Name: isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice
Uploaded: 2021-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice at JoVE.com

Forfatterne er taknemmelige for Cristina Godio på Centro Nacional de Biotecnología i Madrid, Spanien, Mari Gantner på The Scripps Research Institute, La Jolla, og Anastasia Kralli på Johns Hopkins University, Baltimore, for at få hjælp til at optimere denne protokol baseret på det første arbejde Kahn et al.18. Dette arbejde blev finansieret af NIH grants DK114785 og DK121196 til E.S.

Denne protokol følger alle IACUC's retningslinjer fra The Scripps Research Institute og University of Wisconsin – Madison School of Medicine and Public Health.
1. Indsamling og fordøjelse af fedtdepoter (dag 1)
<ol><li>Forbered to 1,5 mL rør til hver hvalp: en til brunt fedtvæv (BAT) og et til hvidt fedtvæv (WAT). Der tilsættes 250 μL fosfatstødpudesum (PBS) + 200 μL 2x isolationsbuffer (123 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM CaCl2,5 mM glukose, 100 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piper...

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>McGarry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Banting+lecture+2001:+Dysregulation+of+fatty+acid+metabolism+in+the+etiology+of+type+2+diabetes.">Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes.</a> Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).</li><li>Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+adipose+tissue+in+the+treatment+of+obesity-associated+diabetes.">Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).</li><li>Waki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+molecule+harmine+is+an+antidiabetic+cell-type-specific+regulator+of+PPARgamma+expression.">The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression.</a> Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).</li><li>Dominguez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+phenotypic+and+activity-based+profiling+links+Ces3+to+obesity+and+diabetes.">Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes.</a> Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).</li><li>Galmozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThermoMouse:+an+in+vivo+model+to+identify+modulators+of+UCP1+expression+in+brown+adipose+tissue.">ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue.</a> Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV4+is+a+regulator+of+adipose+oxidative+metabolism,+inflammation,+and+energy+homeostasis.">TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis.</a> Cell. 151 (1), 96-110 (2012).</li><li>Lynes, M. D., Tseng, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+adipose+tissue+heterogeneity.">Deciphering adipose tissue heterogeneity.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1411 (1), 5-20 (2018).</li><li>Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+adipose+tissue+in+development+and+metabolic+function.">Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function.</a> Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958 (2018).</li><li>Sponton, C. H., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+roles+of+beige+fat+in+energy+homeostasis+beyond+UCP1.">Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1.</a> Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).</li><li>Gao, W., Kong, X., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+primary+culture,+and+differentiation+of+preadipocytes+from+mouse+brown+adipose+tissue.">Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).</li><li>Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+murine+primary+brown/beige+preadipocytes.">Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes.</a> Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).</li><li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+preadipocytes+from+rodent+white+adipose+tissue.">Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).</li><li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122 (1), 133-143 (2005).</li><li>Spalding, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fat+cell+turnover+in+humans.">Dynamics of fat cell turnover in humans.</a> Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).</li><li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+adipogenesis+during+white+adipose+tissue+development,+expansion+and+regeneration.">Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).</li><li>Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+brown+fat+preadipocytes.">Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes.</a> Sprotocols. , (2014).</li><li>Mills, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+succinate+controls+activation+of+adipose+tissue+thermogenesis.">Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis.</a> Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).</li><li>Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+and+beige+fat:+physiological+roles+beyond+heat+generation.">Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).</li><li>Pydi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+&#946;-arrestin-2+is+essential+for+maintaining+whole+body+glucose+and+energy+homeostasis.">Adipocyte &#946;-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis.</a> Nature Communications. 10 (1), 2936 (2019).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=snRNA-seq+reveals+a+subpopulation+of+adipocytes+that+regulates+thermogenesis.">snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis.</a> Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).</li><li>Galmozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGRMC2+is+an+intracellular+haem+chaperone+critical+for+adipocyte+function.">PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function.</a> Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).</li><li>Brown, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-related+receptors+mediate+the+adaptive+response+of+brown+adipose+tissue+to+adrenergic+stimulation.">Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation.</a> iScience. 2, 221-237 (2018).</li><li>Shinoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+functional+characterization+of+clonally+derived+adult+human+brown+adipocytes.">Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes.</a> Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).</li><li>Wang, Q. A., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AdipoChaser+mouse:+A+model+tracking+adipogenesis+in+vivo.">The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo.</a> Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).</li></ol>

Fedtvæv er afgørende for systemisk insulinfølsomhed og glukosehomøostase20. Fedme-forbundet adipocyt dysfunktion er tæt forbundet med starten af type 2 diabetes. Derfor kan større forståelse af den grundlæggende biologi og fysiologi af fedtvæv gøre det muligt at designe nye behandlinger for metaboliske lidelser. Som et supplement til direkte funktionel og transskriptionel analyse af modne adipocytter isoleret fra fedtdepoter21,22...

