Name: microfluidic model to mimic initial event of neovascularization
Uploaded: 2021-04-10T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la National Natural Science Research Foundation of China Grants-in-Aid (subvención nº 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 y 32071311), Programa Nacional clave de investigación y desarrollo de China (subvención Nº 2016YFC1101101 y 2016YFC1102202), el Proyecto 111 (B13003) y la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing (4194079).

1. Preparación de obleas
NOTA: Este protocolo es específico para el fotoresista negativo SU-8 2075 utilizado durante esta investigación.
<ol><li>Limpie la oblea de silicio de 3 a 5 veces con metanol e isopropanol en una capa de espín de la siguiente manera: primero gire durante 15 s a 500 rpm, y luego gire durante 60 s a 3.000 rpm.</li>
	<li>Transfiera la oblea de silicio a una placa caliente, que está precalentada a 180 °C y hornee la oblea durante 10 minutos.</li>
	<li>Retire la oble...

Durante mucho tiempo, la observación en tiempo real de la neovascularización ha sido un problema. Recientemente se han desarrollado varios enfoques para crear revestimientos de recipientes perfundidos con EC y adyacentes a matriz extracelular para brotar22,32,40,46,54,pero el microambiente mecánico todavía es difícil de mantener constantemente. Sigue sien...

La neovascularización ocurre en muchos procesos normales y patológicos1,2,3,4,que incluyen dos procesos principales en adultos, angiogénesis y arteriogénesis5. Además de los factores de crecimiento más conocidos, como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)6,las estimulaciones mecánicas, en particular el estrés esquilar inducido por el flujo sanguíneo, es importante en la regulación de la neovascularización7. Como sabemos, la magnitud y las formas de estrés cizallado varían dramática y dinámicamente en diferentes partes de la vasculatura, lo que resulta en efectos importantes en las células vasculares8,9,10,11,12. Estudios previos han demostrado que el estrés cizallado puede afectar a varios aspectos de los EC, incluyendo cambios fenotípicos celulares, transducción de señal, expresión génica, y la comunicación con las células murales13,14,15,16,17,18,19,20; por lo tanto, regular la neovascularización21,22,23,24.
Por lo tanto, para entender mejor la neovascularización, es importante reconstruir el proceso en microambiente celular natural in vitro. Recientemente, se han establecido muchos modelos para crear micro-recipientes y proporcionar un control preciso del microambiente25,26,27,aprovechando los avances en microfabricación y tecnología microfluídica. En estos modelos, los micro-recipientes pueden ser generados por hidrogel28,29,chips microfluídicos polidimetillesiloxano (PDMS)30,31,32 o bioimpresión 33,34. Algunos aspectos del microambiente, tales como tensión de cizallamiento luminal22,23,35,36,flujo transendotelial37,38,39,40,gradiente bioquímico de factores angiogénicos41,42,cepa / estiramiento43,44,45,y co-cultivado con otros tipos de células32,46 han sido imitados y controlados. Por lo general, se utilizó un depósito grande o una bomba de jeringa para proporcionar medio perfundido. El flujo transendotelial en estos modelos fue creado por caída de presión entre el depósito y el micro-tubo22,23,38,40. Sin embargo, el microambiente mecánico era difícil de mantener constantemente de esta manera. El flujo transendotelial aumentaría y luego superaría el nivel fisiológico si se utilizara un alto caudal con alto estrés cizallado para perfusión. Estudios previos mostraron que en el período inicial de neovascularización, la velocidad del flujo transendotelial es muy baja debido a los ECT intactos y la membrana del sótano, generalmente por debajo de 0,05 μm/s8. Mientras tanto, aunque el estrés de cizallador luminal en el sistema vascular varía mucho, es relativamente alto con valores medios de 5-20 dyn/cm2,11,47. Por ahora, la velocidad del flujo transendotelial en trabajos anteriores se ha mantenido generalmente entre 0,5-15 μm/s22,38,39,40,y la tensión de cizallación luminal era generalmente inferior a 10 dyn/cm223. Sigue siendo un tema difícil de exponer constantemente los ECT a un alto estrés de cizallación luminal y un nivel fisiológico de flujo transendotelial simultáneamente. 
En el presente estudio, describimos un modelo 3D in vitro para imitar el evento inicial de neovascularización (MIEN). Desarrollamos un chip microfluídico y un sistema de circulación de control automático y altamente eficiente para formar microtubadores perfusión y simular el proceso de germinación48. Con el modelo MIEN, el microambiente de los ECT estimulados en el período inicial de neovascularización se recapitulan en primer lugar. Los ECT pueden ser estimulados por alto estrés de cizalladura luminal, nivel fisiológico de flujo transendotelial y varias distribuciones de VEGF simultáneamente. Describimos los pasos para establecer el modelo MIEN en detalle y los puntos clave a los que hay que prestar atención, con la esperanza de proporcionar una referencia para otros investigadores.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Genview</td>
			<td>GP3108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electromagnetic pinch valve</td>
			<td>Wokun Technology</td>
			<td>WK02-308-1/3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell medium (ECM)</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Every Green</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran</td>
			<td>Miragen</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphical programming environment</td>
			<td>Lab VIEW</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image editing software</td>
			<td>PhotoShop</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing program</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>91237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithography equipment</td>
			<td>Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences</td>
			<td>URE-2000/35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>82762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-peristaltic pump</td>
			<td>Lead Fluid</td>
			<td>BT101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-syringe pump</td>
			<td>Lead Fluid</td>
			<td>TYD01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma</td>
			<td>MING HENG</td>
			<td>PDC-MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent epoxy negative photoresist</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene</td>
			<td>Teflon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Program software</td>
			<td>MATLAB</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF-165</td>
			<td>StemImmune LLC</td>
			<td>HVG-VF5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.06498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Phalloidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic model to mimic initial event of neovascularization

