Name: isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice
Uploaded: 2021-01-25T14:00:00
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Les auteurs sont reconnaissants à Cristina Godio du Centro Nacional de Biotecnología de Madrid, en Espagne, à Mari Gantner de l’Institut de recherche Scripps, La Jolla, et à Anastasia Kralli de l’Université Johns Hopkins de Baltimore pour leur aide à optimiser ce protocole sur la base des travaux initiaux de Kahn et al.18. Ce travail a été financé par les subventions DK114785 et DK121196 des NIH à E.S.

Ce protocole suit toutes les directives de l’IACUC du Scripps Research Institute et de l’Université du Wisconsin - Madison School of Medicine and Public Health.
1. Collecte et digestion des dépôts adipeux (jour 1)
<ol><li>Préparer deux tubes de 1,5 mL pour chaque petit : un pour le tissu adipeux brun (MTD) et un pour le tissu adipeux blanc (WAT). Ajouter 250 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) + 200 μL de tampon d’isolement 2x (NaCl 123 mM, KCl 5 mM, CaCl2 1,...

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>McGarry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Banting+lecture+2001:+Dysregulation+of+fatty+acid+metabolism+in+the+etiology+of+type+2+diabetes.">Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes.</a> Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).</li><li>Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+adipose+tissue+in+the+treatment+of+obesity-associated+diabetes.">Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).</li><li>Waki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+molecule+harmine+is+an+antidiabetic+cell-type-specific+regulator+of+PPARgamma+expression.">The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression.</a> Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).</li><li>Dominguez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+phenotypic+and+activity-based+profiling+links+Ces3+to+obesity+and+diabetes.">Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes.</a> Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).</li><li>Galmozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThermoMouse:+an+in+vivo+model+to+identify+modulators+of+UCP1+expression+in+brown+adipose+tissue.">ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue.</a> Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV4+is+a+regulator+of+adipose+oxidative+metabolism,+inflammation,+and+energy+homeostasis.">TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis.</a> Cell. 151 (1), 96-110 (2012).</li><li>Lynes, M. D., Tseng, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+adipose+tissue+heterogeneity.">Deciphering adipose tissue heterogeneity.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1411 (1), 5-20 (2018).</li><li>Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+adipose+tissue+in+development+and+metabolic+function.">Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function.</a> Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958 (2018).</li><li>Sponton, C. H., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+roles+of+beige+fat+in+energy+homeostasis+beyond+UCP1.">Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1.</a> Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).</li><li>Gao, W., Kong, X., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+primary+culture,+and+differentiation+of+preadipocytes+from+mouse+brown+adipose+tissue.">Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).</li><li>Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+murine+primary+brown/beige+preadipocytes.">Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes.</a> Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).</li><li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+preadipocytes+from+rodent+white+adipose+tissue.">Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).</li><li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122 (1), 133-143 (2005).</li><li>Spalding, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fat+cell+turnover+in+humans.">Dynamics of fat cell turnover in humans.</a> Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).</li><li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+adipogenesis+during+white+adipose+tissue+development,+expansion+and+regeneration.">Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).</li><li>Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+brown+fat+preadipocytes.">Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes.</a> Sprotocols. , (2014).</li><li>Mills, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+succinate+controls+activation+of+adipose+tissue+thermogenesis.">Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis.</a> Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).</li><li>Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+and+beige+fat:+physiological+roles+beyond+heat+generation.">Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).</li><li>Pydi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+&#946;-arrestin-2+is+essential+for+maintaining+whole+body+glucose+and+energy+homeostasis.">Adipocyte &#946;-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis.</a> Nature Communications. 10 (1), 2936 (2019).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=snRNA-seq+reveals+a+subpopulation+of+adipocytes+that+regulates+thermogenesis.">snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis.</a> Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).</li><li>Galmozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGRMC2+is+an+intracellular+haem+chaperone+critical+for+adipocyte+function.">PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function.</a> Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).</li><li>Brown, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-related+receptors+mediate+the+adaptive+response+of+brown+adipose+tissue+to+adrenergic+stimulation.">Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation.</a> iScience. 2, 221-237 (2018).</li><li>Shinoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+functional+characterization+of+clonally+derived+adult+human+brown+adipocytes.">Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes.</a> Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).</li><li>Wang, Q. A., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AdipoChaser+mouse:+A+model+tracking+adipogenesis+in+vivo.">The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo.</a> Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).</li></ol>

Le tissu adipeux est essentiel pour la sensibilité systémique à l’insuline et l’homéostasie du glucose20. Le dysfonctionnement lié à l’obésité d’adipocyte est étroitement associé à l’apparition du diabète de type 2. Par conséquent, une plus grande compréhension de la biologie et de la physiologie de base du tissu adipeux peut permettre la conception de nouveaux traitements pour des désordres métaboliques. En complément de l’analyse fonctionnelle et transcriptionnelle d...

