Name: isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice
Uploaded: 2021-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice at JoVE.com

Gli autori sono grati a Cristina Godio del Centro Nacional de Biotecnología di Madrid, Spagna, Mari Gantner presso lo Scripps Research Institute, La Jolla e Anastasia Kralli alla Johns Hopkins University di Baltimora, per l'assistenza nell'ottimizzazione di questo protocollo sulla base del lavoro iniziale di Kahn etal. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni NIH DK114785 e DK121196 a E.S.

Questo protocollo segue tutte le linee guida della IACUC dello Scripps Research Institute e della University of Wisconsin - Madison School of Medicine and Public Health.
1. Raccolta e digestione dei depositi adiposi (giorno 1)
<ol><li>Preparare due tubi da 1,5 ml per ogni cucciolo: uno per il tessuto adiposo marrone (BAT) e uno per il tessuto adiposo bianco (WAT). Aggiungere 250 μL di salina tamponata con fosfato (PBS) + 200 μL di tampone di isolamento 2x (123 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM CaC...

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>McGarry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Banting+lecture+2001:+Dysregulation+of+fatty+acid+metabolism+in+the+etiology+of+type+2+diabetes.">Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes.</a> Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).</li><li>Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+adipose+tissue+in+the+treatment+of+obesity-associated+diabetes.">Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).</li><li>Waki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+molecule+harmine+is+an+antidiabetic+cell-type-specific+regulator+of+PPARgamma+expression.">The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression.</a> Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).</li><li>Dominguez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+phenotypic+and+activity-based+profiling+links+Ces3+to+obesity+and+diabetes.">Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes.</a> Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).</li><li>Galmozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThermoMouse:+an+in+vivo+model+to+identify+modulators+of+UCP1+expression+in+brown+adipose+tissue.">ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue.</a> Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV4+is+a+regulator+of+adipose+oxidative+metabolism,+inflammation,+and+energy+homeostasis.">TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis.</a> Cell. 151 (1), 96-110 (2012).</li><li>Lynes, M. D., Tseng, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+adipose+tissue+heterogeneity.">Deciphering adipose tissue heterogeneity.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1411 (1), 5-20 (2018).</li><li>Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+adipose+tissue+in+development+and+metabolic+function.">Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function.</a> Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958 (2018).</li><li>Sponton, C. H., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+roles+of+beige+fat+in+energy+homeostasis+beyond+UCP1.">Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1.</a> Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).</li><li>Gao, W., Kong, X., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+primary+culture,+and+differentiation+of+preadipocytes+from+mouse+brown+adipose+tissue.">Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).</li><li>Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+murine+primary+brown/beige+preadipocytes.">Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes.</a> Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).</li><li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+preadipocytes+from+rodent+white+adipose+tissue.">Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).</li><li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122 (1), 133-143 (2005).</li><li>Spalding, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fat+cell+turnover+in+humans.">Dynamics of fat cell turnover in humans.</a> Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).</li><li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+adipogenesis+during+white+adipose+tissue+development,+expansion+and+regeneration.">Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).</li><li>Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+brown+fat+preadipocytes.">Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes.</a> Sprotocols. , (2014).</li><li>Mills, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+succinate+controls+activation+of+adipose+tissue+thermogenesis.">Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis.</a> Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).</li><li>Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+and+beige+fat:+physiological+roles+beyond+heat+generation.">Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).</li><li>Pydi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+&#946;-arrestin-2+is+essential+for+maintaining+whole+body+glucose+and+energy+homeostasis.">Adipocyte &#946;-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis.</a> Nature Communications. 10 (1), 2936 (2019).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=snRNA-seq+reveals+a+subpopulation+of+adipocytes+that+regulates+thermogenesis.">snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis.</a> Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).</li><li>Galmozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGRMC2+is+an+intracellular+haem+chaperone+critical+for+adipocyte+function.">PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function.</a> Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).</li><li>Brown, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-related+receptors+mediate+the+adaptive+response+of+brown+adipose+tissue+to+adrenergic+stimulation.">Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation.</a> iScience. 2, 221-237 (2018).</li><li>Shinoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+functional+characterization+of+clonally+derived+adult+human+brown+adipocytes.">Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes.</a> Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).</li><li>Wang, Q. A., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AdipoChaser+mouse:+A+model+tracking+adipogenesis+in+vivo.">The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo.</a> Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).</li></ol>

Il tessuto adiposo è fondamentale per la sensibilità sistemica all'insulina e l'omeostasidel glucosio 20. La disfunzione adipocite legata all'obesità è strettamente associata all'insorgenza del diabete di tipo 2. Pertanto, una maggiore comprensione della biologia di base e della fisiologia del tessuto adiposo può consentire la progettazione di nuovi trattamenti per i disturbi metabolici. Come complemento all'analisi funzionale diretta e trascrizionale degli adipociti maturi isolati dai deposi...