Fedme skyldes en kronisk ubalance mellem energiindtag og energiforbrug. Efterhånden som fedme udvikler sig, gennemgår hvide adipocytter en massiv udvidelse i cellestørrelse, der resulterer i hypoxi i mikromiljøet, celledød, betændelse og insulinresistens1. Dysfunktionelle, hypertrophied adipocytter kan ikke korrekt gemme overskydende lipider, som i stedet akkumuleres i andre væv, hvor de dæmper insulinvirkning2,3. Midler, der forbedrer adipocytfunktionen og genopretter normal lipidpartition mellem væv, forventes at være gavnlige for behandlingen af fedmerelaterede tilstande karakteriseret ved insulinresistens som type 2-diabetes. Fænotypiske skærme i adipocytter ved hjælp af udødeliggjorte cellelinjer, såsom 3T3-L1, F442A og 10T 1/2, har vist sig nyttige til at identificere genetiske faktorer, der regulerer adipogenesis og til at isolere pro-adipogene molekyler med anti-diabetiske egenskaber4,5,6,7. Disse cellelinjer afspejler imidlertid ikke fuldt ud heterogeniteten af celletyper, der findes i fedtdepoter, som omfatter hvide, brune, beige og andre adipocytundertyper med unikke egenskaber, som alle bidrager til systemisk homøostase8,9,10. Desuden viser kultiverede cellelinjer ofte en formindsket reaktion på eksterne stimuli.
I modsætning hertil opsummerer kulturer af primære adipocytter mere præcist kompleksiteten af in vivo adipogenesis, og primære adipocytter viser robuste funktionelle reaktioner. Primære præadipocytter er typisk isoleret fra den strøgmale vaskulære fraktion af fedtdepoter af voksne mus11,12,13,14. Da de adiposedepoter for voksne dyr imidlertid primært består af fuldt modne adipocytter, der har en meget langsom omsætningshastighedpå 15,16,17, giver denne tilgang en begrænset mængde præadipocytter med en lav spredningsrate. Derfor er isolering af præadipocytter fra nyfødte mus at foretrække at opnå store mængder hurtigt voksende celler, der kan differentieres in vitro. Her er en protokol blevet beskrevet, inspireret af det indledende arbejde med primære brune adipocytter af Kahn et al.18 til effektivt at isolere både hvide og brune præadipocytter, der kan udvides og differentieres in vitro til fuldt funktionelle primære adipocytter (Figur 1A). Fordelen ved at isolere primærceller fra nyfødte, i modsætning til voksne mus, er, at fedtdepoterne vokser hurtigt og dermed er en rig kilde til aktivt at sprede præadipocytter17. Celler isoleret ved hjælp af denne protokol har høj proliferativ kapacitet, hvilket muliggør hurtig opskalering af kulturer. Derudover udviser præadipocytter fra nyfødte hvalpe et højere differentieringspotentiale end voksne forfædre, hvilket reducerer variationen fra godt til godt i graden af differentiering og dermed øger reproducerbarheden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdipoRed (Nile Red)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bioproducts LLC</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1&#160;&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td>For Bioenergetics studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose, Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid-Free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norepinephrine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>557368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>For Bioenergetics studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>T1317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triiodothyronine (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>642511</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice

Forståelsen af de mekanismer, der ligger til grund for adipocyt differentiering og funktion har i høj grad nydt godt af brugen af udødeliggjorte hvide preadipocyt cellelinjer. Disse kultiverede cellelinjer har dog begrænsninger. De fanger ikke fuldt ud det forskelligartede funktionelle spektrum af de heterogene adipocytpopulationer, der nu er kendt for at eksistere inden for hvide fedtdepoter. For at give en mere fysiologisk relevant model til at studere kompleksiteten af hvidt fedtvæv er der udviklet og optimeret en protokol for at muliggøre samtidig isolering af primære hvide og brune adipocyt forfædre fra nyfødte mus, deres hurtige ekspansion i kulturen og deres differentiering in vitro til modne, fuldt funktionelle adipocytter. Den primære fordel ved at isolere primærceller fra nyfødte snarere end voksne mus er, at fedtdepoterne aktivt udvikler sig og derfor er en rig kilde til prolifererende præadipocytter. Primære præadipocytter isoleret ved hjælp af denne protokol differentierer hurtigt ved at nå sammenløb og bliver fuldt modne om 4-5 dage, et tidsvindue, der nøjagtigt afspejler udseendet af udviklede fedtpuder hos nyfødte mus. Primære kulturer, der er udarbejdet ved hjælp af denne strategi, kan udvides og studeres med høj reproducerbarhed, hvilket gør dem velegnede til genetiske og fænotypiske skærme og gør det muligt at studere de celleuafhæmodige adipocyt-fænotyper af genetiske musemodeller. Denne protokol tilbyder en enkel, hurtig og billig tilgang til at studere kompleksiteten af fedtvæv in vitro.