L’obésité résulte d’un déséquilibre chronique entre l’apport énergétique et la dépense énergétique. Au fur et à mesure que l’obésité se développe, les adipocytes blancs subissent une expansion massive de la taille des cellules qui entraîne une hypoxie dans le microenvironnement, la mort cellulaire, l’inflammation et la résistance à l’insuline1. Les adipocytes dysfonctionnels et hypertrophiés ne peuvent pas stocker correctement les lipides en excès, qui s’accumulent à la place dans d’autres tissus où ils amortissent l’action de l’insuline2,3. On prévoit que les agents qui améliorent la fonction d’adipocyte et restaurent la partition normale de lipide parmi les tissus pour être salutaires pour le traitement des conditions obésité-associées caractérisées par la résistance à l’insuline telles que le type - le diabète 2. Les écrans phénotypiques dans les adipocytes utilisant des lignées cellulaires immortalisées, telles que 3T3-L1, F442A et 10T 1/2, se sont avérés utiles pour identifier les facteurs génétiques qui régulent l’adipogenèse et pour isoler les molécules pro-adipogènes aux propriétés antidiabétiques4,5,6,7. Ces lignées cellulaires, cependant, ne reflètent pas entièrement l’hétérogénéité des types cellulaires présents dans les dépôts adipeux, qui comprend des sous-types d’adipocytes blancs, bruns, beiges et autres avec des caractéristiques uniques, qui contribuent tous à l’homéostasie systémique8,9,10. De plus, les lignées cellulaires cultivées montrent souvent une réponse diminuée aux stimuli externes.
En revanche, les cultures des adipocytes primaires récapitulent plus exactement la complexité de l’adipogenesis in vivo, et les adipocytes primaires montrent des réponses fonctionnelles robustes. Les préadipocytes primaires sont typiquement isolés de la fraction vasculaire stromale des dépôts adipeux de souris adultes11,12,13,14. Cependant, parce que les dépôts adipeux d’animaux adultes sont constitués principalement d’adipocytes pleinement matures qui ont un taux de renouvellement très lent15,16,17,cette approche donne une quantité limitée de préadipocytes avec un faible taux de prolifération. Par conséquent, l’isolement des préadipocytes de souris nouveau-nées est préférable pour obtenir de grandes quantités de cellules à croissance rapide qui peuvent être différenciées in vitro. Ici, un protocole a été décrit, inspiré par les travaux initiaux avec les adipocytes bruns primaires de Kahn et al.18 pour isoler efficacement les préadipocytes blancs et bruns qui peuvent être élargis et différenciés in vitro en adipocytes primaires pleinement fonctionnels(figure 1A). L’avantage d’isoler les cellules primaires du nouveau-né, par opposition aux souris adultes, est que les dépôts adipeux se développent rapidement et sont donc une riche source de préadipocytes qui prolifèrent activement17. Les cellules isolées à l’aide de ce protocole ont une capacité proliférative élevée, permettant une mise à l’échelle rapide des cultures. De plus, les préadipocytes des nouveau-nés présentent un potentiel de différenciation plus élevé que les progéniteurs adultes, ce qui réduit la variabilité d’un puits à l’autre de l’étendue de la différenciation et augmente ainsi la reproductibilité.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdipoRed (Nile Red)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bioproducts LLC</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1&#160;&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td>For Bioenergetics studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose, Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid-Free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norepinephrine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>557368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>For Bioenergetics studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>T1317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triiodothyronine (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>642511</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice

