Name: isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice
Uploaded: 2021-01-25T14:00:00
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Os autores agradecem a Cristina Godio no Centro Nacional de Biotecnología em Madrid, Espanha, Mari Gantner no The Scripps Research Institute, La Jolla, e Anastasia Kralli na Universidade Johns Hopkins, baltimore, por assistência otimizando este protocolo com base no trabalho inicial de Kahn et al.18. Este trabalho foi financiado pelas bolsas NIH DK114785 e DK121196 para E.S.

Este protocolo segue todas as diretrizes da IACUC do Scripps Research Institute e da University of Wisconsin – Madison School of Medicine and Public Health.
1. Coleta e digestão de depósitos adiposos (dia 1)
<ol><li>Prepare dois tubos de 1,5 mL para cada filhote: um para tecido adiposo marrom (BAT) e outro para tecido adiposo branco (WAT). Adicionar 250 μL de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) + 200 μL de tampão de isolamento de 2x (123 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM CaCl2<...

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>McGarry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Banting+lecture+2001:+Dysregulation+of+fatty+acid+metabolism+in+the+etiology+of+type+2+diabetes.">Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes.</a> Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).</li><li>Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+adipose+tissue+in+the+treatment+of+obesity-associated+diabetes.">Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).</li><li>Waki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+molecule+harmine+is+an+antidiabetic+cell-type-specific+regulator+of+PPARgamma+expression.">The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression.</a> Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).</li><li>Dominguez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+phenotypic+and+activity-based+profiling+links+Ces3+to+obesity+and+diabetes.">Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes.</a> Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).</li><li>Galmozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThermoMouse:+an+in+vivo+model+to+identify+modulators+of+UCP1+expression+in+brown+adipose+tissue.">ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue.</a> Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV4+is+a+regulator+of+adipose+oxidative+metabolism,+inflammation,+and+energy+homeostasis.">TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis.</a> Cell. 151 (1), 96-110 (2012).</li><li>Lynes, M. D., Tseng, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+adipose+tissue+heterogeneity.">Deciphering adipose tissue heterogeneity.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1411 (1), 5-20 (2018).</li><li>Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+adipose+tissue+in+development+and+metabolic+function.">Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function.</a> Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958 (2018).</li><li>Sponton, C. H., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+roles+of+beige+fat+in+energy+homeostasis+beyond+UCP1.">Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1.</a> Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).</li><li>Gao, W., Kong, X., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+primary+culture,+and+differentiation+of+preadipocytes+from+mouse+brown+adipose+tissue.">Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).</li><li>Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+murine+primary+brown/beige+preadipocytes.">Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes.</a> Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).</li><li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+preadipocytes+from+rodent+white+adipose+tissue.">Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).</li><li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122 (1), 133-143 (2005).</li><li>Spalding, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fat+cell+turnover+in+humans.">Dynamics of fat cell turnover in humans.</a> Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).</li><li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+adipogenesis+during+white+adipose+tissue+development,+expansion+and+regeneration.">Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).</li><li>Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+brown+fat+preadipocytes.">Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes.</a> Sprotocols. , (2014).</li><li>Mills, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+succinate+controls+activation+of+adipose+tissue+thermogenesis.">Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis.</a> Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).</li><li>Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+and+beige+fat:+physiological+roles+beyond+heat+generation.">Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).</li><li>Pydi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+&#946;-arrestin-2+is+essential+for+maintaining+whole+body+glucose+and+energy+homeostasis.">Adipocyte &#946;-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis.</a> Nature Communications. 10 (1), 2936 (2019).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=snRNA-seq+reveals+a+subpopulation+of+adipocytes+that+regulates+thermogenesis.">snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis.</a> Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).</li><li>Galmozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGRMC2+is+an+intracellular+haem+chaperone+critical+for+adipocyte+function.">PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function.</a> Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).</li><li>Brown, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-related+receptors+mediate+the+adaptive+response+of+brown+adipose+tissue+to+adrenergic+stimulation.">Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation.</a> iScience. 2, 221-237 (2018).</li><li>Shinoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+functional+characterization+of+clonally+derived+adult+human+brown+adipocytes.">Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes.</a> Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).</li><li>Wang, Q. A., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AdipoChaser+mouse:+A+model+tracking+adipogenesis+in+vivo.">The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo.</a> Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).</li></ol>

O tecido adiposo é fundamental para a sensibilidade sistêmica da insulina e a homeostase de glicose20. A disfunção adipócito ligada à obesidade está fortemente associada ao aparecimento do diabetes tipo 2. Portanto, uma maior compreensão da biologia básica e fisiologia do tecido adiposo pode permitir a concepção de novos tratamentos para distúrbios metabólicos. Como complemento à análise funcional e transcricional direta de adipócitos maduros isolados dos depósitos de gordura<sup ...

