficiente. Formou-se um microcanal funcional e perfusível revestido de endotélio e o processo de broto foi simulado no chip de brotação microfluídica. O microambiente fisiológico inicialmente da neovascularização foi recapitulado com o sistema de controle microfluido, pelo qual as CEs seriam expostas ao alto estresse da cisalhamento luminal, fluxo transendotelial fisiológico e várias distribuições de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) simultaneamente. O modelo MIEN pode ser facilmente aplicado ao estudo do mecanismo de neovascularização e mantém uma potencial promessa como uma plataforma de baixo custo para aplicações de triagem de medicamentos e toxicologia.

O modelo 3D in vitro para imitar o evento inicial de neovascularização (MIEN) apresentado aqui consistia em um chip de broto microfluido e um sistema de controle microfluido. O chip de broto microfluido foi otimizado a partir das publicações anteriores22,23,37,40,51,52,53. Resum...

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Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization

Aqui, fornecemos um chip microfluido e um sistema microfluido de circulação de circulação automaticamente controlado e altamente eficiente que recapitula o microambiente inicial da neovascularização, permitindo que as células endoteliais (CE) sejam estimuladas pelo alto estresse da cisalhamento luminal, nível fisiológico de fluxo transendelial e distribuição de vários fatores de crescimento endotelial vascular (VEGF) simultaneamente.

Modelo microfluido para imitar evento inicial de neovascularização

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the ...