La compréhension des mécanismes étant à la base de la différenciation et de la fonction d’adipocyte a grandement bénéficié de l’utilisation des variétés de cellule blanches immortalisées de preadipocyte. Ces lignées cellulaires cultivées, cependant, ont des limites. Ils ne capturent pas complètement le spectre fonctionnel diversifié des populations hétérogènes d’adipocytes qui sont maintenant connues pour exister dans les dépôts adipeux blancs. Pour fournir un modèle physiologiquement plus pertinent pour étudier la complexité du tissu adipeux blanc, un protocole a été développé et optimisé pour permettre l’isolement simultané des progéniteurs primaires d’adipocyte blancs et bruns des souris nouveau-nées, leur expansion rapide dans la culture, et leur différenciation in vitro en adipocytes mûrs et pleinement fonctionnels. Le principal avantage d’isoler les cellules primaires des souris nouveau-nées, plutôt que des souris adultes, est que les dépôts adipeux se développent activement et sont, par conséquent, une riche source de préadipocytes proliférants. Les préadipocytes primaires isolés à l’aide de ce protocole se différencient rapidement en atteignant la confluence et deviennent pleinement matures en 4-5 jours, une fenêtre temporelle qui reflète avec précision l’apparence des coussinets gras développés chez les souris nouveau-nées. Les cultures primaires préparées à l’aide de cette stratégie peuvent être étendues et étudiées avec une reproductibilité élevée, ce qui les rend adaptées aux écrans génétiques et phénotypiques et permet l’étude des phénotypes d’adipocytes autonomes cellulaires des modèles murins génétiques. Ce protocole offre une approche simple, rapide, et peu coûteuse pour étudier la complexité du tissu adipeux in vitro.

La section 1 du protocole donnera une suspension hétérogène de cellules visibles sous un microscope optique standard. Le filtrage des tissus digérés à l’avec une passoire cellulaire (section 2) éliminera les tissus non digérés. Cependant, certains débris cellulaires, cellules sanguines et adipocytes matures passeront à travers (Figure 1C). Des lavages doux 1 h après le placage élimineront les cellules non pertinentes, car les préadipocytes se ...

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Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

Ce rapport décrit un protocole pour l’isolement simultané des preadipocytes bruns et blancs primaires des souris nouveau-nées. Les cellules isolées peuvent être cultivées en culture et induites pour se différencier en adipocytes blancs et bruns complètement matures. La méthode permet la caractérisation génétique, moléculaire et fonctionnelle des cellules graisseuses primaires en culture.

Isolement et différenciation des préadipocytes primaires blancs et bruns de souris nouveau-nées

