Name: isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice
Uploaded: 2021-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice at JoVE.com

המחברים אסירי תודה לכריסטינה גודיו בסנטרו נאסיונאל דה ביוטקנולוגיה במדריד, ספרד, מארי גנטנר במכון המחקר סקריפס, לה ג'ולה ואנסטסיה קראלי באוניברסיטת ג'ונס הופקינס, בולטימור, על סיוע באופטימיזציה של פרוטוקול זה בהתבסס על העבודה הראשונית של קאהן ואח'. עבודה זו מומנה על ידי NIH מענקים DK114785 ו DK121196 כדי E.S.

פרוטוקול זה פועל בהתאם לכל הנחיות IACUC של מכון המחקר סקריפס ואוניברסיטת ויסקונסין – בית הספר לרפואה ובריאות הציבור במדיסון.
1. איסוף ועיכול של מחסני שומן (יום 1)
<ol><li>הכינו שני צינורות 1.5 מ"ל לכל גור: אחד לרקמת שומן חומה (BAT) ואחד לרקמת שומן לבנה (WAT). הוסף 250 μL של מלוחים אגירת פוספ?...

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>McGarry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Banting+lecture+2001:+Dysregulation+of+fatty+acid+metabolism+in+the+etiology+of+type+2+diabetes.">Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes.</a> Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).</li><li>Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+adipose+tissue+in+the+treatment+of+obesity-associated+diabetes.">Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).</li><li>Waki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+molecule+harmine+is+an+antidiabetic+cell-type-specific+regulator+of+PPARgamma+expression.">The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression.</a> Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).</li><li>Dominguez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+phenotypic+and+activity-based+profiling+links+Ces3+to+obesity+and+diabetes.">Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes.</a> Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).</li><li>Galmozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThermoMouse:+an+in+vivo+model+to+identify+modulators+of+UCP1+expression+in+brown+adipose+tissue.">ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue.</a> Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV4+is+a+regulator+of+adipose+oxidative+metabolism,+inflammation,+and+energy+homeostasis.">TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis.</a> Cell. 151 (1), 96-110 (2012).</li><li>Lynes, M. D., Tseng, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+adipose+tissue+heterogeneity.">Deciphering adipose tissue heterogeneity.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1411 (1), 5-20 (2018).</li><li>Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+adipose+tissue+in+development+and+metabolic+function.">Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function.</a> Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958 (2018).</li><li>Sponton, C. H., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+roles+of+beige+fat+in+energy+homeostasis+beyond+UCP1.">Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1.</a> Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).</li><li>Gao, W., Kong, X., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+primary+culture,+and+differentiation+of+preadipocytes+from+mouse+brown+adipose+tissue.">Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).</li><li>Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+murine+primary+brown/beige+preadipocytes.">Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes.</a> Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).</li><li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+preadipocytes+from+rodent+white+adipose+tissue.">Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).</li><li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122 (1), 133-143 (2005).</li><li>Spalding, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fat+cell+turnover+in+humans.">Dynamics of fat cell turnover in humans.</a> Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).</li><li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+adipogenesis+during+white+adipose+tissue+development,+expansion+and+regeneration.">Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).</li><li>Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+brown+fat+preadipocytes.">Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes.</a> Sprotocols. , (2014).</li><li>Mills, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+succinate+controls+activation+of+adipose+tissue+thermogenesis.">Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis.</a> Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).</li><li>Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+and+beige+fat:+physiological+roles+beyond+heat+generation.">Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).</li><li>Pydi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+&#946;-arrestin-2+is+essential+for+maintaining+whole+body+glucose+and+energy+homeostasis.">Adipocyte &#946;-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis.</a> Nature Communications. 10 (1), 2936 (2019).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=snRNA-seq+reveals+a+subpopulation+of+adipocytes+that+regulates+thermogenesis.">snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis.</a> Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).</li><li>Galmozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGRMC2+is+an+intracellular+haem+chaperone+critical+for+adipocyte+function.">PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function.</a> Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).</li><li>Brown, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-related+receptors+mediate+the+adaptive+response+of+brown+adipose+tissue+to+adrenergic+stimulation.">Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation.</a> iScience. 2, 221-237 (2018).</li><li>Shinoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+functional+characterization+of+clonally+derived+adult+human+brown+adipocytes.">Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes.</a> Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).</li><li>Wang, Q. A., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AdipoChaser+mouse:+A+model+tracking+adipogenesis+in+vivo.">The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo.</a> Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).</li></ol>

