Name: isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice
Uploaded: 2021-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice at JoVE.com

De auteurs zijn Cristina Godio van het Centro Nacional de Biotecnología in Madrid, Spanje, Mari Gantner van het Scripps Research Institute, La Jolla en Anastasia Kralli van de Johns Hopkins University in Baltimore dankbaar voor hun hulp bij het optimaliseren van dit protocol op basis van het eerste werk van Kahn et al.18. Dit werk werd gefinancierd door NIH-subsidies DK114785 en DK121196 aan E.S.

Dit protocol volgt alle IACUC-richtlijnen van het Scripps Research Institute en de University of Wisconsin – Madison School of Medicine and Public Health.
1. Inzameling en vergisting van vetdepots (dag 1)
<ol><li>Bereid twee buizen van 1,5 ml voor elke pup: één voor bruin vetweefsel (BBT) en één voor wit vetweefsel (WAT). Voeg 250 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) + 200 μL 2x isolatiebuffer (123 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM CaCl2,5 mM glucose, 100 mM 4-(2-hydroxyethyl)...

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>McGarry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Banting+lecture+2001:+Dysregulation+of+fatty+acid+metabolism+in+the+etiology+of+type+2+diabetes.">Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes.</a> Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).</li><li>Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+adipose+tissue+in+the+treatment+of+obesity-associated+diabetes.">Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).</li><li>Waki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+molecule+harmine+is+an+antidiabetic+cell-type-specific+regulator+of+PPARgamma+expression.">The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression.</a> Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).</li><li>Dominguez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+phenotypic+and+activity-based+profiling+links+Ces3+to+obesity+and+diabetes.">Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes.</a> Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).</li><li>Galmozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThermoMouse:+an+in+vivo+model+to+identify+modulators+of+UCP1+expression+in+brown+adipose+tissue.">ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue.</a> Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV4+is+a+regulator+of+adipose+oxidative+metabolism,+inflammation,+and+energy+homeostasis.">TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis.</a> Cell. 151 (1), 96-110 (2012).</li><li>Lynes, M. D., Tseng, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+adipose+tissue+heterogeneity.">Deciphering adipose tissue heterogeneity.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1411 (1), 5-20 (2018).</li><li>Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+adipose+tissue+in+development+and+metabolic+function.">Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function.</a> Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958 (2018).</li><li>Sponton, C. H., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+roles+of+beige+fat+in+energy+homeostasis+beyond+UCP1.">Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1.</a> Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).</li><li>Gao, W., Kong, X., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+primary+culture,+and+differentiation+of+preadipocytes+from+mouse+brown+adipose+tissue.">Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).</li><li>Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+murine+primary+brown/beige+preadipocytes.">Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes.</a> Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).</li><li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+preadipocytes+from+rodent+white+adipose+tissue.">Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).</li><li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122 (1), 133-143 (2005).</li><li>Spalding, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fat+cell+turnover+in+humans.">Dynamics of fat cell turnover in humans.</a> Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).</li><li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+adipogenesis+during+white+adipose+tissue+development,+expansion+and+regeneration.">Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).</li><li>Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+brown+fat+preadipocytes.">Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes.</a> Sprotocols. , (2014).</li><li>Mills, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+succinate+controls+activation+of+adipose+tissue+thermogenesis.">Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis.</a> Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).</li><li>Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+and+beige+fat:+physiological+roles+beyond+heat+generation.">Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).</li><li>Pydi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+&#946;-arrestin-2+is+essential+for+maintaining+whole+body+glucose+and+energy+homeostasis.">Adipocyte &#946;-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis.</a> Nature Communications. 10 (1), 2936 (2019).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=snRNA-seq+reveals+a+subpopulation+of+adipocytes+that+regulates+thermogenesis.">snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis.</a> Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).</li><li>Galmozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGRMC2+is+an+intracellular+haem+chaperone+critical+for+adipocyte+function.">PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function.</a> Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).</li><li>Brown, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-related+receptors+mediate+the+adaptive+response+of+brown+adipose+tissue+to+adrenergic+stimulation.">Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation.</a> iScience. 2, 221-237 (2018).</li><li>Shinoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+functional+characterization+of+clonally+derived+adult+human+brown+adipocytes.">Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes.</a> Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).</li><li>Wang, Q. A., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AdipoChaser+mouse:+A+model+tracking+adipogenesis+in+vivo.">The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo.</a> Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).</li></ol>

