Name: isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice
Uploaded: 2021-01-25T14:00:00
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Die Autoren danken Cristina Godio vom Centro Nacional de Biotecnología in Madrid, Spanien, Mari Gantner vom Scripps Research Institute, La Jolla, und Anastasia Kralli von der Johns Hopkins University, Baltimore, für die Unterstützung bei der Optimierung dieses Protokolls basierend auf den ersten Arbeiten von Kahn et al.18. Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse DK114785 und DK121196 an E.S.

Dieses Protokoll folgt allen IACUC-Richtlinien des Scripps Research Institute und der University of Wisconsin - Madison School of Medicine and Public Health.
1. Sammlung und Verdauung von Fettdepots (Tag 1)
<ol><li>Bereiten Sie zwei 1,5 ml Röhrchen für jeden Welpen vor: einen für braunes Fettgewebe (BAT) und einen für weißes Fettgewebe (WAT). 250 μL phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) + 200 μL 2x Isolationspuffer (123 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM CaCl2,5 mM Glucose, 100 m...

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>McGarry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Banting+lecture+2001:+Dysregulation+of+fatty+acid+metabolism+in+the+etiology+of+type+2+diabetes.">Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes.</a> Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).</li><li>Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+adipose+tissue+in+the+treatment+of+obesity-associated+diabetes.">Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).</li><li>Waki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+molecule+harmine+is+an+antidiabetic+cell-type-specific+regulator+of+PPARgamma+expression.">The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression.</a> Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).</li><li>Dominguez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+phenotypic+and+activity-based+profiling+links+Ces3+to+obesity+and+diabetes.">Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes.</a> Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).</li><li>Galmozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThermoMouse:+an+in+vivo+model+to+identify+modulators+of+UCP1+expression+in+brown+adipose+tissue.">ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue.</a> Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV4+is+a+regulator+of+adipose+oxidative+metabolism,+inflammation,+and+energy+homeostasis.">TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis.</a> Cell. 151 (1), 96-110 (2012).</li><li>Lynes, M. D., Tseng, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+adipose+tissue+heterogeneity.">Deciphering adipose tissue heterogeneity.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1411 (1), 5-20 (2018).</li><li>Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+adipose+tissue+in+development+and+metabolic+function.">Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function.</a> Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958 (2018).</li><li>Sponton, C. H., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+roles+of+beige+fat+in+energy+homeostasis+beyond+UCP1.">Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1.</a> Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).</li><li>Gao, W., Kong, X., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+primary+culture,+and+differentiation+of+preadipocytes+from+mouse+brown+adipose+tissue.">Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).</li><li>Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+murine+primary+brown/beige+preadipocytes.">Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes.</a> Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).</li><li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+preadipocytes+from+rodent+white+adipose+tissue.">Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).</li><li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122 (1), 133-143 (2005).</li><li>Spalding, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fat+cell+turnover+in+humans.">Dynamics of fat cell turnover in humans.</a> Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).</li><li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+adipogenesis+during+white+adipose+tissue+development,+expansion+and+regeneration.">Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).</li><li>Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+brown+fat+preadipocytes.">Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes.</a> Sprotocols. , (2014).</li><li>Mills, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+succinate+controls+activation+of+adipose+tissue+thermogenesis.">Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis.</a> Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).</li><li>Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+and+beige+fat:+physiological+roles+beyond+heat+generation.">Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).</li><li>Pydi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+&#946;-arrestin-2+is+essential+for+maintaining+whole+body+glucose+and+energy+homeostasis.">Adipocyte &#946;-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis.</a> Nature Communications. 10 (1), 2936 (2019).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=snRNA-seq+reveals+a+subpopulation+of+adipocytes+that+regulates+thermogenesis.">snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis.</a> Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).</li><li>Galmozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGRMC2+is+an+intracellular+haem+chaperone+critical+for+adipocyte+function.">PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function.</a> Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).</li><li>Brown, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-related+receptors+mediate+the+adaptive+response+of+brown+adipose+tissue+to+adrenergic+stimulation.">Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation.</a> iScience. 2, 221-237 (2018).</li><li>Shinoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+functional+characterization+of+clonally+derived+adult+human+brown+adipocytes.">Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes.</a> Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).</li><li>Wang, Q. A., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AdipoChaser+mouse:+A+model+tracking+adipogenesis+in+vivo.">The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo.</a> Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).</li></ol>

Fettgewebe ist entscheidend für die systemische Insulinsensitivität und Glukoseöostase20. Adipositas-assoziierte Adipozyten-Dysfunktion ist eng mit dem Auftreten von Typ-2-Diabetes verbunden. Daher kann ein besseres Verständnis der grundlegenden Biologie und Physiologie des Fettgewebes die Entwicklung neuer Behandlungen für Stoffwechselstörungen ermöglichen. Als Ergänzung zur direkten funktionellen und transkriptionellen Analyse reifer Adipozyten, die aus Fettdepots21</su...