L'obesità deriva da uno squilibrio cronico tra l'assunzione di energia e il dispendio energetico. Con lo sviluppo dell'obesità, gli adipociti bianchi subiscono una massiccia espansione delle dimensioni delle cellule che si traduce in ipossia nel microambiente, morte cellulare, infiammazione e resistenza all'insulina1. Gli adipociti disfunzionali e ipertrofizzati non possono immagazzinare correttamente i lipidi in eccesso, che si accumulano invece in altri tessuti dove smorzano l'azioneinsulinica 2,3. Si prevede che gli agenti che migliorano la funzione dell'adipocite e ripristinano la normale partizionamento lipidico tra i tessuti siano benefici per il trattamento delle condizioni associate all'obesità caratterizzate da resistenza all'insulina come il diabete di tipo 2. Gli schermi fenotipici negli adipociti utilizzando linee cellulari immortalate, come 3T3-L1, F442A e 10T 1/2, si sono dimostrati utili per identificare fattori genetici che regolano l'adipogenesi e per isolare molecole pro-adipogeniche con proprietà antidiabetiche4,5,6,7. Queste linee cellulari, tuttavia, non riflettono pienamente l'eterogeneità dei tipi di cellule presenti nei depositi adiposi, che comprende sottotipi bianchi, marroni, beige e altri adipocite con caratteristiche uniche, che contribuiscono tutti all'omeostasi sistemica8,9,10. Inoltre, le linee cellulari coltivate mostrano spesso una risposta diminuita agli stimoli esterni.
Al contrario, le culture degli adipociti primari ricapitolano più accuratamente la complessità dell'adipogenesi in vivo, e gli adipociti primari mostrano risposte funzionali robuste. I preadipociti primari sono tipicamente isolati dalla frazione vascolare stromale dei depositi adiposi di topi adulti11,12,13,14. Tuttavia, poiché i depositi adiposi di animali adulti consistono principalmente in adipociti completamente maturi che hanno un tasso di turnovermolto lento 15,16,17, questo approccio produce una quantità limitata di preadipociti con un basso tasso di proliferazione. Pertanto, l'isolamento dei preadipociti dai topi appena nati è preferibile per ottenere grandi quantità di cellule in rapida crescita che possono essere differenziate in vitro. Qui è stato descritto un protocollo, ispirato al lavoro iniziale con gli adipociti marroni primari di Kahn etal. Il vantaggio di isolare le cellule primarie dal neonato, al contrario dei topi adulti, è che i depositi adiposi stanno rapidamente crescendo e sono quindi una ricca fonte di preadipociti attivamente proliferabili17. Le celle isolate utilizzando questo protocollo hanno un'elevata capacità proliferativa, consentendo un rapido scale-up delle colture. Inoltre, i preadipociti dei cuccioli appena nati mostrano un maggiore potenziale di differenziazione rispetto ai progenitori adulti, il che riduce la variabilità bene-bene nell'estensione della differenziazione e quindi aumenta la riproducibilità.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdipoRed (Nile Red)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bioproducts LLC</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1&#160;&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td>For Bioenergetics studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose, Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid-Free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norepinephrine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>557368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>For Bioenergetics studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>T1317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triiodothyronine (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>642511</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice

La comprensione dei meccanismi alla base della differenziazione e della funzione degli adipocite ha notevolmente beneficiato dell'uso di linee cellulari preadipocite bianche immortalate. Queste linee cellulari coltivate, tuttavia, hanno dei limiti. Non catturano completamente il variegato spettro funzionale delle popolazioni di adipocite eterogenee che ora sono note per esistere all'interno dei depositi di adiposi bianchi. Per fornire un modello più fisiologicamente rilevante per studiare la complessità del tessuto adiposo bianco, è stato sviluppato e ottimizzato un protocollo per consentire l'isolamento simultaneo dei progenitori adipociti bianchi e marroni primari dai topi appena nati, la loro rapida espansione in coltura e la loro differenziazione in vitro in adipociti maturi e pienamente funzionali. Il vantaggio principale dell'isolamento delle cellule primarie dai topi appena nati, piuttosto che adulti, è che i depositi di adiposi si stanno attivamente sviluppando e sono, quindi, una ricca fonte di preadipociti proliferanti. I preadipociti primari isolati usando questo protocollo si differenziano rapidamente al raggiungimento della confluenza e diventano completamente maturi in 4-5 giorni, una finestra temporale che riflette accuratamente l'aspetto dei cuscinetti di grasso sviluppati nei topi appena nati. Le colture primarie preparate utilizzando questa strategia possono essere ampliate e studiate con elevata riproducibilità, rendendole adatte a schermi genetici e fenotipiche e consentendo lo studio dei fenotipi adipocite autonomi delle cellule dei modelli genetici di topo. Questo protocollo offre un approccio semplice, rapido ed economico per studiare la complessità del tessuto adiposo in vitro.