A obesidade resulta de um desequilíbrio crônico entre o consumo de energia e o gasto energético. À medida que a obesidade se desenvolve, os adipócitos brancos sofrem uma expansão maciça no tamanho celular que resulta em hipóxia no microambiente, morte celular, inflamação e resistência à insulina1. Adipócitos disfuncionais e hipertróficos não conseguem armazenar adequadamente lipídios em excesso, que se acumulam em outros tecidos onde amortecem a ação da insulina2,3. Prevê-se que agentes que melhoram a função de adipócito e restaurem a partição lipídica normal entre os tecidos são considerados benéficos para o tratamento de condições associadas à obesidade caracterizadas pela resistência à insulina, como diabetes tipo 2. Telas fenotípicas em adipócitos usando linhas celulares imortalizadas, como 3T3-L1, F442A e 10T 1/2, têm se mostrado úteis para identificar fatores genéticos que regulam a adipogênese e isolar moléculas pró-adipogênicas com propriedades anti-diabéticas4,5,6,7. Essas linhas celulares, no entanto, não refletem totalmente a heterogeneidade dos tipos celulares presentes nos depósitos adiposos, que incluem subtipos brancos, marrons, bege e outros adipócitos com características únicas, todos os quais contribuem para a homeostase sistêmica8,9,10. Além disso, as linhas de células cultivadas frequentemente mostram uma resposta reduzida a estímulos externos.
Em contraste, culturas de adipócitos primários recapitulam com mais precisão a complexidade da adipogênese in vivo, e os adipócitos primários apresentam respostas funcionais robustas. Os pré-iícios primários são tipicamente isolados da fração vascular estromica dos depósitos adiposos de camundongos adultos11,12,13,14. No entanto, como os depósitos adiposos de animais adultos consistem principalmente de adipócitos totalmente maduros que têm uma taxa de rotatividade muito lenta15,16,17, essa abordagem produz uma quantidade limitada de pré-doenças com baixa taxa de proliferação. Portanto, o isolamento de preadipócitos de camundongos recém-nascidos é preferível obter grandes quantidades de células de rápido crescimento que podem ser diferenciadas in vitro. Aqui, foi descrito um protocolo, inspirado no trabalho inicial com adipócitos marrons primários de Kahn et al.18 para isolar eficientemente preadipócitos brancos e marrons que podem ser expandidos e diferenciados in vitro em adipócitos primários totalmente funcionais(Figura 1A). A vantagem de isolar células primárias de recém-nascidos, ao contrário dos camundongos adultos, é que os depósitos adiposos estão crescendo rapidamente e são, portanto, uma rica fonte de proliferação ativa de pré-doenças17. Células isoladas usando este protocolo têm alta capacidade de proliferação, permitindo uma rápida ampliação das culturas. Além disso, os pré-nascidos de filhotes apresentam maior potencial de diferenciação do que os progenitores adultos, o que reduz a variabilidade bem-para-bem na extensão da diferenciação e, portanto, aumenta a reprodutibilidade.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdipoRed (Nile Red)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bioproducts LLC</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1&#160;&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td>For Bioenergetics studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose, Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid-Free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norepinephrine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>557368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>For Bioenergetics studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>T1317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triiodothyronine (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>642511</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice

A compreensão dos mecanismos subjacentes à diferenciação e função adipócitos beneficiou-se muito do uso de linhas celulares pré-apócidas brancas imortalizadas. Essas linhas de células cultivadas, no entanto, têm limitações. Eles não capturam totalmente o espectro funcional diversificado das populações heterogênios que agora são conhecidas por existirem dentro de depósitos adiposos brancos. Para fornecer um modelo mais fisiologicamente relevante para estudar a complexidade do tecido adiposo branco, um protocolo foi desenvolvido e otimizado para permitir o isolamento simultâneo de progenitores adipócidos brancos e marrons primários de camundongos recém-nascidos, sua rápida expansão na cultura e sua diferenciação in vitro em adipócitos maduros e totalmente funcionais. A principal vantagem de isolar células primárias de camundongos recém-nascidos, em vez de camundongos adultos, é que os depósitos adiposos estão se desenvolvendo ativamente e são, portanto, uma rica fonte de proliferação de pré-doenças. Os pré-doenças primários isolados usando este protocolo diferenciam-se rapidamente ao atingir a confluência e tornam-se totalmente maduros em 4-5 dias, uma janela temporal que reflete com precisão o aparecimento de almofadas de gordura desenvolvidas em camundongos recém-nascidos. As culturas primárias preparadas com essa estratégia podem ser expandidas e estudadas com alta reprodutibilidade, tornando-as adequadas para telas genéticas e fenotípicas e possibilitando o estudo dos fenótipos adipócitos autônomos de células de modelos genéticos de camundongos. Este protocolo oferece uma abordagem simples, rápida e barata para estudar a complexidade do tecido adiposo in vitro.

