Name: microfluidic model to mimic initial event of neovascularization
Uploaded: 2021-04-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Natural Science Research Foundation of China Grants-in-Aid (bidrag nr 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 och 32071311), Kinas nationella centrala forsknings- och utvecklingsprogram (bidrag nr 2016YFC1101101 och 2016YFC1102202), 111-projektet (B13003) och Beijing Natural Science Foundation (4194079).

1. Wafer förberedelse
OBS: Detta protokoll är specifikt för SU-8 2075 negativ fotoresist som används under denna forskning.
<ol><li>Rengör silikonskivan 3 till 5 gånger med metanol och isopropanol på en spincoater enligt följande: snurra först i 15 s vid 500 varv/min och snurra sedan i 60 s vid 3 000 varv/min.</li>
	<li>Överför kiselskivan till en kokplatta, som är förvärmd till 180 °C och grädda skivan i 10 minuter.</li>
	<li>Ta bort kiselskivan från värmeplattan och kyl d...

Under lång tid har realtidsobservation av neovaskularisering varit ett problem. Flera metoder har utvecklats nyligen för att skapa perfused fartyg foder med ECs och intill extracellulär matris för spirande22,32,40,46,54, men den mekaniska mikromiljön är fortfarande svårt att upprätthålla ständigt. Det är fortfarande ett svårt ämne att efterlikna d...

Neovascularization händer i många normala och patologiska processer1,2,3,4, som inkluderar två stora processer hos vuxna, angiogenes och arteriogenesis5. Förutom de mest kända tillväxtfaktorerna, såsom vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF)6, mekaniska stimuleringar, i synnerhet blodflödet inducerad savspänning, är viktigt vid regleringen av neovaskularisering7. Som vi vet varierar omfattningen och formerna av saxstress dramatiskt och dynamiskt i olika delar av vaskulaturen, vilket resulterar i viktiga effekter påkärlceller 8,9,10,11,12. Tidigare studier har visat att shear stress kan påverka olika aspekter av ECs, inklusive cell fenotypiska förändringar, signaltransduktion, genuttryck, och kommunikationen med muralceller13,14,15,16,17,18,19,20; därför reglera neovaskularisering21,22,23,24.
För att bättre förstå neovaskularisering är det därför viktigt att rekonstruera processen i naturlig cellulär mikromiljö in vitro. Nyligen har många modeller etablerats för att skapa mikrokärl och ge exakt kontroll över mikromiljön25,26,27, och dra nytta av framsteg inom mikrotillverkning och mikrofluidisk teknik. I dessa modeller kan mikrokärl genereras av hydrogel28,29, polydimethylsiloxane (PDMS) mikrofluidiska chips30,31,32 eller 3D bioprinting33,34. Vissa aspekter av mikromiljön, såsom luminal shear stress22,23,35,36, transendotelial flöde37,38,39,40, biokemisk gradient av angiogena faktorer41,42, stam / sträcka43,44,45, och samkulturerad med andra typer av celler32,46 har efterliknats och kontrollerats. Vanligtvis användes en stor reservoar eller sprutpump för att ge perfused medium. Transendotelflödet i dessa modeller skapades av tryckfall mellan reservoaren och mikroröret22,23,38,40. Den mekaniska mikromiljön var dock svår att upprätthålla hela tiden på detta sätt. Transendotelflödet skulle öka och sedan överstiga den fysiologiska nivån om ett högt flöde med hög savspänning användes för perfusion. Tidigare studie visade att vid den första perioden av neovaskularisering är hastigheten på transendotelflödet mycket låg på grund av de intakta ECs och källarmembranet, vanligtvis under 0,05 μm/s8. Under tiden, även om luminal shear stress i vaskulär systemet varierar kraftigt, är det relativt högt med medelvärden på 5-20 dyn/cm2,11,47. För närvarande har hastigheten på transendotelflödet i tidigare verk i allmänhet hållits mellan 0,5-15 μm/s22,38,39,40, och luminal shear stress var vanligtvis under 10 dyn / cm223. Det är fortfarande ett svårt ämne att ständigt utsätta ECs för hög luminal shear stress och fysiologisk nivå av transendotelial flöde samtidigt. 
I den aktuella studien beskriver vi en in vitro 3D-modell för att efterlikna den första händelsen av neovascularization (MIEN). Vi utvecklade ett mikrofluidiskt chip och ett automatiskt styrsystem, mycket effektivt cirkulationssystem för att bilda perfusionsmikrorör och simulera processen med att spira48. Med MIEN-modellen rekapituleras först mikromiljön för ECs som stimulerades vid den första perioden av neovaskularisering. ECs kan stimuleras av hög luminal shear stress, fysiologisk nivå av transendotelial flöde och olika VEGF distribution samtidigt. Vi beskriver stegen för att etablera MIEN-modellen i detalj och de viktigaste punkterna som ska uppmärksammas, i hopp om att ge en referens till andra forskare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Genview</td>
			<td>GP3108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electromagnetic pinch valve</td>
			<td>Wokun Technology</td>
			<td>WK02-308-1/3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell medium (ECM)</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Every Green</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran</td>
			<td>Miragen</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphical programming environment</td>
			<td>Lab VIEW</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image editing software</td>
			<td>PhotoShop</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing program</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>91237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithography equipment</td>
			<td>Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences</td>
			<td>URE-2000/35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>82762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-peristaltic pump</td>
			<td>Lead Fluid</td>
			<td>BT101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-syringe pump</td>
			<td>Lead Fluid</td>
			<td>TYD01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma</td>
			<td>MING HENG</td>
			<td>PDC-MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent epoxy negative photoresist</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene</td>
			<td>Teflon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Program software</td>
			<td>MATLAB</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF-165</td>
			<td>StemImmune LLC</td>
			<td>HVG-VF5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.06498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Phalloidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic model to mimic initial event of neovascularization