רקמת שומן היא קריטית עבור רגישות לאינסולין מערכתית הומאוסטזיס גלוקוז20. תפקוד לקוי של אדיפוציטים הקשורים להשמנה קשור קשר הדוק עם הופעת סוכרת מסוג 2. לכן, הבנה טובה יותר של הביולוגיה הבסיסית והפיזיולוגיה של רקמת השומן עשויה לאפשר תכנון של טיפולים חדשים להפרעות מטבוליות. כהשלמה...

השמנת יתר נובעת מחוסר איזון כרוני בין צריכת האנרגיה להוצאות האנרגיה. כמו השמנת יתר מתפתחת, adipocytes לבן לעבור התרחבות מסיבית בגודל התא שתוצאתה היפוקסיה microenvironment, מוות תאי, דלקת, עמידות לאינסולין1. מתפקדת, adipocytes hypertrophied לא יכול כראוי לאחסן שומנים עודפים, אשר מצטברים במקום ברקמות אחרות שבו הם לעמעם פעולתאינסולין 2,3. סוכנים המשפרים את תפקוד adipocyte ולשחזר חלוקה שומנים נורמלית בין רקמות צפויים להיות מועיל לטיפול של תנאים הקשורים להשמנה המאופיינים תנגודת לאינסולין כגון סוכרת מסוג 2. מסכי פנוטיפית ב adipocytes באמצעות קווי תאים מונצחים, כגון 3T3-L1, F442A, ו 10T 1/2, הוכיחו שימושי כדי לזהות גורמים גנטיים המווסתים adipogenesis ולבודד מולקולות pro-adipogenic עם תכונות אנטי סוכרתיות4,5,6,7. קווי תאים אלה, לעומת זאת, אינם משקפים באופן מלא את ההטרוגניות של סוגי התאים הקיימים במחסני שומן, הכוללים תת-סוגים לבנים, חומים, בז 'ותתי-סוגים אחרים של אדיפוציטים בעלי מאפיינים ייחודיים, כולם תורמים להומאוסטזיס מערכתי8,9,10. יתר על כן, קווי תאים מתורבתים מראים לעתים קרובות תגובה מופחתת לגירויים חיצוניים.
לעומת זאת, תרבויות של adipocytes ראשי recapitulate בצורה מדויקת יותר את המורכבות של in vivo adipogenesis, ו adipocytes ראשי להראות תגובות תפקודיות חזקות. preadipocytes ראשוניים מבודדים בדרך כלל מן החלק הסטרומלי של מחסני שומן של עכברים בוגרים11,12,13,14. עם זאת, מכיוון שמחסני השומן של בעלי חיים בוגרים מורכבים בעיקר מאדיפוציטים בוגרים לחלוטין שיש להם שיעור מחזור איטי מאוד15,16,17, גישה זו מניבה כמות מוגבלת של preadipocytes עם שיעור התפשטות נמוך. לכן, בידוד של preadipocytes מעכברים שזה עתה נולד עדיף להשיג כמויות גדולות של תאים הגדלים במהירות שניתן להבדיל במבחנה. כאן תואר פרוטוקול, בהשראת העבודה הראשונית עם אדיפוציטים חומים ראשוניים של קאהן ואח '18 כדי לבודד ביעילות פרה-אפוציטים לבנים וחומים שניתן להרחיב ולהבדיל ביניהם במבחנה לאדיפוציטים ראשוניים מתפקדים במלואם(איור 1A). היתרון של בידוד תאים ראשוניים מהיילוד, בניגוד לעכברים בוגרים, הוא כי מחסני השומן גדלים במהירות ולכן הם מקור עשיר של שגשוג פעיל preadipocytes17. לתאים המבודדים באמצעות פרוטוקול זה יש יכולת התפשטות גבוהה, המאפשרת הרחבה מהירה של תרבויות. בנוסף, preadipocytes של גורים שזה עתה נולדו להציג פוטנציאל בידול גבוה יותר מאשר אבות מבוגרים, אשר מפחית את השונות היטב עד היטב בהיקף של בידול ובכך מגביר את הרבייה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdipoRed (Nile Red)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bioproducts LLC</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1&#160;&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td>For Bioenergetics studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose, Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid-Free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norepinephrine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>557368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>For Bioenergetics studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>T1317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triiodothyronine (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>642511</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice

ההבנה של המנגנונים שבבסיס הבידול והתפקוד של אדיפוציטים נהנתה מאוד מהשימוש בקווי תאים פרה-דיספוציטים לבנים מונצחים. עם זאת, לקווי תאים מתורבתים אלה יש מגבלות. הם אינם לוכדים באופן מלא את הספקטרום התפקודי המגוון של אוכלוסיות האדיפוציטים הטרוגניות הידועות כיום כקיימות בתוך מחסני שומן לבנים. כדי לספק מודל רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית כדי לחקור את המורכבות של רקמת שומן לבנה, פרוטוקול פותח ואופטימיזציה כדי לאפשר בידוד בו זמנית של אבות אדיפוציטים לבנים וחומים ראשוניים מעכברים שזה עתה נולדו, ההתפשטות המהירה שלהם בתרבות, והבידול שלהם במבחנה לתוך בוגרת, פונקציונלית לחלוטין adipocytes. היתרון העיקרי של בידוד תאים ראשוניים מהיילוד, ולא עכברים בוגרים, הוא שמחסני השומן מתפתחים באופן פעיל והם, אם כן, מקור עשיר של preadipocytes מתרבים. preadipocytes ראשי מבודד באמצעות פרוטוקול זה להבדיל במהירות עם ההגעה המפגש ולהיות בוגר לחלוטין ב 4-5 ימים, חלון זמן המשקף במדויק את המראה של רפידות שומן מפותחות בעכברים שזה עתה נולדו. תרבויות ראשוניות שהוכנו באמצעות אסטרטגיה זו ניתן להרחיב וללמוד עם רבייה גבוהה, מה שהופך אותם מתאימים מסכים גנטיים פנוטיפיים ומאפשר את המחקר של פנוטיפים אדיפוציטים תא אוטונומי של מודלים עכבר גנטי. פרוטוקול זה מציע גישה פשוטה, מהירה וזולה כדי ללמוד את המורכבות של רקמת שומן במבחנה.

סעיף 1 של הפרוטוקול יניב השעיה הטרוגנית של תאים הנראים תחת מיקרוסקופ אור סטנדרטי. סינון של רקמות מתעכלות עם מסננת תאים (סעיף 2) יסיר רקמה מעוכלת. עם זאת, כמה פסולת תאית, תאי דם, ו adipocytes בוגר יעבור דרך (איור 1C). שטיפות עדינות של שעה לאחר הציפוי יסירו תאים שאינם ר...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice at JoVE.com

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

דו"ח זה מתאר פרוטוקול לבידוד בו זמנית של preadipocytes חום ולבן ראשוני מעכברים שזה עתה נולדו. תאים מבודדים ניתן לגדל בתרבות המושרה להבדיל לתוך adipocytes לבן וחום בוגר לחלוטין. השיטה מאפשרת אפיון גנטי, מולקולרי ותפקודי של תאי שומן ראשוניים בתרבות.