Vetweefsel is van cruciaal belang voor systemische insulinegevoeligheid en glucosehomeostase20. Obesitas-gebonden adipocyt dysfunctie is nauw geassocieerd met het begin van type 2 diabetes. Daarom kan een beter begrip van de basisbiologie en fysiologie van vetweefsel het ontwerp van nieuwe behandelingen voor metabole aandoeningen mogelijk maken. Als aanvulling op directe functionele en transcriptieanalyse van volwassen adipocyten geïsoleerd uit vetdepots21,<sup ...

Obesitas is het gevolg van een chronische onbalans tussen energie-inname en energieverbruik. Naarmate obesitas zich ontwikkelt, ondergaan witte adipocyten een enorme toename van de celgrootte die resulteert in hypoxie in het micromilieu, celdood, ontsteking en insulineresistentie1. Disfunctionele, hypertrofie adipocyten kunnen overtollige lipiden niet goed opslaan, die zich in plaats daarvan ophopen in andere weefsels waar ze insulinewerking dempen2,3. Middelen die de adipocytfunctie verbeteren en de normale lipidenpartitie tussen weefsels herstellen, worden voorspeld dat ze gunstig zijn voor de behandeling van obesitasgerelateerde aandoeningen die worden gekenmerkt door insulineresistentie zoals diabetes type 2. Fenotypische schermen in adipocyten met behulp van vereeuwigde cellijnen, zoals 3T3-L1, F442A en 10T 1/2, zijn nuttig gebleken om genetische factoren te identificeren die adipogenese reguleren en om pro-adipogenic moleculen te isoleren met antidiabetische eigenschappen4,5,6,7. Deze cellijnen weerspiegelen echter niet volledig de heterogeniteit van celtypen die aanwezig zijn in vetdepots, waaronder witte, bruine, beige en andere adipocytsubtypen met unieke kenmerken, die allemaal bijdragen aan systemische homeostase8,9,10. Verder vertonen gekweekte cellijnen vaak een verminderde reactie op externe stimuli.
Culturen van primaire adipocyten daarentegen vatten de complexiteit van in vivo adipogenese nauwkeuriger samen en primaire adipocyten vertonen robuuste functionele reacties. Primaire preadipocyten zijn meestal geïsoleerd uit de stromale vasculaire fractie van vetdepots van volwassen muizen11,12,13,14. Omdat de vetdepots van volwassen dieren echter voornamelijk bestaan uit volgroeide adipocyten met een zeer trage omloopsnelheidvan 15,16,17, levert deze aanpak een beperkte hoeveelheid preadipocyten op met een lage proliferatiesnelheid. Daarom heeft isolatie van preadipocyten van pasgeboren muizen de voorkeur om grote hoeveelheden snelgroeiende cellen te verkrijgen die in vitro kunnen worden onderscheiden. Hier is een protocol beschreven, geïnspireerd op het eerste werk met primaire bruine adipocyten van Kahn et al.18 om zowel witte als bruine preadipocyten efficiënt te isoleren die in vitro kunnen worden uitgebreid en gedifferentieerd tot volledig functionele primaire adipocyten (Figuur 1A). Het voordeel van het isoleren van primaire cellen van pasgeborenen, in tegenstelling tot volwassen muizen, is dat de vetdepots snel groeien en dus een rijke bron zijn van actief proliferatie van preadipocyten17. Cellen die met dit protocol worden geïsoleerd, hebben een hoge proliferatieve capaciteit, waardoor culturen snel kunnen worden opgeschaald. Bovendien vertonen preadipocyten van pasgeboren pups een hoger differentiatiepotentieel dan volwassen voorlopers, wat de variabiliteit in de mate van differentiatie vermindert en zo de reproduceerbaarheid verhoogt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdipoRed (Nile Red)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bioproducts LLC</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1&#160;&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td>For Bioenergetics studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose, Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid-Free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norepinephrine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>557368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>For Bioenergetics studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>T1317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triiodothyronine (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>642511</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice

Het begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan adipocytdifferentiatie en functie heeft veel geprofiteerd van het gebruik van vereeuwigde witte preadipocytcellijnen. Deze gekweekte cellijnen hebben echter beperkingen. Ze vangen niet volledig het diverse functionele spectrum van de heterogene adipocytpopulaties waarvan nu bekend is dat ze bestaan in witte vetdepots. Om een meer fysiologisch relevant model te bieden om de complexiteit van wit vetweefsel te bestuderen, is een protocol ontwikkeld en geoptimaliseerd om gelijktijdige isolatie van primaire witte en bruine adipocytvoorlopers van pasgeboren muizen, hun snelle uitbreiding in cultuur en hun differentiatie in vitro in volwassen, volledig functionele adipocyten mogelijk te maken. Het primaire voordeel van het isoleren van primaire cellen van pasgeborenen in plaats van volwassen muizen, is dat de vetdepots zich actief ontwikkelen en daarom een rijke bron zijn van proliferatie van preadipocyten. Primaire preadipocyten geïsoleerd met behulp van dit protocol differentiëren snel bij het bereiken van samenvloeiing en worden volledig volwassen in 4-5 dagen, een tijdelijk venster dat nauwkeurig het uiterlijk van ontwikkelde vetkussens bij pasgeboren muizen weerspiegelt. Primaire culturen die met behulp van deze strategie zijn voorbereid, kunnen met een hoge reproduceerbaarheid worden uitgebreid en bestudeerd, waardoor ze geschikt zijn voor genetische en fenotypische schermen en de studie van de cel-autonome adipocytfenotypes van genetische muismodellen mogelijk worden. Dit protocol biedt een eenvoudige, snelle en goedkope aanpak om de complexiteit van vetweefsel in vitro te bestuderen.

Sectie 1 van het protocol zal een heterogene suspensie opleveren van cellen die zichtbaar zijn onder een standaard lichtmicroscoop. Het filteren van verteerd weefsel met een celzeef (sectie 2) zal onverteerd weefsel verwijderen. Sommige cellulaire brokstukken, bloedcellen en volwassen adipocyten zullen echter passeren (Figuur 1C). Zachte wasbeurten 1 uur na het plateren zullen niet-relevante cellen verwijderen, omdat preadipocyten zich snel aan de bodem van d...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice at JoVE.com

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

Dit rapport beschrijft een protocol voor de gelijktijdige isolatie van primaire bruine en witte preadipocyten van pasgeboren muizen. Geïsoleerde cellen kunnen in cultuur worden gekweekt en worden geïnduceerd om zich te onderscheiden in volgroeide witte en bruine adipocyten. De methode maakt genetische, moleculaire en functionele karakterisering van primaire vetcellen in cultuur mogelijk.

Isolatie en differentiatie van primaire witte en bruine preadipocyten van pasgeboren muizen