Neovascularization initieras vanligtvis från en befintlig normal vaskulatur och biomekaniska microenvironment av endotelceller (ECs) i det inledande skedet varierar dramatiskt från följande process av neovascularization. Även om det finns gott om modeller för att simulera olika stadier av neovaskularisering, saknas fortfarande en in vitro 3D-modell som kapitulerar den ursprungliga processen för neovaskularisering under motsvarande stimuleringar av normala vaskulaturmikrovironment. Här rekonstruerade vi en in vitro 3D-modell som efterliknar den första händelsen av neovaskularisering (MIEN). MIEN-modellen innehåller ett mikrofluidiskt spirande chip och ett automatiskt styrsystem med hög effektiv cirkulation. En funktionell, perfusable microchannel belagda med endotel bildades och processen att spira simulerades i mikrofluidic spirande chip. Den ursprungligen fysiologiska mikromiljön av neovascularization recapitulated med det mikrofluidiska kontrollsystemet, genom vilket ECs skulle utsättas för hög luminal shear stress, fysiologiska transendotelial flöde och olika vaskulär endotel tillväxtfaktor (VEGF) distributioner samtidigt. MIEN-modellen kan enkelt tillämpas på studier av neovaskulariseringsmekanism och har ett potentiellt löfte som en billig plattform för läkemedelsscreening och toxikologiska tillämpningar.

In vitro 3D-modellen för att efterlikna den första händelsen av neovascularization (MIEN) som presenteras här bestod av ett mikrofluidiskt spirande chip och ett mikrofluidiskt kontrollsystem. Det mikrofluidiska groddarchipet optimerades från tidigare publikationer22,23,37,40,51,52,53...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization at JoVE.com

Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization

Här tillhandahåller vi ett mikrofluidiskt chip och ett automatiskt kontrollerat, högeffektivt cirkulationsmikrofluidiskt system som rekapitulerar den ursprungliga mikromiljön av neovaskularisering, vilket gör att endotelceller (ECs) kan stimuleras av hög luminal shearstress, fysiologisk nivå av transendotelflöde och olika vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF) distribution samtidigt.