בידוד ובידול של Preadipocytes לבן וחום ראשוני מעכברים שזה עתה נולדו

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

פרוטוקול זה מספק אסטרטגיה פשוטה ליצירת מודלים תרבותיים של תאים של adipocytes לבן וחום כי נאמנה recapitulate במבחנה, הפיזיולוגיה של רקמת השומן שיש לנו vivo. פרוטוקול זה מאפשר בידוד בו זמנית של פרה-אפוציטים לבנים וחומים מעכברים שזה עתה נולדו ומהתאים שאנו מבודדים בשיטה זו להעריך יכולת התפשטות גבוהה ופוטנציאל בידול. תאים מבודדים בגישה זו משקפים את המורכבות של רקמת שומן טוב יותר מאשר מודלים אחרים של תרבות.וזה יכול לשמש כדי ללמוד בצורה מדויקת יותר תפקוד adipocyte בהשמנת יתר וסוכרת. אנו מתמקדים בעיקר בהבנת תפקוד לקוי של רקמת שומן בהשמנת יתר. עם זאת, תאים שהוכנו בשיטה זו יכולים לשמש גם כדי ללמוד שאלות בסיסיות על תא בביולוגיה התפתחותית.המפתח לניסוי מוצלח הוא לקבוע כיצד לזהות את מחסני השומן הלבנים כמחסנים אלה, שהם קטנים, אך עשירים מאוד ומתרבים מראש, קשה להבחין בין גורים. הדגמה חזותית ממחישה עד כמה פרוטוקול זה פשוט ומאפשרת מתן טיפים לאיתור ולניתוח מחסני השומן הלבנים והחומים. לראות את בידוד המחסן עוזר מאוד.כדי לאסוף רקמת שומן לבנה תת עורית, לחתוך את העור סביב הבטן של גור הרדמה שזה עתה נולד, בעדינות למשוך את העור מתחת לרגליים. ללא איסוף כל רקמת עור, בזהירות לקצור את מחסן השומן, אשר יופיע כרקמה ברורה או לבנה, דק מוארך מחובר לחלק הפנימי של העור או על גבי quadriceps. שטפו את המחסן שנקטף ב-PBS והניחו את רקמת השומן בצינור של 1.5 מיליליטר המכיל 250 מיקרוליטרים של PBS ו-200 מיקרוליטרים של חיץ בידוד פי 2 על הקרח.כדי לאסוף רקמת שומן חום בין-עורית, משוך את העור מהשכמות מעל הראש והרם את רקמת השומן החומה האדומה העמוקה הממוקמת בין השכמות. בזהירות לעשות חתכים בכל רחבי השומן כדי לנתק אותו מהגוף ולבדוק את הרקמה עבור עקביות וצבע. לאחר השטיפה, מניחים את הרקמה בצינור 1.5 מיליליטר שני המכיל 250 מיקרוליטרים של PBS ו 200 מיקרוליטרים של חיץ בידוד 2X על קרח.כאשר כל המחסנים נאספו, השתמש במספריים כדי לטחון בעדינות כל מחסן ארבע עד שש פעמים ישירות בתוך הצינורות ולהוסיף 50 מיקרוליטרים של קולגנאז 10X במאגר בידוד פי 2 לכל צינור. ואז להפוך את הצינורות במהירות לערבב ומניחים את הרקמות במיקסר מבוקר טמפרטורה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 1400 סיבובים לדקה. בסוף העיכול, מניחים את הצינורות בחזרה על הקרח ומסננים את רקמות העיכול באמצעות 100 מסנני תאי מיקרון לצינורות חדשים של 50 מיליליטר.כדי למקסם את תפוקת התא, לשטוף כל צינור עם מיליליטר אחד של מדיום בידוד ולסנן את זה לשטוף דרך מסננת. לדלל את פתרונות רקמת שומן חום ולבן שני מיליליטר של השעיית רקמות לכל מחסן במדיום בידוד טרי. ואז צלחת שני מיליליטרים של השעיית רקמת שומן לבן לכל אחת מארבע עד שש בארות ושני מיליליטר של השעיית רקמת שומן חומה לכל אחת משתיים עד שלוש בארות של צלחת שש בארות דרך מסנן אחד של 100 מיקרון לבאר.כאשר כל התאים כבר מצופה, למקם את הצלחת באינקובטור תרבות התא במשך 60 עד 90 דקות. בסוף הדגירה, לשטוף כל באר עם שני מיליליטר של מדיום ללא סרום בעדינות להתסיס את הצלחת כדי לנתק את כל תאי הדם מתחתית הבארות. לאחר שלוש שטיפות, מוסיפים שני מיליליטר של מדיום בידוד טרי לבארות ומחזירים את הצלחת לחממת תרבות התאים.כאשר התאים מגיעים 80 עד 90% מפגש, מעיל צלחות יעד חדשות עם סטרילי 0.1% ג'לטין במים מזוקקים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בעוד הצלחות הם דגירה, לשטוף את התאים עם PBS לפני הטיפול עם טריפסין במשך שלוש דקות באינקובטור תרבות התא. כאשר התאים התנתקו, פיפטה התא השעיה מספר פעמים כדי למקסם את התאוששות התא ולהעביר את התאים לצינור חדש.