La sezione 1 del protocollo produrrà una sospensione eterogenea delle cellule visibili al microscopio a luce standard. Il filtraggio dei tessuti digeriti con un colino cellulare (sezione 2) rimuoverà il tessuto non digerito. Tuttavia, alcuni detriti cellulari, cellule del sangue e adipociti maturi passeranno attraverso (Figura 1C). I lavaggi delicati 1 h dopo la placcatura rimuoveranno le cellule non rilevanti poiché i preadipociti si attaccano rapidamente...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice at JoVE.com

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

Questo rapporto descrive un protocollo per l'isolamento simultaneo dei preadipociti primari marroni e bianchi dai topi appena nati. Le cellule isolate possono essere coltivate in coltura e indotte a differenziarsi in adipociti bianchi e marroni completamente maturi. Il metodo consente la caratterizzazione genetica, molecolare e funzionale delle cellule adipose primarie in coltura.

Isolamento e differenziazione dei preadipociti bianchi e marroni primari dai topi appena nati

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Questo protocollo fornisce una semplice strategia per generare modelli culturali cellulari di adipociti bianchi e marroni che ricapitolano fedelmente in vitro, la fisiologia del tessuto adiposo che abbiamo in vivo. Questo protocollo consente l'isolamento simultaneo di preadipociti bianchi e marroni da topi appena nati e le cellule che isoliamo utilizzando questo metodo valutano un'elevata capacità proliferativa e potenziale di differenziazione. Le cellule isolate utilizzando questo approccio riflettono la complessità del tessuto adiposo meglio di altri modelli di coltura.E può essere usato per studiare più accuratamente la funzione adipocite nell'obesità e nel diabete. Ci concentriamo principalmente sulla comprensione della disfunzione del tessuto adiposo nell'obesità. Tuttavia, le cellule preparate con questo metodo possono anche essere utilizzate per studiare domande di base sulle cellule nella biologia dello sviluppo.La chiave per un esperimento riuscito è determinare come identificare i depositi di adiposi bianchi come questi depositi, che sono piccoli, ma molto ricchi e proliferano preadipociti possono essere difficili da distinguere nei cuccioli. La dimostrazione visiva illustra quanto sia semplice questo protocollo e consente di fornire suggerimenti per localizzare e sezionare i depositi adiposi bianchi e marroni. Vedere l'isolamento del deposito è molto utile.Per raccogliere il tessuto adiposo bianco sottocutaneo, tagliare la pelle intorno all'addome di un cucciolo appena nato eutanasiato e tirare delicatamente la pelle sotto le gambe. Senza raccogliere alcun tessuto cutaneo, raccogliere con cura il deposito di grasso, che apparirà come un tessuto allungato chiaro o bianco e sottile attaccato all'interno della pelle o sopra il quadricipite. Risciacquare il deposito raccolto in PBS e posizionare il tessuto adiposo in un tubo da 1,5 millilitri contenente 250 microlitri di PBS e 200 microlitri di tampone di isolamento 2X sul ghiaccio.Per raccogliere il tessuto adiposo marrone interscapulare, estrarre la pelle dalle scapole sopra la testa e sollevare il tessuto adiposo marrone intenso situato tra le scapole. Fare con cura incisioni intorno all'adiposo per staccarlo dal corpo e controllare il tessuto per coerenza e colore. Dopo il risciacquo, posizionare il tessuto in un secondo tubo da 1,5 millilitri contenente 250 microlitri di PBS e 200 microlitri di tampone di isolamento 2X sul ghiaccio.Una volta raccolti tutti i depositi, utilizzare le forbici per tritare delicatamente ogni deposito da quattro a sei volte direttamente all'interno dei tubi e aggiungere 50 microlitri di collagenasi 10X in tampone di isolamento 2X a ciascun tubo. Quindi invertire rapidamente i tubi per mescolare e posizionare i tessuti in un miscelatore a temperatura controllata per 30 minuti a 37 gradi Celsius e 1400 giri al minuto. Alla fine della digestione, riposizionare i tubi sul ghiaccio e filtrare i tessuti digestivi attraverso filtri cellulari da 100 micron in nuovi tubi da 50 millilitri.Per massimizzare la resa cellulare, sciacquare ogni tubo con un millilitro di mezzo di isolamento e filtrare questo lavaggio attraverso il filtro. Diluire le soluzioni di tessuto adiposo marrone e bianco a due millilitri di sospensione tissutale per pozzo per deposito in mezzo di isolamento fresco. Quindi placcare due millilitri di sospensione del tessuto adiposo bianco a ciascuno dei quattro o sei pozzi e due millilitri di sospensione del tessuto adiposo marrone a ciascuno dei due o tre pozzali di una piastra a sei pozza attraverso un filtro da 100 micron per pozzo.Quando tutte le cellule sono state placcate, posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per 60-90 minuti. Alla fine dell'incubazione, lavare ogni bene con due millilitri di mezzo privo di siero e agitare delicatamente la piastra per staccare eventuali cellule del sangue dal fondo dei