Name: isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice
Uploaded: 2021-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice at JoVE.com

Forfatterne er takknemlige til Cristina Godio ved Centro Nacional de Biotecnología i Madrid, Spania, Mari Gantner ved Scripps Research Institute, La Jolla og Anastasia Kralli ved Johns Hopkins University, Baltimore, for hjelp til å optimalisere denne protokollen basert på det første arbeidet til Kahn et al.18. Dette arbeidet ble finansiert av NIH-tilskudd DK114785 og DK121196 til E.S.

Denne protokollen følger alle IACUC-retningslinjer fra Scripps Research Institute og University of Wisconsin – Madison School of Medicine and Public Health.
1. Innsamling og fordøyelse av fettdepoter (dag 1)
<ol><li>Forbered to 1,5 ml rør for hver valp: en for brunt fettvev (BAT) og en for hvitt fettvev (WAT). Tilsett 250 μL fosfatbufret saltvann (PBS) + 200 μL 2x isolasjonsbuffer (123 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM CaCl2, 5 mM glukose, 100 mM 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazineetha...

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>McGarry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Banting+lecture+2001:+Dysregulation+of+fatty+acid+metabolism+in+the+etiology+of+type+2+diabetes.">Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes.</a> Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).</li><li>Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+adipose+tissue+in+the+treatment+of+obesity-associated+diabetes.">Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).</li><li>Waki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+molecule+harmine+is+an+antidiabetic+cell-type-specific+regulator+of+PPARgamma+expression.">The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression.</a> Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).</li><li>Dominguez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+phenotypic+and+activity-based+profiling+links+Ces3+to+obesity+and+diabetes.">Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes.</a> Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).</li><li>Galmozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThermoMouse:+an+in+vivo+model+to+identify+modulators+of+UCP1+expression+in+brown+adipose+tissue.">ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue.</a> Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV4+is+a+regulator+of+adipose+oxidative+metabolism,+inflammation,+and+energy+homeostasis.">TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis.</a> Cell. 151 (1), 96-110 (2012).</li><li>Lynes, M. D., Tseng, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+adipose+tissue+heterogeneity.">Deciphering adipose tissue heterogeneity.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1411 (1), 5-20 (2018).</li><li>Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+adipose+tissue+in+development+and+metabolic+function.">Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function.</a> Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958 (2018).</li><li>Sponton, C. H., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+roles+of+beige+fat+in+energy+homeostasis+beyond+UCP1.">Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1.</a> Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).</li><li>Gao, W., Kong, X., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+primary+culture,+and+differentiation+of+preadipocytes+from+mouse+brown+adipose+tissue.">Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).</li><li>Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+murine+primary+brown/beige+preadipocytes.">Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes.</a> Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).</li><li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+preadipocytes+from+rodent+white+adipose+tissue.">Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).</li><li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122 (1), 133-143 (2005).</li><li>Spalding, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fat+cell+turnover+in+humans.">Dynamics of fat cell turnover in humans.</a> Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).</li><li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+adipogenesis+during+white+adipose+tissue+development,+expansion+and+regeneration.">Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).</li><li>Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+brown+fat+preadipocytes.">Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes.</a> Sprotocols. , (2014).</li><li>Mills, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+succinate+controls+activation+of+adipose+tissue+thermogenesis.">Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis.</a> Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).</li><li>Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+and+beige+fat:+physiological+roles+beyond+heat+generation.">Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).</li><li>Pydi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+&#946;-arrestin-2+is+essential+for+maintaining+whole+body+glucose+and+energy+homeostasis.">Adipocyte &#946;-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis.</a> Nature Communications. 10 (1), 2936 (2019).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=snRNA-seq+reveals+a+subpopulation+of+adipocytes+that+regulates+thermogenesis.">snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis.</a> Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).</li><li>Galmozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGRMC2+is+an+intracellular+haem+chaperone+critical+for+adipocyte+function.">PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function.</a> Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).</li><li>Brown, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-related+receptors+mediate+the+adaptive+response+of+brown+adipose+tissue+to+adrenergic+stimulation.">Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation.</a> iScience. 2, 221-237 (2018).</li><li>Shinoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+functional+characterization+of+clonally+derived+adult+human+brown+adipocytes.">Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes.</a> Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).</li><li>Wang, Q. A., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AdipoChaser+mouse:+A+model+tracking+adipogenesis+in+vivo.">The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo.</a> Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).</li></ol>

Fettvev er avgjørende for systemisk insulinfølsomhet og glukose homeostase20. Fedme-bundet adipocyt dysfunksjon er tett forbundet med utbruddet av type 2 diabetes. Derfor kan større forståelse av grunnleggende biologi og fysiologi av fettvev muliggjøre design av nye behandlinger for metabolske forstyrrelser. Som et supplement til direkte funksjonell og transkripsjonell analyse av modne adipocytter isolert fra fettdepoter21,22, har kul...

