Name: isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice
Uploaded: 2021-01-25T14:00:00
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저자는 스페인 마드리드의 센트로 나시오날 드 바이오테날로지아의 크리스티나 고디오, 스크립스 연구소의 마리 간트너, 라 호야, 그리고 존스 홉킨스 대학, 볼티모어의 아나스타샤 크랄리(Anastasia Kralli)에게 감사드리며, 칸 외18의초기 작업을 기반으로 이 프로토콜을 최적화하는 데 도움을 주었습니다. 이 작품은 NIH 보조금 DK114785 및 DK121196에 의해 E.S.에 의해 지원되었다.

이 프로토콜은 스크립스 연구소와 위스콘신 대학의 모든 IACUC 지침을 따릅니다 - 의학 및 공중 보건의 매디슨 학교.
1. 지방 창고의 수집 및 소화 (1 일)
<ol><li>각 새끼에 대해 두 개의 1.5 mL 튜브를 준비 : 갈색 지방 조직 (BAT)에 대한 하나와 흰색 지방 조직 (WAT)에 대한 하나. 인산염 완충식식염(PBS) + 2x 절연 버퍼의 200 μL(123m NaCl) 250 μL 추가, 5 mM KCl, 1.3 mM CaCl2,5 mM 포도당, 1...

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>McGarry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Banting+lecture+2001:+Dysregulation+of+fatty+acid+metabolism+in+the+etiology+of+type+2+diabetes.">Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes.</a> Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).</li><li>Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+adipose+tissue+in+the+treatment+of+obesity-associated+diabetes.">Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).</li><li>Waki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+molecule+harmine+is+an+antidiabetic+cell-type-specific+regulator+of+PPARgamma+expression.">The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression.</a> Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).</li><li>Dominguez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+phenotypic+and+activity-based+profiling+links+Ces3+to+obesity+and+diabetes.">Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes.</a> Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).</li><li>Galmozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThermoMouse:+an+in+vivo+model+to+identify+modulators+of+UCP1+expression+in+brown+adipose+tissue.">ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue.</a> Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV4+is+a+regulator+of+adipose+oxidative+metabolism,+inflammation,+and+energy+homeostasis.">TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis.</a> Cell. 151 (1), 96-110 (2012).</li><li>Lynes, M. D., Tseng, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+adipose+tissue+heterogeneity.">Deciphering adipose tissue heterogeneity.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1411 (1), 5-20 (2018).</li><li>Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+adipose+tissue+in+development+and+metabolic+function.">Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function.</a> Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958 (2018).</li><li>Sponton, C. H., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+roles+of+beige+fat+in+energy+homeostasis+beyond+UCP1.">Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1.</a> Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).</li><li>Gao, W., Kong, X., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+primary+culture,+and+differentiation+of+preadipocytes+from+mouse+brown+adipose+tissue.">Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).</li><li>Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+murine+primary+brown/beige+preadipocytes.">Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes.</a> Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).</li><li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+preadipocytes+from+rodent+white+adipose+tissue.">Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).</li><li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122 (1), 133-143 (2005).</li><li>Spalding, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fat+cell+turnover+in+humans.">Dynamics of fat cell turnover in humans.</a> Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).</li><li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+adipogenesis+during+white+adipose+tissue+development,+expansion+and+regeneration.">Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).</li><li>Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+brown+fat+preadipocytes.">Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes.</a> Sprotocols. , (2014).</li><li>Mills, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+succinate+controls+activation+of+adipose+tissue+thermogenesis.">Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis.</a> Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).</li><li>Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+and+beige+fat:+physiological+roles+beyond+heat+generation.">Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).</li><li>Pydi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+&#946;-arrestin-2+is+essential+for+maintaining+whole+body+glucose+and+energy+homeostasis.">Adipocyte &#946;-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis.</a> Nature Communications. 10 (1), 2936 (2019).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=snRNA-seq+reveals+a+subpopulation+of+adipocytes+that+regulates+thermogenesis.">snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis.</a> Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).</li><li>Galmozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGRMC2+is+an+intracellular+haem+chaperone+critical+for+adipocyte+function.">PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function.</a> Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).</li><li>Brown, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-related+receptors+mediate+the+adaptive+response+of+brown+adipose+tissue+to+adrenergic+stimulation.">Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation.</a> iScience. 2, 221-237 (2018).</li><li>Shinoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+functional+characterization+of+clonally+derived+adult+human+brown+adipocytes.">Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes.</a> Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).</li><li>Wang, Q. A., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AdipoChaser+mouse:+A+model+tracking+adipogenesis+in+vivo.">The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo.</a> Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).</li></ol>

