Name: isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice
Uploaded: 2021-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice at JoVE.com

الكتاب ممتنون لكريستينا جوديو في المركز الوطني للبيوتكنوولوجيا في مدريد، إسبانيا، وماري غانتنر في معهد سكريبس للأبحاث، لا جولا، وأناستازيا كرالي في جامعة جونز هوبكنز، بالتيمور، للمساعدة في تحسين هذا البروتوكول على أساس العمل الأولي لكانوآخرون. تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح DK114785 و DK121196 إلى E.S.

يتبع هذا البروتوكول جميع المبادئ التوجيهية IACUC لمعهد سكريبس للبحوث وجامعة ويسكونسن – ماديسون كلية الطب والصحة العامة.
1. جمع وهضم المستودعات الدهنية (اليوم 1)
<ol><li>إعداد أنبوبين 1.5 مل لكل جرو: واحد للأنسجة الدهنية البنية (BAT) وواحد للأنسجة الدهنية البيضاء (WAT). إضافة 250 ميكرولت?...

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>McGarry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Banting+lecture+2001:+Dysregulation+of+fatty+acid+metabolism+in+the+etiology+of+type+2+diabetes.">Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes.</a> Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).</li><li>Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+adipose+tissue+in+the+treatment+of+obesity-associated+diabetes.">Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).</li><li>Waki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+molecule+harmine+is+an+antidiabetic+cell-type-specific+regulator+of+PPARgamma+expression.">The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression.</a> Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).</li><li>Dominguez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+phenotypic+and+activity-based+profiling+links+Ces3+to+obesity+and+diabetes.">Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes.</a> Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).</li><li>Galmozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThermoMouse:+an+in+vivo+model+to+identify+modulators+of+UCP1+expression+in+brown+adipose+tissue.">ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue.</a> Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV4+is+a+regulator+of+adipose+oxidative+metabolism,+inflammation,+and+energy+homeostasis.">TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis.</a> Cell. 151 (1), 96-110 (2012).</li><li>Lynes, M. D., Tseng, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+adipose+tissue+heterogeneity.">Deciphering adipose tissue heterogeneity.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1411 (1), 5-20 (2018).</li><li>Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+adipose+tissue+in+development+and+metabolic+function.">Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function.</a> Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958 (2018).</li><li>Sponton, C. H., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+roles+of+beige+fat+in+energy+homeostasis+beyond+UCP1.">Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1.</a> Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).</li><li>Gao, W., Kong, X., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+primary+culture,+and+differentiation+of+preadipocytes+from+mouse+brown+adipose+tissue.">Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).</li><li>Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+murine+primary+brown/beige+preadipocytes.">Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes.</a> Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).</li><li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+preadipocytes+from+rodent+white+adipose+tissue.">Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).</li><li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122 (1), 133-143 (2005).</li><li>Spalding, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fat+cell+turnover+in+humans.">Dynamics of fat cell turnover in humans.</a> Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).</li><li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+adipogenesis+during+white+adipose+tissue+development,+expansion+and+regeneration.">Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).</li><li>Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+brown+fat+preadipocytes.">Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes.</a> Sprotocols. , (2014).</li><li>Mills, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+succinate+controls+activation+of+adipose+tissue+thermogenesis.">Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis.</a> Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).</li><li>Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+and+beige+fat:+physiological+roles+beyond+heat+generation.">Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).</li><li>Pydi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+&#946;-arrestin-2+is+essential+for+maintaining+whole+body+glucose+and+energy+homeostasis.">Adipocyte &#946;-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis.</a> Nature Communications. 10 (1), 2936 (2019).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=snRNA-seq+reveals+a+subpopulation+of+adipocytes+that+regulates+thermogenesis.">snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis.</a> Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).</li><li>Galmozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGRMC2+is+an+intracellular+haem+chaperone+critical+for+adipocyte+function.">PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function.</a> Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).</li><li>Brown, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-related+receptors+mediate+the+adaptive+response+of+brown+adipose+tissue+to+adrenergic+stimulation.">Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation.</a> iScience. 2, 221-237 (2018).</li><li>Shinoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+functional+characterization+of+clonally+derived+adult+human+brown+adipocytes.">Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes.</a> Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).</li><li>Wang, Q. A., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AdipoChaser+mouse:+A+model+tracking+adipogenesis+in+vivo.">The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo.</a> Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).</li></ol>

الأنسجة الدهنية أمر بالغ الأهمية لحساسية الأنسولين الجهازية والجلوكوز التوازن20. يرتبط خلل الخلايا الدهنية المرتبطة بالسمنة ارتباطا وثيقا ببداية مرض السكري من النوع 2. لذلك ، قد يتيح الفهم الأكبر للبيولوجيا الأساسية وعلم وظائف الأعضاء للأنسجة الدهنية تصميم علاجات جديدة للا?...