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Dit protocol biedt een eenvoudige strategie voor het genereren van celculturele modellen van witte en bruine adipocyten die in vitro getrouw de fysiologie van het vetweefsel dat we in vivo hebben, samenvatten. Dit protocol maakt gelijktijdige isolatie van zowel witte als bruine preadipocyten van pasgeboren muizen mogelijk en de cellen die we met deze methode isoleren, beoordelen een hoge proliferatieve capaciteit en differentiatiepotentieel. Cellen die met deze aanpak worden geïsoleerd, weerspiegelen de complexiteit van vetweefsel beter dan andere kweekmodellen.En het kan worden gebruikt om de adipocytfunctie bij obesitas en diabetes nauwkeuriger te bestuderen. We richten ons voornamelijk op het begrijpen van vetweefseldisfunctie bij obesitas. Cellen die met deze methode zijn voorbereid, kunnen echter ook worden gebruikt om basisvragen over cel in ontwikkelingsbiologie te bestuderen.De sleutel tot een succesvol experiment is het bepalen hoe de witte vetdepots kunnen worden geïdentificeerd als deze depots, die klein zijn, maar zeer rijk en proliferatie preadipocyten kunnen moeilijk te onderscheiden zijn bij pups. Visuele demonstratie illustreert hoe eenvoudig dit protocol is en maakt het mogelijk om tips te geven voor het lokaliseren en ontleden van de witte en bruine vetdepots. Het zien van de isolatie van het depot is zeer nuttig.Om onderhuids wit vetweefsel te verzamelen, snijdt u de huid rond de buik van een geëuthanaseerde pasgeboren pup en trekt u de huid voorzichtig onder de benen. Zonder huidweefsel te verzamelen, oogst u zorgvuldig het vetdepot, dat verschijnt als een helder of wit, dun langwerpig weefsel dat aan de binnenkant van de huid of bovenop de quadriceps is bevestigd. Spoel het geoogste depot af in PBS en plaats het vetweefsel in een buis van 1,5 milliliter met 250 microliter PBS en 200 microliter 2X isolatiebuffer op ijs.Om interscapulair bruin vetweefsel te verzamelen, trekt u de huid van de schouderbladen over het hoofd en tilt u het diep roodbruine vetweefsel tussen de schouderbladen op. Maak voorzichtig incisies rondom het vet om het los te maken van het lichaam en controleer het weefsel op consistentie en kleur. Plaats het weefsel na het spoelen in een tweede buis van 1,5 milliliter met 250 microliter PBS en 200 microliter 2X isolatiebuffer op ijs.Wanneer alle depots zijn verzameld, gebruikt u een schaar om elk depot vier tot zes keer voorzichtig rechtstreeks in de buizen te gehakt en voeg 50 microliters 10X collagenase in 2X isolatiebuffer toe aan elke buis. Draai vervolgens de buizen snel om om de weefsels te mengen en plaats ze gedurende 30 minuten in een temperatuurgecontroleerde mixer bij 37 graden Celsius en 1400 omwentelingen per minuut. Plaats aan het einde van de spijsvertering de buizen terug op ijs en filtreer de spijsverteringsweefsels door 100 micron celstampersen in nieuwe buizen van 50 milliliter.Om de celopbrengst te maximaliseren, spoelt u elke buis af met één milliliter isolatiemedium en filtert u deze was door de zeef. Verdun de bruine en witte vetweefseloplossingen tot twee milliliter weefselsuspensie per put per depot in een vers isolatiemedium. Vervolgens plaat twee milliliter witte vetweefsel suspensie aan elk van vier tot zes putten en twee milliliter bruin vetweefsel suspensie aan elk van twee tot drie putten van een zes put plaat door een 100 micron filter per put.Wanneer alle cellen zijn geplateerd, plaatst u de plaat gedurende 60 tot 90 minuten in de celkweek-incubator. Was aan het einde van de incubatie elke put met twee milliliter serumvrij medium en roer de plaat voorzichtig om eventuele bloedcellen van de bodem van de putten los te maken. Voeg na drie wasbeurten twee milliliter vers isolatiemedium toe aan de putten en breng de plaat terug naar de celkweek-incubator.Wanneer de cellen 80 tot 90% samenvloeiing bereiken, bedek nieuwe bestemmingsplaten met steriele 0,1% gelatine gedurende 10 minuten in gedestilleerd water bij 37 graden Celsius. Terwijl de platen incuberen, wast u de cellen met PBS voordat u ze drie minuten met trypsine behandelt in de celkweek-incubator. Wanneer de cellen zijn losgeraakt, pipet