Fedme skyldes en kronisk ubalanse mellom energiinntak og energiforbruk. Etter hvert som fedme utvikler seg, gjennomgår hvite adipocytter en massiv utvidelse i cellestørrelse som resulterer i hypoksi i mikromiljøet, celledød, betennelse og insulinresistens1. Dysfunksjonelle, hypertrofierte adipocytter kan ikke lagre overflødige lipider på riktig måte, som akkumuleres i stedet i andre vev der de demper insulinvirkning2,3. Midler som forbedrer adipocyttfunksjonen og gjenoppretter normal lipidpartisjonering blant vev, forventes å være gunstige for behandling av fedmerelaterte tilstander preget av insulinresistens som type 2 diabetes. Fenotypiske skjermer i adipocytter ved hjelp av udødelige cellelinjer, for eksempel 3T3-L1, F442A og 10T 1/2, har vist seg nyttige for å identifisere genetiske faktorer som regulerer adipogenese og isolere pro-adipogene molekyler med antidiabetiske egenskaper4,5,6,7. Disse cellelinjene gjenspeiler imidlertid ikke fullt ut heterogeniteten til celletyper som finnes i fettdepoter, som inkluderer hvite, brune, beige og andre adipocyttundertyper med unike egenskaper, som alle bidrar til systemisk homeostase8,9,10. Videre viser kultiverte cellelinjer ofte en redusert respons på ytre stimuli.
I motsetning til dette rekapitulerer kulturer av primære adipocytter mer nøyaktig kompleksiteten til in vivo-adipogenese, og primære adipocytter viser robuste funksjonelle responser. Primære preadipocytter er vanligvis isolert fra den stromale vaskulære brøkdelen av fettdepoter av voksne mus11,12,13,14. Men fordi fettdepotene til voksne dyr hovedsakelig består av fullt modne adipocytter som har en veldig langsomomsetningshastighet 15,16,17, gir denne tilnærmingen en begrenset mengde preadipocytter med lav spredningshastighet. Derfor er isolasjon av preadipocytter fra nyfødte mus å foretrekke å oppnå store mengder raskt voksende celler som kan differensieres in vitro. Her er det beskrevet en protokoll, inspirert av det første arbeidet med primærbrune adipocytter av Kahn et al.18 for effektivt å isolere både hvite og brune preadipocytter som kan utvides og differensieres in vitro til fullt funksjonelle primære adipocytter (Figur 1A). Fordelen med å isolere primære celler fra nyfødte, i motsetning til voksne mus, er at fettdepotene vokser raskt og dermed er en rik kilde til aktivt spredning av preadipocytter17. Celler isolert ved hjelp av denne protokollen har høy proliferativ kapasitet, noe som muliggjør rask oppskalering av kulturer. I tillegg viser preadipocytter fra nyfødte valper høyere differensieringspotensial enn voksne forfedre, noe som reduserer trivsel i graden av differensiering og dermed øker reproduserbarheten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdipoRed (Nile Red)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bioproducts LLC</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1&#160;&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td>For Bioenergetics studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose, Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid-Free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norepinephrine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>557368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>For Bioenergetics studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>T1317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triiodothyronine (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>642511</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice

Forståelsen av mekanismene som ligger til grunn for adipocyttdifferensiering og funksjon har hatt stor nytte av bruk av udødelige hvite preadipocyttcellelinjer. Disse kultiverte cellelinjene har imidlertid begrensninger. De fanger ikke fullt ut det mangfoldige funksjonelle spekteret av de heterogene adipocyttpo-populasjonene som nå er kjent for å eksistere innenfor hvite fettdepoter. For å gi en mer fysiologisk relevant modell for å studere kompleksiteten til hvitt fettvev, har en protokoll blitt utviklet og optimalisert for å muliggjøre samtidig isolasjon av primære hvite og brune adipocyttforfedre fra nyfødte mus, deres raske ekspansjon i kulturen og deres differensiering in vitro til modne, fullt funksjonelle adipocytter. Den primære fordelen med å isolere primærceller fra nyfødte, i stedet for voksne mus, er at fettdepotene utvikler seg aktivt og derfor er en rik kilde til spredning av preadipocytter. Primære preadipocytter isolert ved hjelp av denne protokollen skiller seg raskt ved å nå samløp og blir fullt modne på 4-5 dager, et temporalt vindu som nøyaktig gjenspeiler utseendet på utviklede fettputer hos nyfødte mus. Primærkulturer utarbeidet ved hjelp av denne strategien kan utvides og studeres med høy reproduserbarhet, noe som gjør dem egnet for genetiske og fenotypiske skjermer og muliggjør studiet av de celle-autonome adipocyttfenotypene av genetiske musemodeller. Denne protokollen tilbyr en enkel, rask og billig tilnærming for å studere kompleksiteten til fettvev in vitro.