Mikrofluidisk modell för att efterlikna inledande händelse av neovaskularisering

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the ...

Neovaskularisering, generering av nya blodkärl är en starkt reglerad process i både normala och patologiska händelser. För att bättre förstå neovaskulariseringen är det viktigt att rekonstruera processen i naturlig cellulär mikromiljö in vitro. Vi har utvecklat ett mikrofluidiskt chip och automatisk styrning.Högeffektiva cirkulationer görs för att bilda perfusion mikrorör och simulera för att använda proteinet för att rekapitulera till den första händelsen av ny kärlisering. Microfluidic spirande chip bestod av tre kanaler. En endotel cell kultur kanal och en flytande kanal separerades av en bred centrala hydrogel kanal.Det mikrofluidiska styrsystemet bestod av en mikrosyringepump och elektromagnetisk klämventil. Ett bubbelfällechips, ett mikrofluidiskt spirande chip, en mikroperistaltisk pump och en odlingsmediereservoar. Med ett mikrofluidiskt system kan endotelceller stimuleras av hög luminal shear stress, fysiologiska nivån av transendotelial flöde och olika vaskulär endotel tillväxtfaktor fördelningar samtidigt.Pipett 20 mikroliter på 125 mikrogram per milliliter fibronectin i en mediainjektionsport i cellkulturkanalen. Klipp en pipettspets för att passa cellkulturkanalens port med sax. Sätt in pipettspetsen i den andra mediainjektionsporten i cellkulturkanalen.Sedan pipett ut luft från cellkultur kanal för att fylla den med fibronectin. Inkubera chipsen vid 37 grader Celsius i en timme. Före cellsådd, pipett 20 mikroliter endotelcellsmedium i varje mediainjektionsport och inkubera chipsen vid 37 grader Celsius i 30 minuter.Sedan pipett ut alla medier i alla media injektion portar. Därefter pipett fem mikroliter cellupphängning i en media injektion port av cell kultur kanal. Sedan spred sig endotelceller snabbt över hela kanalen under differentiellt hydrostatiskt tryck.Tillsätt ungefär fyra till sex mikroliter ECM-media till den andra porten för att justera det hydrostatiska trycket och stoppa cellens rörelse. Fjärrförslut chipsen till cellinkubatorn. Vänd sedan chipsen var 30: e minut tills endotelceller täcker runt cellkulturkanalens inre yta, två timmar senare.Använd pipettspetsen för att avlägsna bifogade celler i injektionsportarna mycket noggrant. Sätt sedan in fyra taggiga kvinnliga Luer-adaptrar i mediainjektionsportarna och fyll med ECM-media. Ta bort chipsen till cellinkubatorn, byt ECM-media och Luer-adaptrar var 12:e timme.För att montera det mikrofluidiska styrsystemet, förbered två polytetrafluoretylenrör, två korta silikonrör, tre långa silikonrör, en taggig kvinnlig Luer-adapter, en Y-typkontakt och sedan tre L-typkontakter. Fyll sprutan med 10 milliliter förvärmt ECM-medium. Anslut ett polytetrafluoretylenrör till sprutan med en taggig honadapter.Anslut sedan den andra änden av polytetrafluoretylenröret till en Y-typkontakt. Anslut sedan två långa silikonrör till de andra två ändarna av Y-typkontakt. Vi använder ett rör för att ansluta till reservoaren och det andra röret för att ansluta till bubbelfällschip.Anslut ett annat långt silikonrör till behållaren. Använd sedan två korta silikonrör för att ansluta alla inlopps- och utloppshål på det övre lagret av bubbelfällschip. Anslut ett polytetrafluoretylenrör till spånets backend.Fäst sedan en spruta på mikrosyringepumpen. Kläm in två långa silikonrör i den elektromagnetiska klämventilen. Byt sedan den elektromagnetiska klämventilen för att öppna rörledningen mellan sprutan och behållaren.Injicera media i behållaren med hjälp av mikrosyringspump till frånluft i röret. Byt sedan ventil igen för att öppna rörledningen mellan sprutan och bubbelfällschipet. Injicera media