السمنة تنتج عن اختلال مزمن بين استهلاك الطاقة والإنفاق على الطاقة. مع تطور السمنة ، تخضع الخلايا الدهنية البيضاء لتوسع هائل في حجم الخلية يؤدي إلى نقص الأكسيجة في البيئة الدقيقة ، وموت الخلايا ، والالتهاب ، ومقاومة الأنسولين1. مختلة, الخلايا الدهنية hypertrophied لا يمكن تخزين الدهون الزائدة بشكل صحيح, التي تتراكم بدلا من ذلك في الأنسجة الأخرى حيث أنها تضعف عمل الأنسولين2,3. من المتوقع أن تكون العوامل التي تحسن وظيفة الخلايا الدهنية وتعيد تقسيم الدهون الطبيعي بين الأنسجة مفيدة لعلاج الحالات المرتبطة بالسمنة التي تتميز بمقاومة الأنسولين مثل داء السكري من النوع 2. وقد أثبتت الشاشات Phenotypic في الخلايا الدهنية باستخدام خطوط الخلية الخالدة، مثل 3T3-L1، F442A، و 10T 1/2، مفيدة لتحديد العوامل الوراثية التي تنظم تولد الدهون وعزل الجزيئات المؤيدة للشحم مع خصائص مضادة للسكري4،5،6،7. هذه الخطوط الخلية، ومع ذلك، لا تعكس تماما عدم التجانس من أنواع الخلايا الموجودة في المستودعات الدهنية، والتي تشمل الأبيض والبني والبيج، وغيرها من الأنواع الفرعية adipocyte مع خصائص فريدة من نوعها، وكلها تسهم في التوازن الجهازي8،9،10. علاوة على ذلك ، غالبا ما تظهر خطوط الخلايا المثقفة استجابة متضائلة للمحفزات الخارجية.
في المقابل ، فإن ثقافات الخلايا الدهنية الأولية تلخص بشكل أكثر دقة تعقيد في تكوين الدهون في الجسم الحي ، وتظهر الخلايا الدهنية الأولية استجابات وظيفية قوية. عادة ما يتم عزل preadipocytes الأولية من كسر الأوعية الدموية سترومال من مستودعات الدهنية من الفئران البالغة11،12،13،14. ومع ذلك ، لأن المستودعات الدهنية للحيوانات البالغة تتكون في المقام الأول من الخلايا الدهنية الناضجة تماما التي لديها معدل دوران بطيء جدا15،16،17، فإن هذا النهج ينتج كمية محدودة من الخلايا السابقة للديئة بمعدل انتشار منخفض. لذلك ، من الأفضل عزل خلايا ما قبل الخلايا من الفئران حديثي الولادة للحصول على كميات كبيرة من الخلايا سريعة النمو التي يمكن تمييزها في المختبر. هنا، وقد وصف بروتوكول، مستوحاة من العمل الأولي مع الخلايا الدهنية البني الابتدائي من كانوآخرون. 18 لعزل بكفاءة كل من البيض والبني preadipocytes التي يمكن توسيعها وتمييزها في المختبر إلى الخلايا الدهنية الأولية تعمل بكامل طاقتها(الشكل 1A). ميزة عزل الخلايا الأولية عن حديثي الولادة ، بدلا من الفئران البالغة ، هي أن المستودعات الدهنية تنمو بسرعة وبالتالي فهي مصدر غني للخلايا المسبقة التكاثر بنشاط17. تتمتع الخلايا المعزولة باستخدام هذا البروتوكول بقدرة انتشار عالية ، مما يتيح التوسع السريع للثقافات. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر preadipocytes من الجراء حديثي الولادة إمكانات تمييز أعلى من السلف البالغين ، مما يقلل من التباين الجيد في مدى التمايز وبالتالي يزيد من القابلية للاستنساخ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdipoRed (Nile Red)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bioproducts LLC</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1&#160;&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td>For Bioenergetics studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose, Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid-Free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norepinephrine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>557368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>For Bioenergetics studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>T1317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triiodothyronine (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>642511</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice

وقد استفاد فهم الآليات الكامنة وراء التمايز adipocyte ووظيفة إلى حد كبير من استخدام خطوط خلايا preadipocyte البيضاء الخالدة. هذه خطوط الخلية المثقفة، ومع ذلك، لديها قيود. وهي لا تلتقط بشكل كامل الطيف الوظيفي المتنوع للسكان الخلايا الدهنية غير المتجانسة التي من المعروف الآن أن تكون موجودة داخل المستودعات الدهنية البيضاء. لتوفير نموذج أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية لدراسة تعقيد الأنسجة الدهنية البيضاء ، تم تطوير بروتوكول وتحسينه لتمكين العزل المتزامن لذريات الخلايا الدهنية البيضاء والبنية الأولية من الفئران حديثي الولادة ، وتوسعها السريع في الثقافة ، وتمايزها في المختبر إلى خلايا شحمية ناضجة تعمل بكامل طاقتها. الميزة الأساسية لعزل الخلايا الأولية عن الفئران الوليدة ، بدلا من الفئران البالغة ، هي أن المستودعات الدهنية تتطور بنشاط ، وبالتالي فهي مصدر غني للخلايا المسبقة التكاثر. تفرق الخلايا الأولية السابقة للبديهة المعزولة باستخدام هذا البروتوكول بسرعة عند الوصول إلى التقاء وتصبح ناضجة تماما في 4-5 أيام ، وهي نافذة زمنية تعكس بدقة مظهر منصات الدهون المتقدمة في الفئران حديثي الولادة. ويمكن توسيع الثقافات الأولية المعدة باستخدام هذه الاستراتيجية ودراسة مع استنساخ عالية، مما يجعلها مناسبة للشاشات الوراثية والفينوتيبيك وتمكين دراسة الأنماط الظاهرية للخلايا الدهنية المستقلة من نماذج الماوس الوراثية. يقدم هذا البروتوكول نهجا بسيطا وسريعا وغير مكلف لدراسة تعقيد الأنسجة الدهنية في المختبر.

وسيسفر القسم 1 من البروتوكول عن تعليق غير متجانس للخلايا المرئية تحت المجهر الخفيف القياسي. تصفية الأنسجة المهضومة مع مصفاة الخلية (القسم 2) سوف يزيل الأنسجة غير المهضومة. ومع ذلك، فإن بعض الحطام الخلوي، وخلايا الدم، وخلايا الشحمية ناضجة تمر من خلال (الشكل 1C</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice at JoVE.com

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

يصف هذا التقرير بروتوكولا للعزل المتزامن للخلايا الأولية قبل الخلايا البنية والبيضاء من الفئران حديثي الولادة. يمكن زراعة الخلايا المعزولة في الثقافة وتحث على التفريق إلى خلايا بيضاء وبنية ناضجة تماما. تمكن هذه الطريقة من التوصيف الوراثي والجزيئي والوظيفي للخلايا الدهنية الأولية في الثقافة.