Fettleibigkeit resultiert aus einem chronischen Ungleichgewicht zwischen Energieaufnahme und Energieverbrauch. Wenn sich Fettleibigkeit entwickelt, durchlaufen weiße Adipozyten eine massive Expansion der Zellgröße, die zu Hypoxie in der Mikroumgebung, Zelltod, Entzündung und Insulinresistenzführt 1. Dysfunktionale, hypertrophierte Adipozyten können überschüssige Lipide nicht richtig speichern, die sich stattdessen in anderen Geweben ansammeln, wo sie die Insulinwirkung2,3dämpfen. Es wird vorhergesagt, dass Mittel, die die Funktion der Adipozyten verbessern und die normale Lipidaufteilung zwischen den Geweben wiederherstellen, für die Behandlung von Adipositas-assoziierten Erkrankungen, die durch Insulinresistenz gekennzeichnet sind, wie Typ-2-Diabetes, von Vorteil sind. Phänotypische Screens in Adipozyten mit immortalisierten Zelllinien wie 3T3-L1, F442A und 10T 1/2 haben sich als nützlich erwiesen, um genetische Faktoren zu identifizieren, die die Adipogenese regulieren, und um pro-adipogene Moleküle mit antidiabetischen Eigenschaften zu isolieren4,5,6,7. Diese Zelllinien spiegeln jedoch nicht vollständig die Heterogenität der Zelltypen wider, die in Fettdepots vorhanden sind, zu denen weiße, braune, beige und andere Adipozytensubtypen mit einzigartigen Eigenschaften gehören, die alle zur systemischen Homöostase beitragen8,9,10. Darüber hinaus zeigen kultivierte Zelllinien oft eine verminderte Reaktion auf äußere Reize.
Im Gegensatz dazu rekapitulieren Kulturen primärer Adipozyten die Komplexität der In-vivo-Adipogenese genauer, und primäre Adipozyten zeigen robuste funktionelle Reaktionen. Primäre Präadipozyten werden typischerweise aus der stromalen vaskulären Fraktion der Fettdepots erwachsener Mäuse isoliert11,12,13,14. Da die Fettdepots erwachsener Tiere jedoch hauptsächlich aus voll ausgereiften Adipozyten bestehen, die eine sehr langsame Fluktuationsrate15,16,17aufweisen, ergibt dieser Ansatz eine begrenzte Menge an Präadipozyten mit einer niedrigen Proliferationsrate. Daher ist die Isolierung von Präadipozyten von neugeborenen Mäusen vorzuziehen, um große Mengen schnell wachsender Zellen zu erhalten, die in vitro differenziert werden können. Hier wurde ein Protokoll beschrieben, inspiriert von den ersten Arbeiten mit primären braunen Adipozyten von Kahn et al.18, um sowohl weiße als auch braune Präadipozyten effizient zu isolieren, die in vitro zu voll funktionsfähigen primären Adipozyten expandiert und differenziert werden können (Abbildung 1A). Der Vorteil der Isolierung von Primärzellen von Neugeborenen im Gegensatz zu erwachsenen Mäusen besteht darin, dass die Fettdepots schnell wachsen und somit eine reiche Quelle für aktiv proliferierende Präadipozyten sind17. Zellen, die mit diesem Protokoll isoliert wurden, haben eine hohe Proliferativkapazität, was ein schnelles Scale-up von Kulturen ermöglicht. Darüber hinaus weisen Präadipozyten von neugeborenen Welpen ein höheres Differenzierungspotenzial auf als erwachsene Vorläufer, was die Well-to-Well-Variabilität im Differenzierungsumfang reduziert und damit die Reproduzierbarkeit erhöht.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdipoRed (Nile Red)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bioproducts LLC</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1&#160;&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td>For Bioenergetics studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose, Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid-Free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norepinephrine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>557368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>For Bioenergetics studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>T1317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triiodothyronine (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>642511</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice

Das Verständnis der Mechanismen, die der Differenzierung und Funktion von Adipozyten zugrunde liegen, hat durch die Verwendung immortalisierter weißer Präadipozytenzelllinien stark profitiert. Diese kultivierten Zelllinien haben jedoch Einschränkungen. Sie erfassen nicht vollständig das vielfältige funktionelle Spektrum der heterogenen Adipozytenpopulationen, von denen heute bekannt ist, dass sie in weißen Fettdepots existieren. Um ein physiologisch relevanteres Modell zur Untersuchung der Komplexität von weißem Fettgewebe bereitzustellen, wurde ein Protokoll entwickelt und optimiert, um die gleichzeitige Isolierung primärer weißer und brauner Adipozytenvorläufer von neugeborenen Mäusen, ihre schnelle Expansion in Kultur und ihre Differenzierung in vitro in reife, voll funktionsfähige Adipozyten zu ermöglichen. Der Hauptvorteil der Isolierung von Primärzellen von Neugeborenen und nicht von erwachsenen Mäusen besteht darin, dass sich die Fettdepots aktiv entwickeln und daher eine reiche Quelle für proliferierende Präadipozyten sind. Primäre Präadipozyten, die mit diesem Protokoll isoliert wurden, differenzieren sich schnell nach Erreichen der Konfluenz und werden in 4-5 Tagen vollständig ausgereift, ein zeitliches Fenster, das das Auftreten von entwickelten Fettpolstern bei neugeborenen Mäusen genau widerspiegelt. Primärkulturen, die mit dieser Strategie hergestellt wurden, können mit hoher Reproduzierbarkeit erweitert und untersucht werden, wodurch sie für genetische und phänotypische Screens geeignet sind und die Untersuchung der zellautonomen Adipozytenphänotypen genetischer Mausmodelle ermöglichen. Dieses Protokoll bietet einen einfachen, schnellen und kostengünstigen Ansatz, um die Komplexität von Fettgewebe in vitro zu untersuchen.

Abschnitt 1 des Protokolls wird eine heterogene Suspension von Zellen ergeben, die unter einem Standard-Lichtmikroskop sichtbar sind. Durch das Filtern von verdautem Gewebe mit einem Zellsieb (Abschnitt 2) wird unverdautes Gewebe entfernt. Einige Zelltrümmer, Blutzellen und reife Adipozyten werden jedoch passieren (Abbildung 1C). Bei sanften Waschgängen 1 h nach dem Plattieren werden nicht relevante Zellen entfernt, da sich Präadipozyten schnell am Boden d...

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Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll zur gleichzeitigen Isolierung von primären braunen und weißen Präadipozyten von neugeborenen Mäusen. Isolierte Zellen können in Kultur gezüchtet und dazu gebracht werden, sich in voll ausgereifte weiße und braune Adipozyten zu differenzieren. Die Methode ermöglicht die genetische, molekulare und funktionelle Charakterisierung primärer Fettzellen in Kultur.

Isolierung und Differenzierung primärer weißer und brauner Präadipozyten von neugeborenen Mäusen