La neovascularización generalmente se inicializa a partir de una vasculatura normal existente y el microambiente biomecánico de las células endoteliales (EC) en la etapa inicial varía drásticamente del siguiente proceso de neovascularización. Aunque hay un montón de modelos para simular diferentes etapas de neovascularización, todavía falta un modelo 3D in vitro que capitula el proceso inicial de neovascularización bajo las correspondientes estimulaciones de microambientes de vasculatura normales. Aquí, reconstruimos un modelo 3D in vitro que imita el evento inicial de neovascularización (MIEN). El modelo MIEN contiene un chip de brote microfluídico y un sistema de circulación de control automático y altamente eficiente. Se formó un microcanal funcional y perfusible recubierto de endotelio y se simuló el proceso de germinación en el chip de brote microfluídico. El microambiente inicialmente fisiológico de la neovascularización fue recapitulado con el sistema de control microfluídico, por el cual los ECT estarían expuestos a alto estrés de cizallamiento luminal, flujo transendotelial fisiológico y varias distribuciones de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) simultáneamente. El modelo MIEN se puede aplicar fácilmente al estudio del mecanismo de neovascularización y tiene una promesa potencial como plataforma de bajo costo para aplicaciones de detección de fármacos y toxicología.

El modelo 3D in vitro para imitar el evento inicial de neovascularización (MIEN) presentado aquí consistía en un chip de brote microfluídico y un sistema de control microfluídico. El chip de germinación microfluídica fue optimizado de publicaciones anteriores22,23,37,40,51,52,53</s...

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Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization

Aquí, proporcionamos un chip microfluídico y un sistema microfluídico de circulación automáticamente controlado y altamente eficiente que recapitula el microambiente inicial de neovascularización, permitiendo que las células endoteliales (ECs) sean estimuladas por un alto estrés esquilar luminal, nivel fisiológico de flujo transendotelial y diversa distribución del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) simultáneamente.

Modelo microfluídico para imitar el evento inicial de neovascularización

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the ...