Paragraf 1 i protokollen vil gi en heterogen suspensjon av celler som er synlige under et standard lysmikroskop. Filtrering av fordøyd vev med cellesil (avsnitt 2) vil fjerne ufordøyd vev. Noen cellulære rusk, blodceller og modne adipocytter vil imidlertid passere gjennom (Figur 1C). Forsiktig vask 1 t etter plating vil fjerne ikke-relevante celler som preadipocytter festes raskt til bunnen av brønnen (Figur 1C). I § 3 utvid...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice at JoVE.com

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

Denne rapporten beskriver en protokoll for samtidig isolering av primære brune og hvite preadipocytter fra nyfødte mus. Isolerte celler kan dyrkes i kultur og induseres for å skille seg ut i fullt modne hvite og brune adipocytter. Metoden muliggjør genetisk, molekylær og funksjonell karakterisering av primære fettceller i kulturen.

Isolasjon og differensiering av primærhvite og brune preadipocytter fra nyfødte mus

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Denne protokollen gir en enkel strategi for å generere cellekulturelle modeller av hvite og brune adipocytter som trofast recapitulate in vitro, fysiologien til fettvevet som vi har in vivo. Denne protokollen muliggjør samtidig isolering av både hvite og brune preadipocytter fra nyfødte mus og cellene som vi isolerer ved hjelp av denne metoden, vurderer høy proliferativ kapasitet og differensieringspotensial. Celler isolert ved hjelp av denne tilnærmingen gjenspeiler kompleksiteten i fettvev bedre enn andre kulturmodeller.Og det kan brukes til å mer nøyaktig studere adipocyttfunksjon i fedme og diabetes. Vi fokuserer primært på å forstå fettvev dysfunksjon i fedme. Celler utarbeidet med denne metoden kan imidlertid også brukes til å studere grunnleggende spørsmål om celle i utviklingsbiologi.Nøkkelen til et vellykket eksperiment er å bestemme hvordan man identifiserer de hvite fettdepotene som disse depotene, som er små, men veldig rike og sprer preadipocytter kan være vanskelig å skille mellom i valper. Visuell demonstrasjon illustrerer hvor enkel denne protokollen er og tillater levering av tips for å lokalisere og dissekere de hvite og brune fettdepotene. Å se depotisolasjonen er veldig nyttig.For å samle subkutant hvitt fettvev, kutt huden rundt magen til en euthanized nyfødt valp, og trekk forsiktig huden under bena. Uten å samle noe hudvev, høst forsiktig fettdepotet, som vil vises som et klart eller hvitt, tynt langstrakt vev festet til innsiden av huden eller på toppen av quadriceps. Skyll det høstede depotet i PBS og legg fettvevet i et 1,5 milliliterrør som inneholder 250 mikroliter PBS og 200 mikroliter 2X isolasjonsbuffer på is.For å samle interscapular brunt fettvev, trekk huden fra skulderbladene over hodet og løft det dype røde brune fettvevet som ligger mellom skulderbladene. Gjør forsiktig snitt rundt fettet for å løsne det fra kroppen og sjekk vevet for konsistens og farge. Etter skylling, plasser vevet i et annet 1,5 milliliterrør som inneholder 250 mikroliter PBS og 200 mikroliter 2X isolasjonsbuffer på is.Når alle depotene er samlet inn, bruk saks for å forsiktig hakke hvert depot fire til seks ganger direkte inne i rørene og tilsett 50 mikroliter 10X kollagenaliser i 2X isolasjonsbuffer til hvert rør. Snu deretter rørene raskt for å blande og plassere vevet i en temperaturkontrollert mikser i 30 minutter ved 37 grader Celsius og 1400 omdreininger per minutt. På slutten av fordøyelsen, plasser rørene tilbake på is og filtrer fordøyelsesvevet gjennom 100 mikroncellesiler i nye 50 milliliterrør.For å maksimere celleutbyttet, skyll hvert rør med en milliliter isolasjonsmedium og filtrer denne vasken gjennom silen. Fortynn de brune og hvite fettvevsløsningene til to milliliter vevsoppheng per brønn per depot i friskt isolasjonsmedium. Deretter plate to milliliter hvite fettvev suspensjon til hver av fire til seks brønner og to milliliter brun fett vev suspensjon til hver av to til tre brønner av en seks brønnplate gjennom en 100 mikron filter per brønn.Når alle cellene er belagt, plasser platen i cellekulturinkubatoren i 60 til 90 minutter. På slutten av