A neovascularização, a geração de novos vasos sanguíneos é um processo altamente regulado em eventos normais e patológicos. Para entender melhor a neovascularização, é importante reconstruir o processo no microambiente celular natural in vitro. Desenvolvemos um chip microfluido e controle automático.Circulações altamente eficientes são feitas para formar micro-tubos de perfusão e simular o uso da proteína para recapitular ao evento inicial de nova vascularização. O chip de brotação microfluida era composto por três canais. Um canal de cultura celular endotelial e um canal líquido foram separados por um amplo canal de hidrogel central.O sistema de controle microfluido consistia em uma bomba de microsiringe e válvula de beliscão eletromagnética. Um chip de armadilha de bolhas, um chip de brotação microfluido, uma bomba micro-peristáltica, e um reservatório de cultura média. Com um sistema microfluido, as células endoteliais poderiam ser estimuladas por alto estresse luminal, nível fisiológico de fluxo transendotelial e várias distribuições de fatores de crescimento endotelial vascular simultaneamente.Pipeta 20 microliter de 125 microgramas por mililitro de fibronectina em uma porta de injeção de mídia do canal de cultura celular. Corte uma ponta de pipeta para caber no canal de cultura de células com uma tesoura. Insira a ponta pipeta no outro porta de injeção de mídia do canal de cultura celular.Em seguida, pipeta fora ar do canal de cultura celular para preenchê-lo com fibronectina. Incubar os chips a 37 graus Celsius por uma hora. Antes da semeadura celular, pipeta 20 microliter de meio celular endotelial em cada porta de injeção de mídia e incubar os chips a 37 graus Celsius por 30 minutos.Então, pipeta toda a mídia em todas as portas de injeção de mídia. Em seguida, pipeta cinco microliter de suspensão celular em uma porta de injeção de mídia do canal de cultura celular. Em seguida, as células endoteliais rapidamente se espalham por todo o canal sob pressão hidrostática diferencial.Adicione cerca de quatro a seis microliter de mídia ECM à outra porta para ajustar a pressão hidrostática e parar o movimento da célula. Controle os chips para a incubadora de células. Em seguida, vire os chips a cada 30 minutos até que as células endoteliais se vestem ao redor da superfície interna do canal de cultura celular, duas horas depois.Use a ponta pipeta para remover as células anexadas nas portas de injeção com muito cuidado. Em seguida, insira quatro adaptadores Luer femininos farpados nas portas de injeção de mídia e encha com mídia ECM. Remova os chips para a incubadora celular, troque a mídia ECM e os adaptadores Luer a cada 12 horas.Para montar o sistema de controle microfluido, prepare dois tubos de politetrafluoroetileno, dois tubos curtos de silicone, três tubos de silicone longos, um adaptador luer feminino farpado, um conector tipo Y e, em seguida, três conectores tipo L. Encha a seringa com 10 mililitros de meio ECM pré-aquecido. Conecte um tubo de politetrafluoroetileno à seringa por um adaptador luer fêmea farpado.Em seguida, conecte a outra extremidade do tubo de politetrafluoroetileno a um conector do tipo Y. Em seguida, conecte dois tubos de silicone longos às outras duas extremidades do conector tipo Y. Usamos um tubo para conectar ao reservatório e ao outro tubo para conectar ao chip de armadilha de bolhas.Conecte outro tubo de silicone longo ao reservatório. Em seguida, use dois tubos curtos de silicone para conectar todos os orifícios de entrada e saída na camada superior do chip de armadilha de bolhas. Conecte um tubo de politetrafluoroetileno ao backend do chip.Em seguida, conserte uma seringa na bomba de microsinga. Corte dois tubos de silicone longos na válvula de beliscão eletromagnética. Em seguida, troque a válvula de beliscão eletromagnética para abrir o gasoduto entre a seringa e o reservatório.Injete mídia no reservatório usando a bomba de microsiringe para esgotar o ar no tubo. Em seguida, troque a válvula novamente para abrir o gasoduto entre a seringa e o chip de armadilha de bolhas. Injete mídia para encher a câmara líquida e o tubo de retroescadidade do chip de armadilha de bolhas.Retire chips de broto endotelial da incubadora celular e remova os adaptadores luer no lado da cultura celular. Insira dois plugues de tubo nas portas de injeção de hidrogel do chip de brotação microfluida. Conecte o tubo back-end do chip bubble trap a uma porta de canal de cultura celular.Insira um conector tipo T na outra porta e conecte-o ao tubo de silício longo conectado ao reservatório. Corte o tubo de silicone longo na bomba micro peristáltica. Em seguida, insira um filtro de ar no reservatório.Em seguida, monte o chip de brotação microfluidic para a incubadora de topo do palco. Em seguida, conecte a bomba de vácuo aos orifícios na camada inferior do chip de armadilha de bolhas por um tubo TPU. Defina o volume de circulação oposto e uma taxa de fluxo no programa personalizado que controla a bomba de microsinga e a válvula de beliscão eletromagnética simultaneamente.Em seguida, configure a taxa de fluxo da bomba micro peristáltica. Ligue a bomba de microsiringe. Em seguida, o sistema de controle de circulação é estabelecido.Testamos a função de barreira de alguns micro-vasos em nosso modelo medindo o coeficiente de permeabilidade difuso de 40 kDa F-I-T-C dextrina. Como é mostrado na figura, o coeficiente de permeabilidade difuso de chip de cultura estática com revestimento celular é de 0,1 mais ou menos 0,3 micrômetro por segundo. E o coeficiente de permeabilidade difusional do canal vazio sem forro celular é de 5,4 mais ou menos 0,7 micrômetros por segundo.O ensaio de broto endotelial mostrou que as células endoteliais brotaram no hidrogel central em grande parte após 24 horas de cultivo estático, enquanto o grau de broto diminuiu significativamente com o aumento do estresse luminal da tesoura. Quantitativamente, o estresse da tesoura luminal diminuiu significativamente o broto endotelial em termos de área de broto, comprimento médio de broto e o maior comprimento de broto. Com nosso sistema, o estresse de cisalhamento nas células endoteliais pode ser alterado opcionalmente a qualquer momento durante o experimento, enquanto o fluxo transendotelial permaneceu em nível fisiológico.Este modelo biomimético 3D in vitro pode ser diretamente aplicado ao estudo do mecanismo de neovasularização, e mantém a promessa potencial como uma plataforma de baixo custo para aplicações de triagem de medicamentos e toxicologia.

Research

JoVE Journal

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