Neovascularización, la generación de nuevos vasos sanguíneos es un proceso altamente regulado tanto en eventos normales como patológicos. Para entender mejor la neovascularización, es importante reconstruir el proceso en microambiente celular natural in vitro. Hemos desarrollado un chip microfluídico y un control automático.Las circulaciones altamente eficientes se realizan para formar microtubatos de perfusión y simular el uso de la proteína para recapitular al evento inicial de nueva vascularización. El chip de germinación microfluídica consistió en tres canales. Un canal de cultivo celular endotelial y un canal líquido fueron separados por un amplio canal central de hidrogel.El sistema de control microfluídico consistía en una bomba de microsyringe y una válvula de pellizco electromagnético. Un chip trampa de burbujas, un chip de brote microfluídico, una bomba micro-peristáltica y un depósito medio de cultivo. Con un sistema microfluídico, las células endoteliales podrían ser estimuladas por un alto estrés de cizalladura luminal, nivel fisiológico de flujo transendotelial y varias distribuciones de factores de crecimiento endotelial vascular simultáneamente.Pipeta 20 microlitros de 125 microgramos por mililitro de fibronectina en un puerto de inyección de medios del canal de cultivo celular. Corte una punta de pipeta para adaptarse al puerto del canal de cultivo celular con tijeras. Inserte la punta de la pipeta en el otro puerto de inyección de medios del canal de cultivo celular.Luego, pipeta fuera del aire del canal de cultivo celular para llenarla de fibronectina. Incuba las virutas a 37 grados centígrados durante una hora. Antes de la siembra celular, pipeta 20 microliter de células endoteliales medio en cada puerto de inyección de medios e incubar los chips a 37 grados Celsius durante 30 minutos.A continuación, pipetear todos los medios en todos los puertos de inyección de medios. A continuación, pipetear cinco microlitros de suspensión celular en un puerto de inyección de medios del canal de cultivo celular. Luego, las células endoteliales se extendieron rápidamente por todo el canal bajo presión hidrostática diferencial.Agregue entre cuatro y seis microlitros de medios ECM al otro puerto para ajustar la presión hidrostática y detener el movimiento de la célula. Control remoto de las virutas a la incubadora de celdas. Luego, gire los chips cada 30 minutos hasta que las células endoteliales se cubran alrededor de la superficie interna del canal de cultivo celular, dos horas más tarde.Utilice la punta de la pipeta para eliminar las células conectadas en los puertos de inyección con mucho cuidado. A continuación, inserte cuatro adaptadores Luer hembra de púas en los puertos de inyección de medios y rellene con medios ECM. Retire los chips a la incubadora de celdas, cambie los medios ECM y los adaptadores Luer cada 12 horas.Para ensamblar el sistema de control microfluídico, prepare dos tubos de politetrafluoroetileno, dos tubos cortos de silicona, tres tubos largos de silicona, un adaptador luer hembra de púas, un conector tipo Y y, a continuación, tres conectores tipo L. Llene la jeringa con 10 mililitros de medio ECM precalentado. Conecte un tubo de politetrafluoroetileno a la jeringa mediante un adaptador luer hembra de púas.A continuación, conecte el otro extremo del tubo de politetrafluoroetileno a un conector de tipo Y. A continuación, conecte dos tubos largos de silicona a los otros dos extremos del conector tipo Y. Utilizamos un tubo para conectarlo al depósito y al otro tubo para conectarlo al chip trampa de burbujas.Conecte otro tubo largo de silicona al depósito. A continuación, utilice dos tubos cortos de silicona para conectar todos los orificios de entrada y salida en la capa superior del chip trampa de burbujas. Conecte un tubo de politetrafluoroetileno al back-end del chip.A continuación, fije una jeringa en la bomba de microsyringe. Recorte dos tubos largos de silicona en la válvula de pellizco electromagnético. A continuación, cambie la válvula de pellizco electromagnético para abrir la tubería entre la jeringa y el depósito.Inyecte los medios en el depósito utilizando una bomba de microsyringe para agotar el aire en el tubo. A continuación, vuelva a cambiar la válvula para abrir la tubería entre la jeringa y el chip trampa de burbujas. Inyecte medios para llenar la cámara líquida y el tubo back-end del chip trampa de burbujas.Saque las virutas de brote endotelial de la incubadora de células y, a continuación, retire los adaptadores Luer en el lado del cultivo celular. Inserte dos tapones de tubería en los puertos de inyección de hidrogel de chip de brote microfluídico. Conecte el tubo back-end del chip trampa de burbujas a un puerto del canal de referencia celular.Inserte un conector tipo T en el otro puerto y conéctelo a un tubo de silicio largo conectado con el depósito. Corta el tubo largo de silicona en la bomba micro peristáltica. A continuación, inserte un filtro de aire en el depósito.A continuación, ensambla el chip microfluídico para la incubadora de la parte superior del escenario. A continuación, conecte la bomba de vacío a los agujeros de la capa inferior del chip trampa de burbujas mediante un tubo TPU. Ajuste el volumen de circulación opuesto y un caudal en el programa personalizado que controla simultáneamente la bomba de microsyringe y la válvula de pellizcar electromagnética.A continuación, configure el caudal de la bomba micro peristáltica. Encienda la bomba de microsyringe. A continuación, se establece el sistema de control de circulación.Probamos la función de barrera de algunos micro-recipientes en nuestro modelo midiendo el coeficiente de permeabilidad diffusional de 40 kDa F-I-T-C dextrina. Como se muestra en la figura, el coeficiente de permeabilidad diffusional del chip de cultivo estático con revestimiento celular es de 0,1 más o menos 0,3 micrómetros por segundo. Y el coeficiente de permeabilidad diffusional del canal vacío sin revestimiento celular es de 5,4 más o menos 0,7 micrómetros por segundo.El ensayo de brotes endoteliales mostró que las células endoteliales brotaron en el hidrogel central en gran parte después de 24 horas de cultivo estático, mientras que el grado de brote disminuyó significativamente con el aumento del estrés de cizallamiento luminal. Cuantitativamente, el estrés de cizallamiento luminal disminuyó significativamente el brote endotelial en términos de área de brotes, longitud media de brotes y la longitud de brote más larga. Con nuestro sistema, el estrés cizallador en las células endoteliales podría cambiarse opcionalmente en cualquier momento durante el experimento, mientras que el flujo transendotelial se mantuvo a nivel fisiológico.Este modelo biomimético 3D in vitro se puede aplicar directamente al estudio del mecanismo de neovasularización, y mantiene la promesa potencial como una plataforma de bajo costo para aplicaciones de detección de fármacos y toxicología.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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