Afsnit 1 i protokollen vil give en heterogen suspension af celler, der er synlige under en standard lys mikroskop. Filtrering af fordøjet væv med en celle si (afsnit 2) vil fjerne ufordøjet væv. Men nogle cellulære vragrester, blodlegemer, og modne adipocytter vil passere igennem (Figur 1C). Skånsom vask 1 time efter plating vil fjerne ikke-relevante celler som præadipocytter tillægger hurtigt til bunden af brønden (Figur 1C</str...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice at JoVE.com

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

Denne rapport beskriver en protokol for samtidig isolering af primære brune og hvide præadipocytter fra nyfødte mus. Isolerede celler kan dyrkes i kultur og induceres til at differentiere sig til fuldt modne hvide og brune adipocytter. Metoden muliggør genetisk, molekylær og funktionel karakterisering af primære fedtceller i kulturen.

Isolation og differentiering af primære hvide og brune præadipocytter fra nyfødte mus

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Denne protokol giver en enkel strategi for at generere cellekulturelle modeller af hvide og brune adipocytter, der trofast opsummerer in vitro, fysiologien af det fedtvæv, vi har in vivo. Denne protokol muliggør samtidig isolering af både hvide og brune præadipocytter fra nyfødte mus, og de celler, vi isolerer ved hjælp af denne metode, vurderer høj proliferativ kapacitet og differentieringspotentiale. Celler isoleret ved hjælp af denne tilgang afspejler kompleksiteten af fedtvæv bedre end andre kulturmodeller.Og det kan bruges til mere præcist at studere adipocytfunktion i fedme og diabetes. Vi fokuserer primært på at forstå fedtvæv dysfunktion i fedme. Celler, der er udarbejdet med denne metode, kan dog også bruges til at studere grundlæggende spørgsmål om celle i udviklingsbiologi.Nøglen til et vellykket eksperiment er at bestemme, hvordan man identificerer de hvide fedtdepoter, da disse depoter, som er små, men meget rige og formerende præadipocytter, kan være vanskelige at skelne hos hvalpe. Visuel demonstration illustrerer, hvor enkel denne protokol er, og giver mulighed for at give tips til at lokalisere og dissekere de hvide og brune fedtdepoter. At se depotets isolation er meget nyttigt.For at indsamle subkutant hvidt fedtvæv skal du skære huden omkring maven på en aflivet nyfødt hvalp og forsigtigt trække huden under benene. Uden at indsamle hudvæv skal du omhyggeligt høste fedtdepotet, der vises som et klart eller hvidt, tyndt langstrakt væv fastgjort til indersiden af huden eller oven på quadriceps. Det høstede depot skylles i PBS, og fedtvævet anbringes i et 1,5 milliliter rør, der indeholder 250 mikroliter PBS og 200 mikroliter 2X isolationsbuffer på is.For at indsamle interscapular brun fedtvæv, trække huden fra skulderbladene over hovedet og løfte den dybe røde brune fedtvæv placeret mellem skulderbladene. Omhyggeligt gøre snit hele vejen rundt om fedt til at løsne det fra kroppen og kontrollere væv for konsistens og farve. Efter skylning anbringes vævet i et andet 1,5 milliliterrør, der indeholder 250 mikroliter PBS og 200 mikroliter 2X isolationsbuffer på is.Når alle depoterne er blevet indsamlet, skal du bruge en saks til forsigtigt at hakke hvert depot fire til seks gange direkte inde i rørene og tilsæt 50 mikroliter af 10X collagenase i 2X isolationsbuffer til hvert rør. Vend derefter rørene hurtigt for at blande og placere vævene i en temperaturstyret mixer i 30 minutter ved 37 grader Celsius og 1400 omdrejninger i minuttet. I slutningen af fordøjelsen skal rørene placeres tilbage på is og filtrere fordøjelsesvævet gennem 100 mikron cellesienner i nye 50 milliliter rør.For at maksimere celleudbyttet skal du skylle hvert rør med en milliliter isolationsmedium og filtrere denne vask gennem sien. De brune og hvide fedtvævsopløsninger fortyndes til to milliliter vævsaffjedring pr. brønd pr. depot i frisk isolationsmedium. Derefter plade to milliliter hvid fedtvæv suspension til hver af fire til seks brønde og to milliliter brun fedtvæv suspension til hver af to til tre brønde af en seks godt plade gennem en 100 mikron filter per brønd.Når alle cellerne er blevet belagt, skal du placere pladen i cellekulturinkubatoren i 60 til 90 minutter. I slutningen af inkubationen