pozzi. Dopo tre lavaggi, aggiungere due millilitri di mezzo di isolamento fresco ai pozzi e riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare.Quando le cellule raggiungono l'80-90% di confluenza, rivestire nuove piastre di destinazione con gelatina sterile dello 0,1% in acqua distillata a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Mentre le piastre sono in incubazione, lavare le cellule con PBS prima di trattare con tripina per tre minuti nell'incubatore di coltura cellulare. Quando le celle si sono staccate, pipettare più volte la sospensione cellulare per massimizzare il recupero cellulare e trasferire le celle in un nuovo tubo.Una volta raccolte tutte le cellule, lavare bene ogni bene con un millilitro di mezzo di isolamento e tirare i lavaggi con la sospensione cellulare. Raccogliere le cellule per centrifugazione e rimorsi il pellet in tre o cinque millilitri di mezzo di isolamento per il conteggio. Diluire le cellule alla concentrazione appropriata per la placcatura in mezzo di isolamento fresco e lavare le piastre rivestite di gelatina con PBS per rimuovere l'eccesso di gelatina.Quindi seminare le cellule sulle piastre rivestite di gelatina e riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare. Quando le cellule raggiungono la confluenza, sostituire il mezzo di isolamento con il mezzo di differenziazione. Se differenziando i preadipociti del tessuto adiposo marrone, aggiungere anche una triiodotironina nanomolare.Dopo 48 ore, aggiornare il mezzo con il volume appropriato di mezzo di manutenzione per coltura. In questo momento, l'accumulo di piccole goccioline liquide all'interno delle cellule dovrebbe diventare visibile sotto microscopia a campo luminoso. Anche dopo il filtraggio, alcuni detriti cellulari e cellule del sangue rimangono all'interno della sospensione cellulare.I lavaggi delicati un'ora dopo la placcatura rimuoveranno le cellule non rilevanti poiché i preadipociti si attaccano rapidamente al fondo del pozzo. Sebbene sia i preadipociti bianchi che marroni isolati dai cuccioli appena nati abbiano un'elevata capacità proliferativa, la resa dei preadipociti bianchi è generalmente il doppio di quella dei preadipociti marroni su base per deposito. Pertanto, se si desidera sincronizzare le impostazioni cultura, questa densità iniziale dei preadipociti bianchi deve essere calcolata di conseguenza.Alla fine della differenziazione, le cellule appariranno caricate con goccioline lipidiche ed esprimeranno rispettivamente marcatori classici di adipociti bianchi e marroni. In questa analisi comparativa del consumo di ossigeno in una prova di stress mitocondriale di adipociti primari bianchi e marroni in condizioni basali, così come in risposta a stimolatori noti della funzione mitocondriale, si possono osservare queste specifiche capacità bioenergetiche di ogni tipo di cellula. Ricordate che stiamo isolando le cellule vive e che vogliamo culturerle per diversi giorni.Quindi assicurati di mantenere condizioni sterili durante l'isolamento per evitare la contaminazione, che può compromettere la cultura successiva. Questo metodo genera adipociti completamente maturi che possono essere utilizzati per diverse applicazioni, tra cui saggi funzionali, schermi genetici o chimici o profilazione omica per studiare meccanismi autonomi delle cellule che hanno un impatto sulla funzione adipocita.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

Cultura primaria di neuroni dell&#39;ippocampo da P0 ratti neonati

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Ricerca

Biologia

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Isolamento di cellule immunitarie di tumori primari

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naïve Adult Stem Cells isolamento da colture primarie di fibroblasti umani

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differenziazione del neonato mouse pelle cellule staminali derivate in cellule germinali-simili<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolamento di primaria miofibroblasti da mouse e Colon Tessuto umano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolamento e cultura dei cheratinociti primari del mouse dalla pelle dei neonati e adulti

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolamento, caratterizzazione e differenziamento di cellule staminali cardiache dal cuore di topo adulto

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Isolamento, purificazione e differenziazione dei precursori dell'osteoclast dal midollo osseo del ratto

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Isolamento e cultura delle cellule endoteliali aortiche primarie dai suini in miniatura

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Unveiling Inflammatory Arthritis&#58; Exploring Functions of Synovial Cells

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue (Video) | JoVE 

Isolamento e coltura di macrofagi sinoviali primari e fibroblasti da tessuto di artrite murina

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...