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Ce protocole fournit une stratégie simple pour générer des modèles culturels cellulaires d’adipocytes blancs et bruns qui récapitulent fidèlement in vitro, la physiologie du tissu adipeux que nous avons in vivo. Ce protocole permet l’isolement simultané des préadipocytes blancs et bruns des souris nouveau-nées et les cellules que nous isolons utilisant cette méthode évaluent la capacité proliférative élevée et le potentiel de différenciation. Les cellules isolées à l’aide de cette approche reflètent mieux la complexité du tissu adipeux que les autres modèles de culture.Et il peut être utilisé pour étudier plus précisément la fonction des adipocytes dans l’obésité et le diabète. Nous nous concentrons principalement sur la compréhension du dysfonctionnement du tissu adipeux dans l’obésité. Cependant, les cellules préparées avec cette méthode peuvent également être utilisées pour étudier des questions de base sur les cellules en biologie du développement.La clé d’une expérience réussie est de déterminer comment identifier les dépôts adipeux blancs comme ces dépôts, qui sont petits, mais très riches et proliférant les préadipocytes peuvent être difficiles à distinguer chez les chiots. La démonstration visuelle illustre à quel point ce protocole est simple et permet de fournir des conseils pour localiser et disséquer les dépôts adipeux blancs et bruns. Voir l’isolement du dépôt est très utile.Pour recueillir le tissu adipeux blanc sous-cutané, coupez la peau autour de l’abdomen d’un nouveau-né euthanasié et tirez doucement la peau sous les jambes. Sans collecter de tissu cutané, récoltez soigneusement le dépôt de graisse, qui apparaîtra comme un tissu clair ou blanc, mince et allongé attaché à l’intérieur de la peau ou au-dessus du quadriceps. Rincez le dépôt récolté en PBS et placez le tissu adipeux dans un tube de 1,5 millilitre contenant 250 microlitres de PBS et 200 microlitres de tampon d’isolement 2X sur de la glace.Pour recueillir le tissu adipeux brun interscapulaire, tirez la peau des omoplates sur la tête et soulevez le tissu adipeux brun rouge profond situé entre les omoplates. Faites soigneusement des incisions tout autour de l’adipeux pour le détacher du corps et vérifier la consistance et la couleur du tissu. Après le rinçage, placez le tissu dans un deuxième tube de 1,5 millilitre contenant 250 microlitres de PBS et 200 microlitres de tampon d’isolement 2X sur de la glace.Lorsque tous les dépôts ont été collectés, utilisez des ciseaux pour hacher doucement chaque dépôt quatre à six fois directement à l’intérieur des tubes et ajoutez 50 microlitres de collagénase 10X dans un tampon d’isolement 2X à chaque tube. Ensuite, inversez rapidement les tubes pour mélanger et placer les tissus dans un mélangeur à température contrôlée pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius et 1400 tours par minute. À la fin de la digestion, replacez les tubes sur de la glace et filtrez les tissus digestifs à travers des passoires cellulaires de 100 microns dans de nouveaux tubes de 50 millilitres.Pour maximiser le rendement cellulaire, rincez chaque tube avec un millilitre de milieu d’isolement et filtrez ce lavage à travers la passoire. Diluer les solutions de tissu adipeux brun et blanc à deux millilitres de suspension tissulaire par puits et par dépôt dans un milieu d’isolement frais. Plaquez ensuite deux millilitres de suspension de tissu adipeux blanc à chacun des quatre à six puits et deux millilitres de suspension de tissu adipeux brun à chacun des deux à trois puits d’une plaque de six puits à travers un filtre de 100 microns par puits.Lorsque toutes les cellules ont été plaquées, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 60 à 90 minutes. À la fin de l’incubation, lavez chaque puits avec deux millilitres de milieu sans sérum et agitez doucement la plaque pour détacher les cellules sanguines du fond des puits. Après trois lavages, ajoutez deux millilitres de milieu d’isolement frais aux puits et retournez la plaque à l’incubateur de culture cellulaire.Lorsque les cellules atteignent 80 à 90% de confluence, enrobez les nouvelles plaques de destination de gélatine stérile à 0,1% dans de l’eau distillée à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Pendant que les plaques couvent, lavez les cellules avec du PBS avant de les traiter avec de la trypsine pendant trois minutes dans l’incubateur de culture cellulaire. Lorsque les cellules se sont détachées, pipettez la suspension cellulaire plusieurs fois pour maximiser la récupération des cellules et transférer les cellules dans un nouveau tube.Lorsque toutes les cellules ont été collectées, lavez-les bien avec un millilitre de milieu d’isolement et tirez les lavages avec la suspension cellulaire. Recueillir les cellules par centrifugation et ressusciter la pastille dans trois à cinq millilitres de milieu d’isolement pour le comptage. Diluer les cellules à la concentration appropriée pour le placage dans un milieu d’isolement frais et laver les plaques recouvertes de gélatine avec du PBS pour éliminer tout excès de gélatine.Ensemencez ensuite les cellules sur les plaques enrobées de gélatine et retournez les cellules à l’incubateur de culture cellulaire. Lorsque les cellules atteignent la confluence, remplacez le milieu d’isolement par un milieu de différenciation. Si vous différeciez les préadipocytes bruns du tissu adipeux, ajoutez également une triiodothyronine nanomolaire.Après 48 heures, rafraîchissez le milieu avec le volume approprié de milieu d’entretien par culture. À ce stade, l’accumulation de petites gouttelettes liquides dans les cellules devrait devenir visible sous microscopie à champ lumineux. Même après filtrage, certains débris cellulaires et cellules sanguines restent dans la suspension cellulaire.Des lavages doux une heure après le placage élimineront les cellules non pertinentes, car les préadipocytes se fixent rapidement au fond du puits. Bien que les préadipocytes blancs et bruns isolés chez les nouveau-nés aient une capacité proliférative élevée, le rendement en préadipocytes blancs est généralement deux fois plus élevé que celui des préadipocytes bruns par dépôt. Par conséquent, si des cultures synchronisées sont souhaitées, cette densité de départ des préadipocytes blancs doit être calculée en conséquence.À la fin de la différenciation, les cellules sembleront être chargées de gouttelettes lipidiques et exprimeront des marqueurs classiques d’adipocytes blancs et bruns, respectivement. Dans cette analyse comparative de la consommation d’oxygène dans un test d’effort mitochondrial des adipocytes blancs et bruns primaires dans des conditions basales, aussi bien qu’en réponse aux stimulateurs connus de la fonction mitochondrique, on peut observer ces capacités bioénergétiques spécifiques de chaque type de cellule. N’oubliez pas que nous isolons des cellules vivantes et que nous voulons les culturer pendant plusieurs jours.Assurez-vous donc de maintenir des conditions stériles pendant l’isolement pour éviter la contamination, ce qui peut compromettre la culture suivante. Cette méthode génère des adipocytes entièrement matures qui peuvent être utilisés pour différentes applications, y compris des tests fonctionnels, des tests génétiques ou chimiques, ou le profilage omique pour étudier les mécanismes cellulaires autonomes qui ont un impact sur la fonction des adipocytes.

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