vaskes hver brønd med to milliliter serumfrit medium og omrører forsigtigt pladen for at løsne blodceller fra bunden af brøndene. Efter tre vaske tilsættes to milliliter frisk isoleringsmedium til brøndene og returneres pladen til cellekulturinkubatoren.Når cellerne når 80 til 90%sammenløb, pels nye destinationsplader med steril 0,1%gelatine i destilleret vand ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Mens pladerne inkuberer, vaskes cellerne med PBS, før de behandles med trypsin i tre minutter i cellekulturinkubatoren. Når cellerne er løsrevet, pipette cellen suspension flere gange for at maksimere cellegendannelse og overføre cellerne til et nyt rør.Når alle cellerne er blevet indsamlet, vask hver brønd med en milliliter isolation medium og træk vasker med celle suspension. Cellerne opsamles ved centrifugering, og pelletpenussen opsamles i tre til fem milliliter isolationsmedium til optælling. Cellerne fortyndes til den relevante koncentration til plating i frisk isolering medium og vask gelatine belagt plader med PBS for at fjerne overskydende gelatine.Så frø cellerne på gelatine belagt plader og returnere cellerne til cellekulturen inkubator. Når cellerne når sammenløb, skal du erstatte isolationsmediet med differentieringsmedium. Hvis differentiere brun fedtvæv præadipocytter, også tilføje en nanomolar triiodothyronine.Efter 48 timer skal mediet opdateres med den passende mængde vedligeholdelsesmedium pr. Kultur. På dette tidspunkt skal akkumulering af små væskedråber i cellerne blive synlig under lysfeltmikroskopi. Selv efter filtrering forbliver nogle cellulære rester og blodlegemer inden for cellesuspensionen.Blide vasker en time efter plating vil fjerne ikke-relevante celler som præadipocytter tillægger hurtigt til bunden af brønden. Selv om både hvide og brune præadipocytter isoleret fra nyfødte unger har en høj proliferativ kapacitet, er udbyttet af hvide præadipocytter generelt dobbelt så stort som for brune præadipocytter pr. depot. Hvis der ønskes synkroniserede kulturer, skal denne starttæthed af de hvide præadipocytter derfor beregnes i overensstemmelse hermed.I slutningen af differentieringen ser cellerne ud til at være fyldt med lipiddråber og vil udtrykke klassiske markører for henholdsvis hvide og brune adipocytter. I denne komparative analyse af iltforbruget i en mitokondriestresstest af primære hvide og brune adipocytter under basale forhold samt som reaktion på kendte stimulatorer af mitokondriefunktion kan denne specifikke bioenergetiske kapacitet for hver celletype observeres. Husk, at vi isolerer levende celler, og at vi ønsker at dyrke dem i flere dage.Så sørg for at opretholde sterile forhold under isolationen for at undgå forurening, hvilket kan kompromittere den efterfølgende kultur. Denne metode genererer fuldt modne adipocytter, der kan bruges til forskellige applikationer, herunder funktionelle assays, genetiske eller kemiske skærme, eller omics profilering til at studere celle-autonome mekanismer, der påvirker adipocyt funktion.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naive voksne stamceller Isolering fra primære humane fibroblastkulturer

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiering af Nyfødte musehud afledt stamceller i Germ-lignende celler<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolering af Primære myofibroblasts fra mus og Human tyktarmsvæv

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolering og kultur af primære muskeratinocytter fra neonatal og voksen mus hud

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolation, karakterisering og differentiering af Cardiac stamceller fra voksne mus hjerte

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Isolering, rensning og differentiering af Osteoklastprækursorer fra rotte knoglemarv

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Isolation og kultur af primære aorta endotelceller fra miniature grise

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Unveiling Inflammatory Arthritis&#58; Exploring Functions of Synovial Cells

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue (Video) | JoVE 

Isolering og dyrkning af primære synoviale makrofager og fibroblaster fra murine arthritisvæv

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...