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Dieses Protokoll bietet eine einfache Strategie zur Erstellung zellkultureller Modelle von weißen und braunen Adipozyten, die die Physiologie des Fettgewebes, die wir in vivo haben, in vitro originalgetreu rekapitulieren. Dieses Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Isolierung von weißen und braunen Präadipozyten von neugeborenen Mäusen und die Zellen, die wir mit dieser Methode isolieren, bewerten eine hohe proliferative Kapazität und ein hohes Differenzierungspotenzial. Zellen, die mit diesem Ansatz isoliert wurden, spiegeln die Komplexität von Fettgewebe besser wider als andere Kulturmodelle.Und es kann verwendet werden, um die Adipozytenfunktion bei Fettleibigkeit und Diabetes genauer zu untersuchen. Wir konzentrieren uns in erster Linie auf das Verständnis von Fettgewebedysfunktion bei Fettleibigkeit. Mit dieser Methode hergestellte Zellen können aber auch genutzt werden, um grundlegende Fragen über Zellen in der Entwicklungsbiologie zu untersuchen.Der Schlüssel zu einem erfolgreichen Experiment ist die Bestimmung, wie die weißen Fettdepots als diese Depots identifiziert werden können, die klein, aber sehr reich sind und proliferierende Präadipozyten bei Welpen schwer zu unterscheiden sind. Die visuelle Demonstration veranschaulicht, wie einfach dieses Protokoll ist und ermöglicht die Bereitstellung von Tipps zum Auffinden und Sezieren der weißen und braunen Fettdepots. Die Isolierung des Depots zu sehen, ist sehr hilfreich.Um subkutanes weißes Fettgewebe zu sammeln, schneiden Sie die Haut um den Bauch eines eingeschläferten neugeborenen Welpen und ziehen Sie die Haut sanft unter die Beine. Ohne Hautgewebe zu sammeln, ernten Sie vorsichtig das Fettdepot, das als klares oder weißes, dünnes längliches Gewebe erscheint, das an der Innenseite der Haut oder auf dem Quadrizeps befestigt ist. Spülen Sie das geerntete Depot in PBS und legen Sie das Fettgewebe in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 250 Mikrolitern PBS und 200 Mikrolitern 2X Isolationspuffer auf Eis.Um interskapuläres braunes Fettgewebe zu sammeln, ziehen Sie die Haut von den Schulterblättern über den Kopf und heben Sie das tiefrotbraune Fettgewebe zwischen den Schulterblättern an. Machen Sie vorsichtig Einschnitte rund um die Fette, um sie vom Körper zu lösen und das Gewebe auf Konsistenz und Farbe zu überprüfen. Nach dem Spülen legen Sie das Gewebe in ein zweites 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 250 Mikrolitern PBS und 200 Mikrolitern 2X Isolationspuffer auf Eis.Wenn alle Depots gesammelt sind, verwenden Sie eine Schere, um jedes Depot vier- bis sechsmal direkt in den Röhrchen vorsichtig zu zerhacken und fügen Sie jedem Röhrchen 50 Mikroliter 10X Kollagenase in 2X Isolationspuffer hinzu. Dann kehren Sie die Röhrchen schnell um, um das Gewebe zu mischen und legen Sie es für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und 1400 Umdrehungen pro Minute in einen temperaturgesteuerten Mischer. Legen Sie am Ende der Verdauung die Schläuche wieder auf Eis und filtern Sie das Verdauungsgewebe durch 100-Mikron-Zellsieb in neue 50-Milliliter-Röhrchen.Um die Zellausbeute zu maximieren, spülen Sie jedes Röhrchen mit einem Milliliter Isolationsmedium aus und filtern Sie dieses Wasser durch das Sieb. Verdünnen Sie die braunen und weißen Fettgewebelösungen auf zwei Milliliter Gewebesuspension pro Vertiefung und Depot in frischem Isolationsmedium. Dann zwei Milliliter weiße Fettgewebesuspension zu jeweils vier bis sechs Vertiefungen und zwei Milliliter braune Fettgewebesuspension zu jeweils zwei bis drei Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte durch einen 100-Mikron-Filter pro Vertiefung.Wenn alle Zellen plattiert sind, legen Sie die Platte für 60 bis 90 Minuten in den Zellkulturinkubator. Am Ende der Inkubation jeden gut mit zwei Millilitern serumfreiem Medium waschen und die Platte vorsichtig rühren, um alle Blutzellen vom Boden der Vertiefungen zu lösen. Nach drei Wäschen zwei Milliliter frisches Isolationsmedium in die Vertiefungen geben und die Platte in den Zellkulturinkubator zurückgeben.Wenn die Zellen 80 bis 90% Konfluenz erreichen, beschichten Sie neue Zielplatten mit steriler 0,1% Gelatine in destilliertem Wasser bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Während die Platten inkubieren, waschen Sie die Zellen mit PBS, bevor Sie sie drei Minuten lang im Zellkulturinkubator mit Trypsin behandeln. Wenn sich die Zellen gelöst haben, pipetten Sie die Zellsuspension mehrmals, um die Zellerholung zu maximieren und die Zellen in ein neues Röhrchen zu übertragen.Wenn alle Zellen gesammelt sind, waschen Sie jede gut mit einem Milliliter Isolationsmedium und ziehen Sie die Waschungen mit der Zellsuspension. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in drei bis fünf Milliliter Isolationsmedium zum Zählen. Verdünnen Sie die Zellen auf die geeignete Konzentration für die Beschichtung in frischem Isolationsmedium und waschen Sie die mit Gelatine beschichteten Platten mit PBS, um überschüssige Gelatine zu entfernen.Dann säen Sie die Zellen auf die gelatinebeschichteten Platten und bringen die Zellen in den Zellkulturinkubator zurück. Wenn die Zellen die Konfluenz erreichen, ersetzen Sie das Isolationsmedium durch das Differenzierungsmedium. Wenn Sie braune Fettgewebe-Präadipozyten unterscheiden, fügen Sie auch ein nanomolares Trijodthyronin hinzu.Nach 48 Stunden erfrischen Sie das Medium mit dem entsprechenden Wartungsmedium pro Kultur. Zu diesem Zeitpunkt sollte die Ansammlung von kleinen Flüssigkeitströpfchen in den Zellen unter Hellfeldmikroskopie sichtbar werden. Auch nach dem Filtern verbleiben einige Zelltrümmer und Blutzellen in der Zellsuspension.Sanftes Waschen eine Stunde nach dem Plattieren entfernt nicht relevante Zellen, da sich die Präadipozyten schnell am Boden des Brunnens anlagern. Obwohl sowohl weiße als auch braune Präadipozyten, die aus neugeborenen Welpen isoliert wurden, eine hohe proliferative Kapazität haben, ist die Ausbeute an weißen Präadipozyten im Allgemeinen doppelt so hoch wie die von braunen Präadipozyten pro Depotbasis. Wenn also synchronisierte Kulturen gewünscht werden, muss diese Startdichte der weißen Präadipozyten entsprechend berechnet werden.Am Ende der Differenzierung scheinen die Zellen mit Lipidtröpfchen beladen zu sein und exprimieren klassische Marker von weißen bzw. braunen Adipozyten. In dieser vergleichenden Analyse des Sauerstoffverbrauchs in einem mitochondrialen Stresstest von primären weißen und braunen Adipozyten unter basalen Bedingungen sowie als Reaktion auf bekannte Stimulatoren der mitochondrialen Funktion können diese spezifischen bioenergetischen Fähigkeiten jedes Zelltyps beobachtet werden. Denken Sie daran, dass wir lebende Zellen isolieren und dass wir sie für mehrere Tage kulturieren wollen.Achten Sie also darauf, während der Isolierung sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten, um eine Kontamination zu vermeiden, die die nachfolgende Kultur beeinträchtigen kann. Diese Methode erzeugt vollständig ausgereifte Adipozyten, die für verschiedene Anwendungen verwendet werden können, einschließlich funktioneller Assays, genetischer oder chemischer Screens oder Omics-Profiling, um zellautonome Mechanismen zu untersuchen, die die Funktion der Adipozyten beeinflussen.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

Primäre Kultur des Hippocampus-Neuronen von neugeborenen Ratten P0

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Forschung

Biologie

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Isolierung von Immunzellen aus Primärtumoren

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naive Adult Stem Cells Isolation von primären humanen Fibroblasten Kulturen

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differenzierung von Newborn Mäusehaut Derived Stem Cells in Germ-like Cells<em&gt; In-vitro-</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolierung von Primär Myofibroblasten aus Maus und Mensch Colon Tissue

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolierung und Kultur der primären Maus Keratinozyten aus neonatalen und erwachsenen Maus Haut

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolierung, Charakterisierung und Differenzierung von kardialen Stammzellen von Erwachsenen Maus Herzen

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Isolierung, Reinigung und Differenzierung von Osteoclast-Laufläufern aus der Rattenmarkierung

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Isolation und Kultur der primären Aorten-Endothelzellen von Miniaturschweinen

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Unveiling Inflammatory Arthritis&#58; Exploring Functions of Synovial Cells

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue (Video) | JoVE 

Isolierung und Kultivierung von primären Synovialmakrophagen und Fibroblasten aus murinem Arthritisgewebe

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...