inkubasjonen, vask hver brønn med to milliliter serumfritt medium og rør forsiktig platen for å løsne blodlegemer fra bunnen av brønnene. Etter tre vasker, tilsett to milliliter frisk isolasjonsmedium til brønnene og returner platen til cellekulturinkubatoren.Når cellene når 80 til 90% samløp, belegge nye destinasjonsplater med steril 0,1% gelatin i destillert vann ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Mens platene inkuberer, vask cellene med PBS før du behandler med trypsin i tre minutter i cellekulturinkubatoren. Når cellene har løsnet, pipette celleopphenget flere ganger for å maksimere cellegjenoppretting og overføre cellene til et nytt rør.Når alle cellene er samlet, vask hver brønn med en milliliter isolasjonsmedium og trekk vaskene med celleopphenget. Samle cellene ved sentrifugering og resuspend pellet i tre til fem milliliter isolasjon medium for telling. Fortynn cellene til riktig konsentrasjon for plating i friskt isolasjonsmedium og vask gelatinbelagte plater med PBS for å fjerne overflødig gelatin.Frø deretter cellene på gelatinbelagte plater og returner cellene til cellekulturinkubatoren. Når cellene når samløp, erstatter du isolasjonsmediet med differensieringsmediet. Hvis differensierer brunt fettvev preadipocytter, legg også til en nanomolar triiodothyronin.Etter 48 timer oppdaterer du mediet med riktig volum vedlikeholdsmedium per kultur. På dette tidspunktet bør opphopningen av små væskedråper i cellene bli synlig under lysfeltmikroskopi. Selv etter filtrering forblir noen cellulære rusk og blodceller i cellesuspensjonen.Milde vasker en time etter plating vil fjerne ikke-relevante celler som preadipocytter festes raskt til bunnen av brønnen. Selv om både hvite og brune preadipocytter isolert fra nyfødte valper har høy proliferativ kapasitet, er utbyttet av hvite preadipocytter generelt dobbelt så stort som brune preadipocytter per depotbasis. Derfor, hvis synkroniserte kulturer er ønsket, må denne starttettheten til de hvite preadipocyttene beregnes tilsvarende.På slutten av differensiering vil cellene se ut til å være lastet med lipiddråper og vil uttrykke klassiske markører av henholdsvis hvite og brune adipocytter. I denne komparative analysen av oksygenforbruk i en mitokondriestresstest av primære hvite og brune adipocytter under basale forhold, samt som svar på kjente stimulatorer av mitokondriefunksjon, kan denne spesifikke bioenergetiske evnen til hver celletype observeres. Husk at vi isolerer levende celler og at vi ønsker å dyrke dem i flere dager.Så sørg for å opprettholde sterile forhold under isolasjonen for å unngå forurensning, noe som kan kompromittere den påfølgende kulturen. Denne metoden genererer fullt modne adipocytter som kan brukes til forskjellige applikasjoner, inkludert funksjonelle analyser, genetiske eller kjemiske skjermer, eller omics profilering for å studere celle-autonome mekanismer som påvirker adipocyttfunksjon.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naive Adult Stem Cells Isolasjon fra primære humane fibroblastkulturer

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differensiering av nyfødte mus Skin Avledet stamceller inn Germ-lignende celler<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolering av primær myofibroblasts fra Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolering og kultur av primære muskeratinocytter fra neonatal og voksen mus hud

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolering og karakterisering differensiering av Cardiac stamceller fra voksen mus hjertet

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Isolasjon, rensing, og differensiering av Osteoclast forløpere fra Rat Bone marg

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Isolering og kultur av primær aorta endothelial celler fra miniatyr griser

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Unveiling Inflammatory Arthritis&#58; Exploring Functions of Synovial Cells

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue (Video) | JoVE 

Isolering og kultur av primære synoviale makrofager og fibroblaster fra murintartrittvev

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...