عزل وتمايز الخلايا التمهيدية الأولية البيضاء والبنية من الفئران حديثي الولادة

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

يوفر هذا البروتوكول استراتيجية بسيطة لتوليد نماذج ثقافية للخلايا من الخلايا الدهنية البيضاء والبنية التي تلخص بأمانة في المختبر ، فسيولوجيا الأنسجة الدهنية التي لدينا في الجسم الحي. يتيح هذا البروتوكول العزل المتزامن لكل من الخلايا التمهيدية البيضاء والبنية من الفئران حديثي الولادة والخلايا التي نعزلها باستخدام هذه الطريقة لتقييم القدرة التكاثرية العالية وإمكانات التمايز. تعكس الخلايا المعزولة باستخدام هذا النهج تعقيد الأنسجة الدهنية بشكل أفضل من نماذج الثقافة الأخرى.ويمكن استخدامه لدراسة وظيفة الخلايا الدهنية بشكل أكثر دقة في السمنة والسكري. نحن نركز في المقام الأول على فهم خلل الأنسجة الدهنية في السمنة. ومع ذلك، يمكن أيضا استخدام الخلايا المعدة بهذه الطريقة لدراسة الأسئلة الأساسية حول الخلية في علم الأحياء التنموي.مفتاح تجربة ناجحة هو تحديد كيفية تحديد المستودعات الدهنية البيضاء مثل هذه المستودعات ، والتي هي صغيرة ، ولكنها غنية جدا وتكاثر preadipocytes يمكن أن يكون من الصعب التمييز في الجراء. توضح العرض البصري مدى بساطة هذا البروتوكول وتسمح بتوفير نصائح لتحديد وتشريح المستودعات الدهنية البيضاء والبنية. رؤية عزلة المستودع مفيدة للغاية.لجمع الأنسجة الدهنية البيضاء تحت الجلد، وقطع الجلد حول البطن من الجرو حديثي الولادة القتل الرحيم، وسحب الجلد بلطف تحت الساقين. دون جمع أي أنسجة الجلد، وحصاد بعناية مستودع الدهون، والتي سوف تظهر على شكل واضح أو أبيض، رقيقة ممدود الأنسجة تعلق على داخل الجلد أو على رأس quadriceps. شطف مستودع حصادها في برنامج تلفزيوني ووضع الأنسجة الدهنية في أنبوب 1.5 ملليلتر تحتوي على 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني و 200 ميكرولتر من العازلة العزل 2X على الجليد.لجمع الأنسجة الدهنية البنية بين الكتفين، اسحب الجلد من شفرات الكتف فوق الرأس وارفع الأنسجة الدهنية البنية الحمراء العميقة الموجودة بين شفرات الكتف. إجراء شقوق بعناية في جميع أنحاء الدهنية لفصله عن الجسم والتحقق من الأنسجة للاتساق واللون. بعد الشطف، ضع الأنسجة في أنبوب ثاني 1.5 ملليلتر يحتوي على 250 ميكرولتر من PBS و 200 ميكرولتر من العازلة العزلة 2X على الجليد.عندما يتم جمع جميع المستودعات، استخدم مقص لفرم بلطف كل مستودع أربع إلى ست مرات مباشرة داخل الأنابيب وإضافة 50 ميكرولتر من الكولاجينز 10X في العازلة العزلة 2X إلى كل أنبوب. ثم عكس الأنابيب بسرعة لخلط ووضع الأنسجة في خلاط درجة الحرارة التي تسيطر عليها لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية و 1400 الثورات في الدقيقة الواحدة. في نهاية عملية الهضم، ضع الأنابيب مرة أخرى على الجليد وتصفية الأنسجة الهضمية من خلال 100 مصفاة خلية ميكرون في أنابيب جديدة 50 ملليلتر.لتحقيق أقصى قدر من إنتاجية الخلية، شطف كل أنبوب مع ملليلتر واحد من العزلة المتوسطة وتصفية هذا الغسيل من خلال مصفاة. تمييع حلول الأنسجة الدهنية البني والأبيض إلى ملليلترين من تعليق الأنسجة لكل بئر لكل مستودع في وسط عزل جديد. ثم لوحة اثنين من ملليلتر من تعليق الأنسجة الدهنية البيضاء إلى كل من أربعة إلى ستة آبار واثنين من ملليلتر من تعليق الأنسجة الدهنية البني إلى كل بئر من اثنين إلى ثلاثة آبار من لوحة بئر ستة من خلال مرشح واحد 100 ميكرون لكل بئر.عندما تكون جميع الخلايا مطلية، ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 60 إلى 90 دقيقة. في نهاية الحضانة، اغسل كل بئر بميليلترين من المتوسط الخالي من المصل وحرض الطبق برفق لفصل أي خلايا دم من قاع الآبار. بعد ثلاث يغسل، إضافة اثنين من ملليلتر من العزلة المتوسطة الطازجة إلى الآبار والعودة لوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية.عندما تصل الخلايا إلى 80 إلى 90٪ التقاء، معطف لوحات الوجهة الجديدة مع عقيمة 0.1٪ الجيلاتين في الماء المقطر في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. في حين أن لوحات هي حضانة, غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني قبل العلاج مع تريبسين لمدة ثلاث دقائق في حاضنة ثقافة الخلية. عندما تكون الخلايا قد انفصلت، ماصة تعليق الخلية عدة مرات لتحقيق أقصى قدر من استعادة الخلية ونقل الخلايا إلى أنبوب جديد.