de celsuspensie meerdere keren om het celherstel te maximaliseren en de cellen over te brengen naar een nieuwe buis.Wanneer alle cellen zijn verzameld, wast u elke put met één milliliter isolatiemedium en trekt u de wasbeurten met de celsuspensie. Verzamel de cellen door centrifugeren en resuspend de pellet in drie tot vijf milliliter isolatiemedium voor het tellen. Verdun de cellen tot de juiste concentratie voor beplating in een vers isolatiemedium en was de met gelatine bedekte platen met PBS om overtollige gelatine te verwijderen.Zaai vervolgens de cellen op de met gelatine bedekte platen en breng de cellen terug naar de celkweek-incubator. Wanneer de cellen samenvloeiing bereiken, vervangt u het isolatiemedium door het differentiatiemedium. Als u bruine vetweefselpreadipocyten differentieert, voeg dan ook een nanomolar triiodothyronine toe.Ververs het medium na 48 uur met het juiste onderhoudsmedium per cultuur. Op dit moment moet de ophoping van kleine vloeibare druppeltjes in de cellen zichtbaar worden onder heldere veldmicroscopie. Zelfs na het filteren blijven sommige cellulaire brokstukken en bloedcellen in de celsuspensie.Zachte wasbeurten een uur na het plateren zullen niet-relevante cellen verwijderen, omdat de preadipocyten zich snel aan de bodem van de put hechten. Hoewel zowel witte als bruine preadipocyten geïsoleerd van pasgeboren pups een hoge proliferatieve capaciteit hebben, is de opbrengst van witte preadipocyten over het algemeen twee keer zo hoog als die van bruine preadipocyten per depotbasis. Daarom, als gesynchroniseerde culturen gewenst zijn, moet deze startdichtheid van de witte preadipocyten dienovereenkomstig worden berekend.Aan het einde van de differentiatie lijken de cellen geladen te zijn met lipidedruppels en zullen ze klassieke markers van respectievelijk witte en bruine adipocyten uitdrukken. In deze vergelijkende analyse van het zuurstofverbruik in een mitochondriale stresstest van primaire witte en bruine adipocyten onder basale omstandigheden, evenals als reactie op bekende stimulatoren van de mitochondriale functie, kunnen deze specifieke bio-energetische capaciteiten van elk celtype worden waargenomen. Vergeet niet dat we levende cellen isoleren en dat we ze enkele dagen willen cultuleren.Zorg er dus voor dat u tijdens de isolatie steriele omstandigheden behoudt om besmetting te voorkomen, wat de daaropvolgende kweek in gevaar kan brengen. Deze methode genereert volgroeide adipocyten die kunnen worden gebruikt voor verschillende toepassingen, waaronder functionele assays, genetische of chemische schermen of omics-profilering om cel-autonome mechanismen te bestuderen die de adipocytfunctie beïnvloeden.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

Primaire Cultuur van hippocampale neuronen van P0 pasgeboren ratten

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Isolatie van immuuncellen van primaire tumoren

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naïve Volwassen stamcellen Isolatie van primaire humane fibroblastkweken

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiatie van pasgeboren muis Skin afgeleide stamcellen in Germ-achtige cellen<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolatie van Primaire Myofibroblasten van Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolatie en Cultuur van Primaire Muis Keratinocyten Uit Neonatale en Volwassen Muis Huid

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolatie, karakterisering en differentiatie van cardiale stamcellen van het hart volwassen muis

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Isolatie, zuivering en differentiatie van osteoclast precursoren van het Rat beenmerg

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Isolatie en cultuur van primaire aorta-endotheel cellen van miniatuur varkens

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Unveiling Inflammatory Arthritis&#58; Exploring Functions of Synovial Cells

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue (Video) | JoVE 

Isolatie en kweek van primaire synoviale macrofagen en fibroblasten uit muizenartritisweefsel

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...