지방 조직은 전신 인슐린 감도 및 포도당 항상성(20)에매우 중요합니다. 비만 연결 한 십분 장애는 타입-2 당뇨병의 개시와 단단히 연관됩니다. 따라서, 지방 조직의 기본 생물학 및 생리학의 더 큰 이해는 신진 대사 무질서를 위한 새로운 처리의 디자인을 가능하게 할 수 있습니다. 지방창고(21,22)로부터분리된 성숙한 ?...

비만은 에너지 섭취와 에너지 지출 사이 만성 불균형에서 유래합니다. 비만이 발전함에 따라, 백색 지방세포는 마이크로 환경, 세포 사멸, 염증 및 인슐린 저항성 1에서저산소증을 초래하는 세포 크기에서 대규모 확장을 겪습니다. 기능 장애, 비대 증분 세포제대로 과잉 지질을 저장할 수 없습니다., 그들은 인슐린 행동을 약화 하는 다른 조직에 대신 축적2,3. 조직 간의 정상적인 지질 분할을 개선하고 복원하는 제제는 제2형 당뇨병과 같은 인슐린 저항성을 특징으로 하는 비만 관련 조건의 치료에 도움이 될 것으로 예상된다. 3T3-L1, F442A 및 10T 1/2와 같은 불멸의 세포주를 이용한 포피세포내의 표형 스크린은 아디포발생을 조절하고 항당뇨병특성4,5,6,7로프로 아디포겐 성 분자를 분리하는 유전적 요인을 식별하는 데 유용하다는 것이 입증되었습니다. 그러나 이러한 세포주들은 백색, 갈색, 베이지 및 독특한 특성을 가진 다른 지방 창고에 존재하는 세포 유형의 이질성을 완전히 반영하지 않으며, 모두 전신 항상성에 기여8,9,10. 또한, 배양된 세포주들은 종종 외부 자극에 대한 반응감소를 보여준다.
대조적으로, 1 차 적인 지방 세포의 문화는 생체 내 분포 발생의 복잡성을 보다 정확하게 재구성하고, 1 차 적인 지방세포는 강력한 기능적 반응을 보여줍니다. 1차 전도세포는 일반적으로 성인마우스11,12,13,14의지방 창고의 기질 혈관 분획으로부터 분리된다. 그러나, 성인 동물의 지방 창고는 주로 매우 느린 회전율15,16,17을갖는 완전히 성숙한 지방세포로 구성되어 있기 때문에, 이 접근법은 낮은 증식율로 제한된 양의 지방세포를 산출한다. 따라서, 신생아 마우스로부터 의 혈구세포의 분리는 체외에서 분화될 수 있는 급속하게 성장하는 세포의 대량을 얻는 것이 바람직하다. 여기서, 프로토콜은 칸 외18의 1차 갈색 지방세포와 함께 초기 작업에서 영감을 받아 시험관에서 완전히 기능적인 1차 성구로 확장및 분화될 수 있는 백색및 갈색 지방세포(그림1A)를효율적으로 분리한다. 신생아에서 1차 세포를 분리하는 장점은 성인 마우스와 는 달리, 지방 창고가 급속히 성장하고 있으며, 따라서 적극적으로 확산되는 preadipocytes17의풍부한 공급원이라는 것입니다. 이 프로토콜을 사용하여 격리된 세포는 높은 증식 능력을 가지고 있어 배양의 급속한 확장을 가능하게 합니다. 또한 신생아 새끼의 프레드포스세포는 성인 전조자보다 더 높은 분화 잠재력을 나타내며, 이는 분화의 정도에서 잘 변이성을 감소시키고 따라서 재현성을 증가시킵니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdipoRed (Nile Red)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bioproducts LLC</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1&#160;&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td>For Bioenergetics studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose, Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid-Free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norepinephrine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>557368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>For Bioenergetics studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>T1317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triiodothyronine (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>642511</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice

삼각 세포 분화 및 기능의 근본적인 기계장치의 이해는 불멸의 백색 프레드포스세포 세포의 사용에서 크게 유익했습니다. 그러나 이러한 배양 된 세포주에는 한계가 있습니다. 그들은 지금 백색 지방 창고 안에 존재하는 것으로 알려져 있는 이질 성 지방 세포의 다양한 기능 스펙트럼을 완전히 포착하지 않습니다. 백색 지방 조직의 복잡성을 연구하기 위하여 보다 생리적으로 관련있는 모형을 제공하기 위하여는, 프로토콜은 신생아 마우스에서 1 차적인 백색과 갈색 선조의 동시 격리, 문화의 급속한 확장 및 시험관내의 분화를 성숙하고 완벽하게 기능성 있는 지방세포로 가능하게 하기 위하여 개발되고 최적화되었습니다. 신생아에서 1 차 세포를 분리의 주요 장점은, 오히려 성인 마우스보다, 지방 창고가 적극적으로 개발하고, 따라서, 확산 preadipocytes의 풍부한 소스입니다. 이 프로토콜을 사용하여 분리된 1차 전도체는 합류시 빠르게 분화되고 신생아 마우스에서 개발된 지방 패드의 외관을 정확하게 반영하는 시간적 창인 4-5일 후에 완전히 성숙해진다. 이 전략을 사용하여 준비된 1차 배양은 높은 재현성으로 확장및 연구될 수 있으며, 유전적 및 표현성 스크린에 적합하게 만들고 유전 마우스 모델의 세포 자율 적 인 세포 세포 표현형의 연구를 가능하게합니다. 이 프로토콜은 시험관 내 지방 조직의 복잡성을 연구하기 위해 간단하고 빠르며 저렴한 접근 방식을 제공합니다.

프로토콜의 섹션 1은 표준 광 현미경의 밑에 보이는 세포의 이기종 정지를 산출할 것입니다. 세포 여과기 (섹션 2)와 소화 된 조직의 필터링소화 되지 않은 조직을 제거 합니다. 그러나 일부 세포 이물질, 혈액 세포 및 성숙한 지방세포가 통과합니다(그림1C). 부드러운 세차 1 도금 후 1 h 는 지방 세포가 우물의 바닥에 빠르게 부착됨에 따라 비 관련이없...

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Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

이 보고서는 신생아 마우스에서 1 차적인 갈색 및 백색 프레드포스세포의 동시 적인 격리를 위한 프로토콜을 기술합니다. 분리된 세포는 배양에서 재배되고 완전히 성숙한 백색과 갈색 지방세포로 분화하도록 유도될 수 있다. 이 방법은 배양시 1차 지방세포의 유전적, 분자 및 기능적 특성화를 가능하게 한다.