כאשר כל התאים נאספו, לשטוף כל באר עם מיליליטר אחד של מדיום בידוד ולמשוך את הכביסה עם ההשעיה התא. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ו resuspend גלולה בשלושה עד חמישה מיליליטר של מדיום בידוד לספירה. לדלל את התאים לריכוז המתאים לציפוי במדיום בידוד טרי ולשטוף את הצלחות מצופות ג'לטין עם PBS כדי להסיר כל ג'לטין עודף.ואז לזרוע את התאים על הצלחות מצופות ג'לטין ולהחזיר את התאים לאינקובטור תרבות התא. כאשר התאים מגיעים לשיתוף, החלף את מדיום הבידוד באמצעי בידול. אם מבדיל בין רקמת שומן חומה preadipocytes, גם להוסיף אחד triiodothyronine ננומולאר.לאחר 48 שעות, רענן את המדיום עם נפח התחזוקה המתאים לתרבות. בשלב זה, הצטברות של טיפות נוזליות קטנות בתוך התאים צריכה להיות גלויה תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. גם לאחר סינון, כמה פסולת הסלולר ותאי הדם להישאר בתוך ההשעיה התא.שטיפות עדינות שעה לאחר הציפוי יסירו תאים שאינם רלוונטיים כמו preadipocytes לצרף במהירות לתחתית הבאר. למרות שלפראדיפוציטים לבנים וחומים המבודדים מגורים שזה עתה נולדו יש יכולת התפשטות גבוהה, התשואה של פרה-אפוציטים לבנים היא בדרך כלל כפולה מהתפוקה של פרה-דיפוציטים חומים על בסיס לכל דיפו. לכן, אם תרבויות מסונכרנות רצויות, יש לחשב את צפיפות ההתחלה של הפרה-אפוציטים הלבנים בהתאם.בסוף הבידול, התאים ייראו טעונים עם טיפות השומנים ויבטאו סמנים קלאסיים של adipocytes לבן וחום, בהתאמה. בניתוח השוואתי זה של צריכת חמצן במבחן מאמץ מיטוכונדריאלי של אדיפוציטים לבנים וחומים ראשוניים בתנאים בסיסיים, כמו גם בתגובה לגירויים ידועים של תפקוד מיטוכונדריאלי, ניתן לראות יכולות ביו-אנרגטיות ספציפיות אלה של כל סוג תא. זכור כי אנו מבודדים תאים חיים וכי אנחנו רוצים תרבות אותם במשך כמה ימים.אז הקפד לשמור על תנאים סטריליים במהלך הבידוד, כדי למנוע זיהום, אשר יכול לסכן את התרבות הבאה. שיטה זו מייצרת adipocytes בוגרת לחלוטין שניתן להשתמש בהם עבור יישומים שונים, כולל מבחנים פונקציונליים, מסכים גנטיים או כימיים, או פרופיל omics ללמוד מנגנונים תא אוטונומי המשפיעים על תפקוד adipocyte.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

תרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס של חולדות P0 יילוד

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

בידוד של תאים חיסוניים של גידולים ראשוניים

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

בידוד תאי גזע בוגרים נאיבי מתרבויות פיברובלסטים אנושיות הראשוניות

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

התמיינות של תאי העור של עכבר יילוד נגזר גזע לתאים דמוי נבט<em&gt; במבחנה</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

בידוד של ראשוני myofibroblasts מעכבר ורקמות מעי גס אנושיים

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב מהלב העכבר למבוגרים

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

בידוד, טיהור, והבידול של אוסטאוקלסט מקדים של מח עצם חולדה

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

בידוד ותרבות של בתאי אבי העורקים הראשוניים מחזירים זעירים

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Unveiling Inflammatory Arthritis&#58; Exploring Functions of Synovial Cells

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue (Video) | JoVE 

בידוד ותרבית של מקרופאגים סינוביאליים ראשוניים ופיברובלסטים מרקמת דלקת מפרקים מורין

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...