för att fylla vätskekammaren och backend-röret med bubbelfällschips.Ta ut endotelgroddschips från cellinkubatorn och ta sedan bort Luer-adaptrar på cellkultursidan. Sätt in två rörpluggar i hydrogelinsprutningsportarna i mikrofluidiskt spirande chip. Anslut backend-röret med bubbelfällschip till en port av cellkulturkanal.Sätt i en T-typkontakt till den andra porten och anslut den till långt silikonrör som är anslutet till behållaren. Fäst det långa silikonröret i mikroperistaltic pumpen. Sätt sedan in ett luftfilter i behållaren.Montera sedan det mikrofluidiska spirande chipet på scenens inkubator. Anslut sedan vakuumpumpen till hålen i det nedre lagret av bubbelfällschip med ett TPU-rör. Ställ in motsatt cirkulationsvolym och ett flöde i det anpassade programmet som styr mikrosyringepumpen och elektromagnetiska klämventilen samtidigt.Ställ sedan in flödeshastigheten för mikroperistaltisk pump. Slå på mikrosyringepumpen. Därefter upprättas cirkulationskontrollsystemet.Vi testar barriärfunktionen hos vissa mikrokärl i vår modell genom att mäta den diffusionella permeabilitetskoefficienten på 40 kDa F-I-T-C dextrin. Som det visas i figuren är den diffusionella permeabilitetskoefficienten för statiskt odlingschip med cellfoder 0,1 plus eller minus 0,3 mikrometer per sekund. Och den diffusionella permeabilitetskoefficienten för tom kanal utan cellfoder är 5,4 plus eller minus 0,7 mikrometer per sekund.Endotel spirande analys visade att endotelceller spirade in i den centrala hydrogelen till stor del efter 24 timmars statisk odling, medan graden av spirande minskade avsevärt med ökningen av luminal shear stress. Kvantitativt minskade luminal shear stress endotel spirande betydligt när det gäller groningsområde, genomsnittlig spirande längd och den längsta groddarlängden. Med vårt system kan savspänning på endotelceller eventuellt ändras när som helst under experimentet medan transendotelialflödet stannade på fysiologisk nivå.Denna in vitro 3D biomimetiska modell kan tillämpas direkt på studien av neovasulariseringsmekanismen och håller det potentiella löftet som en lågkostnadsplattform för läkemedelsscreening och toxikologiska applikationer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

Tri-lager electrospinning att efterlikna Native Arteriell arkitektur med Polycaprolactone, elastin och kollagen: en förstudie

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design av en cyklisk tryck Bioreaktor för Ex vivo Studie av Aorta hjärtklaffar

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Mikroflödessystem Chip Fabrication och metod för att upptäcka influensa

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

En mikroflödesteknik till probcell Deformationsklass

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

A Microfluidic Model of Biomimetically Breathing Pulmonary Acinar Airways

En mikroflödes Modell av Biomimetically Andning Pulmonell körtel Airways

Quantifying respiratory flow characteristics in the pulmonary acinar depths and how they influence inhaled aerosol transport is critical towards ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

Använda Lim Mönstring att konstruera 3D Paper Mikrofluidikanordningar

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikroflödes Flow Chambers Använda Beredd blod till modell Hemostas och trombocyttransfusion<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Multi-steg varierande höjd Fotolitografi för Ventilförsedda Multilayer Mikrofluidikanordningar

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Första utvärdering av antikropp-konjugat modifierad med Viral-derived peptider för att öka cellulära ackumulering och förbättra tumör inriktning

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...