신생아 마우스에서 기본 백색및 갈색 프레드포스세포의 격리 및 분화

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

이 프로토콜은 우리가 생체 외에서 가지고있는 지방 조직의 생리학인 체외에서 충실하게 재구성하는 백색과 갈색 지방 세포의 세포 문화 모델을 생성하기위한 간단한 전략을 제공합니다. 이 프로토콜은 신생아 마우스와 우리가 이 방법을 사용하여 격리하는 세포에서 백색과 갈색 지방세포의 동시 분리를 가능하게 하고 높은 증식 능력 및 분화 잠재력을 평가합니다. 이 접근법을 사용하여 분리된 세포는 다른 배양 모델보다 지방 조직의 복잡성을 더 잘 반영한다.그리고 비만과 당뇨병에서 지방 세포 기능을 보다 정확하게 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 비만에 있는 지방 조직 기능 장애를 이해하는 데 주로 집중합니다. 그러나, 이 방법으로 준비된 세포는 또한 발달 생물학에 있는 세포에 관하여 기본적인 질문을 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다.성공적인 실험의 핵심은 작은, 그러나 매우 풍부하고 확산 preadipocytes 새끼에서 구별하기 어려울 수 있습니다 이러한 창고로 흰색 지방 창고를 식별하는 방법을 결정하는 것입니다. 시각적 데모는 이 프로토콜이 얼마나 간단한지 보여 주며 흰색 및 갈색 지방 창고를 찾고 해부하기 위한 팁을 제공 할 수 있습니다. 창고 격리를 보는 것은 매우 도움이됩니다.피하 백색 지방 조직을 수집하려면 안락사 된 신생아 새끼의 복부 주위에 피부를 자르고 다리 아래 피부를 부드럽게 당깁니다. 피부 조직을 수집하지 않고, 조심스럽게 피부 내부 또는 사두근의 상단에 부착 된 투명 하거나 흰색, 얇은 길쭉한 조직으로 나타납니다 지방 창고를 수확. PBS에서 수확된 창고를 헹구고 250마이크로리터의 PBS와 얼음에 2X 절연 버퍼200마이크로리터를 포함하는 1.5 밀리리터 튜브에 지방 조직을 배치합니다.중간 갈색 지방 조직을 수집하려면 어깨 블레이드에서 머리를 위로 끌어 와 견갑골 사이에있는 깊은 붉은 갈색 지방 조직을 들어 올립니다. 조심스럽게 몸에서 분리하고 일관성과 색상을 위해 조직을 확인하기 위해 지방 주위의 절개를합니다. 헹구고, PBS 250 마이크로리터와 얼음에 2X 절연 버퍼의 200 마이크로리터를 포함하는 두 번째 1.5 밀리리터 튜브에 조직을 배치합니다.모든 창고를 채취하면 가위를 사용하여 각 창고를 튜브 내부에 4~6회 부드럽게 다진 다음 각 튜브에 2배 격리 버퍼에 10X 콜라게나아제 50마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 튜브를 빠르게 반전하여 조직을 온도 조절 믹서에 30분 동안 섭씨 37도, 분당 1400개의 회전으로 놓습니다. 소화가 끝나면 튜브를 얼음에 다시 넣고 100 미크론 세포 스트레이너를 통해 소화 조직을 새로운 50 밀리리터 튜브로 필터링합니다.세포 수율을 최대화하기 위해 각 튜브를 절연 매체 1밀리리터로 헹구고 스트레이너를 통해 세척을 필터링합니다. 갈색과 흰색 지방 조직 솔루션을 신선한 절연 매체에서 창고 당 잘 조직 현탁액 의 2 밀리리터에 희석. 그런 다음 백색 지방 조직 현탁액의 2 밀리리터를 각각 4-6 개의 우물과 갈색 지방 조직 현탁액 2 개씩 잘 당 100 미크론 필터를 통해 6 개의 우물 6 개 중 2 ~ 3 개의 우물에 접시를 접시.모든 세포가 도금되었을 때, 60~90분 동안 세포 배양 배양배인 배양에 플레이트를 놓는다. 인큐베이션의 끝에서, 세럼이없는 매체의 두 밀리리터로 각각 잘 씻고 부드럽게 우물의 바닥에서 혈액 세포를 분리하기 위해 접시를 교반. 세 번의 세차 후, 우물에 신선한 절연 매체의 2 밀리리터를 추가하고 세포 배양 인큐베이터에 접시를 반환합니다.세포가 80~90%의 합류에 도달하면, 10분 동안 섭씨 37도에서 증류수에 멸균 0.1%젤라틴으로 새로운 대상 플레이트를 코팅합니다. 플레이트가 배양하는 동안, 세포 배양 인큐베이터에서 트립신으로 치료하기 전에 PBS로 세포를 씻으십시오. 세포가 분리되면 세포 현탁액을 여러 번 피펫하여 세포 회복을 극대화하고 세포를 새로운 튜브로 이송합니다.모든 세포가 수집되면, 격리 배지의 1 밀리리터로 각각 잘 씻고 세포 현탁액으로 세척을 당깁니다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고 계산을 위한 격리 매체의 3~5밀리리터에서 펠릿을 재보중단한다. 