A seção 1 do protocolo produzirá uma suspensão heterogênea de células que são visíveis sob um microscópio de luz padrão. A filtragem de tecidos digeridos com um coador celular (seção 2) removerá tecido não digerido. No entanto, alguns detritos celulares, células sanguíneas e adipócitos maduros passarão(Figura 1C). Lavagens suaves 1 h após o revestimento removerão células não relevantes à medida que os preadipócitos se prendem rapidamen...

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Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

Este relatório descreve um protocolo para o isolamento simultâneo de preadipócitos primários marrons e brancos de camundongos recém-nascidos. Células isoladas podem ser cultivadas na cultura e induzidas a se diferenciar em adipócitos brancos e marrons totalmente maduros. O método permite a caracterização genética, molecular e funcional das células de gordura primárias na cultura.

Isolamento e diferenciação de preadipócitos brancos e marrons primários de camundongos recém-nascidos

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Este protocolo fornece uma estratégia simples para gerar modelos culturais celulares de adipócitos brancos e marrons que recapitulam fielmente in vitro, a fisiologia do tecido adiposo que temos in vivo. Este protocolo permite o isolamento simultâneo de pré-nascidos brancos e pardos de camundongos recém-nascidos e as células que isolamos usando este método avaliam alta capacidade proliferativa e potencial de diferenciação. Células isoladas usando essa abordagem refletem a complexidade do tecido adiposo melhor do que outros modelos culturais.E pode ser usado para estudar com mais precisão a função adipócito na obesidade e diabetes. Focamos principalmente na compreensão da disfunção tecidual adiposa na obesidade. No entanto, as células preparadas com esse método também podem ser usadas para estudar questões básicas sobre células em biologia do desenvolvimento.A chave para um experimento bem-sucedido é determinar como identificar os depósitos de adiposos brancos como esses depósitos, que são pequenos, mas muito ricos e proliferando pré-apócitos podem ser difíceis de distinguir em filhotes. A demonstração visual ilustra o quão simples é este protocolo e permite o fornecimento de dicas para localizar e dissecar os depósitos adiposos brancos e marrons. Ver o isolamento do depósito é muito útil.Para coletar tecido adiposo branco subcutâneo, corte a pele ao redor do abdômen de um filhote recém-nascido eutanizado, e puxe suavemente a pele abaixo das pernas. Sem coletar nenhum tecido da pele, colhe cuidadosamente o depósito de gordura, que aparecerá como um tecido alongado claro ou branco, fino, preso ao interior da pele ou em cima do quadríceps. Enxágüe o depósito colhido em PBS e coloque o tecido adiposo em um tubo de 1,5 mililitro contendo 250 microliters de PBS e 200 microliters de tampão de isolamento 2X no gelo.Para coletar tecido adiposo marrom interscapular, puxe a pele das omoplatas sobre a cabeça e levante o tecido adiposo marrom vermelho profundo localizado entre as omoplatas. Faça cuidadosamente incisões ao redor do adiposo para desprender do corpo e verificar se o tecido tem consistência e cor. Após a lavagem, coloque o tecido em um segundo tubo de 1,5 mililitro contendo 250 microliters de PBS e 200 microliters de tampão de isolamento 2X no gelo.Quando todos os depósitos tiverem sido coletados, use uma tesoura para cortar suavemente cada depósito quatro a seis vezes diretamente dentro dos tubos e adicionar 50 microliters de colagenase 10X em tampão de isolamento 2X a cada tubo. Em seguida, inverta os tubos rapidamente para misturar e colocar os tecidos em uma batedeira controlada pela temperatura por 30 minutos a 37 graus Celsius e 1400 rotações por minuto. No final da digestão, coloque os tubos de volta no gelo e filtre os tecidos digestivos através de 100 coerdeiras de células de mícrons em novos tubos de 50 mililitros.Para maximizar o rendimento celular, enxágue cada tubo com um mililitro de meio de isolamento e filtre esta lavagem através do coador. Diluir as soluções de tecido adiposo marrom e branco para dois mililitros de suspensão tecidual por poço por depósito em meio de isolamento fresco. Em seguida, a placa dois mililitros de suspensão de tecido adiposo branco para cada um de quatro a seis poços e dois mililitros de suspensão de tecido adiposo marrom para cada um de dois a três poços de uma placa de seis poços através de um filtro de 100 mícrons por poço.Quando todas as células tiverem sido banhadas, coloque a placa na incubadora de cultura celular por 60 a 90 minutos. No final da incubação, lave cada poço com dois mililitros de meio livre de soro e agitar suavemente a placa para separar quaisquer células sanguíneas