عندما يتم جمع جميع الخلايا، اغسل كل بئر بميليلتر واحد من وسيط العزل واسحب الغسيل مع تعليق الخلية. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة إنفاق بيليه في ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من العزلة المتوسطة للعد. تمييع الخلايا إلى التركيز المناسب للطلاء في عزلة جديدة المتوسطة وغسل لوحات الجيلاتين المغلفة مع برنامج تلفزيوني لإزالة أي الجيلاتين الزائدة.ثم بذر الخلايا على لوحات الجيلاتين المغلفة والعودة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية. عندما تصل الخلايا إلى التقاء، استبدال وسيط العزلة مع وسيطة التمايز. إذا كان التمييز بين الخلايا الدهنية البنية preadipocytes، إضافة أيضا واحدة ثلاثية الكائنات النانوية triiodothyronine.بعد 48 ساعة، قم بتحديث الوسط مع الحجم المناسب من الصيانة المتوسطة لكل ثقافة. في هذا الوقت ، يجب أن يصبح تراكم قطرات السائل الصغيرة داخل الخلايا مرئيا تحت المجهر الميداني الساطع. حتى بعد التصفية، تبقى بعض الحطام الخلوي وخلايا الدم داخل تعليق الخلية.يغسل لطيف بعد ساعة واحدة من الطلاء سوف إزالة الخلايا غير ذات الصلة كما تعلق preadipocytes بسرعة إلى الجزء السفلي من البئر. على الرغم من أن كل من الخلايا التمهيدية البيضاء والبنية المعزولة عن الجراء حديثي الولادة لديها قدرة انتشار عالية ، فإن غلة الخلايا التمهيدية البيضاء عادة ضعف ما هي عليه في الخلايا المسبقة البنية على أساس كل مستودع. لذلك ، إذا رغبت الثقافات المتزامنة ، يجب حساب كثافة البدء هذه من preadipocytes البيضاء وفقا لذلك.في نهاية التمايز ، ستظهر الخلايا محملة بقطرات الدهون وستعبر عن علامات كلاسيكية من الخلايا الدهنية البيضاء والبنية ، على التوالي. في هذا التحليل المقارن لاستهلاك الأكسجين في اختبار الإجهاد الميتوكوندريا للخلايا الدهنية البيضاء والبنية الأولية في ظل ظروف القاعدية ، وكذلك استجابة للمحفزات المعروفة لوظيفة الميتوكوندريا ، يمكن ملاحظة هذه القدرات الحيوية المحددة من كل نوع من أنواع الخلايا. تذكر أننا نعزل الخلايا الحية وأننا نريد استزراعها لعدة أيام.لذا تأكد من الحفاظ على ظروف معقمة أثناء العزل لتجنب التلوث ، مما قد يعرض الثقافة اللاحقة للخطر. هذه الطريقة يولد adipocytes ناضجة تماما التي يمكن استخدامها لتطبيقات مختلفة، بما في ذلك المقايسات الوظيفية، والشاشات الوراثية أو الكيميائية، أو التنميط omics لدراسة آليات مستقلة الخلية التي تؤثر على وظيفة adipocyte.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

الثقافة الأولية من الخلايا العصبية قرن آمون من الفئران حديثي الولادة P0

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

عزل الخلايا المناعية من الأورام الأولية

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

السذاجة الكبار الخلايا الجذعية عزل من المرحلة الابتدائية الثقافات الخلايا الليفية الإنسان

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

التفريق بين الأطفال حديثي الولادة ماوس خلايا الجلد الجذعية المشتقة في مثل جرثومة خلايا<em&gt; في المختبر</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

عزل Myofibroblasts الابتدائية من ماوس والأنسجة البشرية القولون

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

عزل وثقافة الكرياتينية الماوس الرئيسية من حديثي الولادة والفأر الكبار الجلد

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

عزل وتوصيف والتفريق في القلب من الخلايا الجذعية من قلب الماوس الكبار

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

العزلة ، تنقيه ، والتمايز من السلائف العظمية من نخاع العظم الفئران

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

عزل وثقافة الخلايا البطانية الأبهرية الأولية من الخنازير المصغرة

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Unveiling Inflammatory Arthritis&#58; Exploring Functions of Synovial Cells

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue (Video) | JoVE 

عزل وثقافة البلاعم الزليلية الأولية والخلايا الليفية من أنسجة التهاب المفاصل الفئران

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...