신선한 절연 매체에서 도금에 적합한 농도로 세포를 희석하고 여분의 젤라틴을 제거하기 위해 PBS로 젤라틴 코팅 플레이트를 세척합니다.그런 다음 세포를 젤라틴 코팅 플레이트에 시드하고 세포를 세포 배양 배양기인으로 되돌려 줍니다. 세포가 합류성에 도달하면 격리 배지를 분화 매체로 바꿉시다. 갈색 지방 조직 지방 세포를 분화하는 경우, 또한 하나의 나노 몰트리오도티로닌을 추가합니다.48시간 후, 배양당 적절한 유지 보수 매체로 매체를 새로 고칩니다. 이때, 세포 내의 작은 액체 물방울의 축적은 밝은 필드 현미경 검사의 밑에 보일 되어야 합니다. 여과 후에도 일부 세포 이물질과 혈액 세포는 세포 현탁액 내에 남아 있습니다.부드러운 도금 후 1 시간 동안 세차하여 지방 세포가 우물 바닥에 빠르게 부착됨에 따라 관련이없는 세포를 제거합니다. 신생아 새끼로부터 분리된 백색과 갈색 프레드포스세포는 모두 높은 증식 능력을 가지고 있지만, 백색 지방세포의 수율은 일반적으로 창고 당 갈색 프레드포사이클의 두 배입니다. 따라서 동기화된 배양을 원하는 경우 백색 프레드포스세포의 시작 밀도를 그에 따라 계산해야 합니다.분화의 끝에서, 세포는 지질 물방울로 로드되는 것처럼 보이고 각각 백색과 갈색 지방세포의 고전적인 마커를 발현할 것이다. 기저 조건 하에서 1차 백색 및 갈색 지방세포의 미토콘드리아 스트레스 테스트에서 산소 소비를 비교분석할 뿐만 아니라 미토콘드리아 기능의 알려진 자극기에 대한 반응뿐만 아니라, 각 세포 유형의 이러한 특정 생체 에너지 능력을 관찰할 수 있다. 우리는 살아있는 세포를 고립시키고 있으며 며칠 동안 세포를 배양하고 싶다는 것을 기억하십시오.따라서 오염을 피하기 위해 격리 중에 멸균 상태를 유지하여 후속 배양을 손상시킬 수 있습니다. 이 방법은 기능성 분석을 포함하여 다른 응용 프로그램에 사용할 수있는 완전히 성숙한 안도세포를 생성, 유전 또는 화학 스크린, 또는 omics 프로파일링은 세포 자율 적 메커니즘을 연구하는 것은 안도 세포 기능에 영향을 미치는.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

P0 신생아 쥐에서 Hippocampal 신경의 주요 문화

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

연구

생물학

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

일차 종양에서 면역 세포의 분리

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

인간의 기본 섬유 아세포 배양에서 순진 성인 줄기 세포 분리

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

세균과 같은 세포로 신생아 마우스 피부 유래 줄기 세포의 분화<em&gt; 체외</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

마우스와 인간의 대장 조직에서 주요 근육 섬유 모세포의 분리

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

신생아 및 성인 마우스 피부의 1 차 마우스 각질 세포의 분리 및 배양

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

절연, 특성, 및 성인 마우스 심장에서 심장 줄기 세포의 분화

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

쥐 골 골에서의 파 골 세포 전 구체의 분리, 정제 및 분화

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

소형 돼지에서 1 차 대동맥 내피 세포의 격리 및 배양

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Unveiling Inflammatory Arthritis&#58; Exploring Functions of Synovial Cells

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue (Video) | JoVE 

쥐 관절염 조직에서 Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts의 분리 및 배양

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...