da parte inferior dos poços. Depois de três lavagens, adicione dois mililitros de meio de isolamento fresco aos poços e devolva a placa à incubadora de cultura celular.Quando as células atingem 80 a 90% de confluência, cubra novas placas de destino com gelatina estéril de 0,1% em água destilada a 37 graus Celsius por 10 minutos. Enquanto as placas estão incubando, lave as células com PBS antes de tratar com trippsina por três minutos na incubadora de cultura celular. Quando as células se separaram, pipeta a suspensão celular várias vezes para maximizar a recuperação celular e transferir as células para um novo tubo.Quando todas as células tiverem sido coletadas, lave cada poço com um mililitro de meio de isolamento e puxe as lavagens com a suspensão celular. Colete as células por centrifugação e resuspense a pelota em três a cinco mililitros de meio de isolamento para contar. Diluir as células à concentração adequada para chapeamento em meio de isolamento fresco e lavar as placas revestidas de gelatina com PBS para remover qualquer excesso de gelatina.Em seguida, semear as células nas placas revestidas de gelatina e devolver as células à incubadora de cultura celular. Quando as células atingirem a confluência, substitua o meio de isolamento por meio de diferenciação. Se diferenciar os pré-apócitos de tecido adiposo marrom, adicione também uma triiodotironina nanomolar.Após 48 horas, atualize o meio com o volume adequado de meio de manutenção por cultura. Neste momento, o acúmulo de pequenas gotículas líquidas dentro das células deve se tornar visível sob microscopia de campo brilhante. Mesmo após a filtragem, alguns detritos celulares e células sanguíneas permanecem dentro da suspensão celular.Lavagens suaves uma hora após o revestimento removerão células não relevantes à medida que os pré-apócitos se prendem rapidamente à parte inferior do poço. Embora os pré-apócis brancos e marrons isolados de filhotes recém-nascidos tenham uma alta capacidade de proliferação, o rendimento de pré-nascidos brancos é geralmente o dobro dos preadipócitos marrons em uma base por depósito. Portanto, se forem desejadas culturas sincronizadas, essa densidade inicial dos preadipócitos brancos deve ser calculada em conformidade.Ao final da diferenciação, as células parecerão carregadas com gotículas lipídicas e expressarão marcadores clássicos de adipócitos brancos e marrons, respectivamente. Nesta análise comparativa do consumo de oxigênio em um teste de estresse mitocondrial de adipócitos brancos e marrons primários em condições basais, bem como em resposta aos estimuladores conhecidos da função mitocondrial, essa capacidade bioenergénica específica de cada tipo de célula pode ser observada. Lembre-se que estamos isolando células vivas e que queremos cultuá-las por vários dias.Portanto, certifique-se de manter condições estéreis durante o isolamento para evitar contaminação, o que pode comprometer a cultura subsequente. Este método gera adipócitos totalmente maduros que podem ser usados para diferentes aplicações, incluindo ensaios funcionais, telas genéticas ou químicas, ou perfis omics para estudar mecanismos autônomos celulares que impactam a função adipócito.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

Cultura primária de neurônios do hipocampo de ratos recém-nascidos P0

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Biologia

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Isolamento de células imunes de tumores primários

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naïve Adult Stem Cells isolamento de culturas primárias de fibroblastos humanos

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Diferenciação de camundongos neonatos pele derivadas de células-tronco em células germinativas semelhantes<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolamento de primárias Miofibroblastos de Mouse e tecido do cólon humano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolamento e Cultura de Queratinócitos de Rato Primário de Pele de Rato Neonatal e Adulto

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco cardíacas do coração de rato adulto

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Isolamento, purificação e diferenciação de precursores de osteoclast da medula óssea de ratos

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Isolamento e cultura de células endoteliais aórticas primárias de suínos em miniatura

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Unveiling Inflammatory Arthritis&#58; Exploring Functions of Synovial Cells

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue (Video) | JoVE 

Isolamento e Cultura de Macrófagos e Fibroblastos Sinoviais Primários de Tecido de Artrite Murina

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...