Name: isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice
Uploaded: 2021-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice at JoVE.com

Авторы благодарны Кристине Годио из Национального центра биотехнологии в Мадриде, Испания, Мари Гантнер из Научно-исследовательского института Скриппса, Ла-Хойя, и Анастасии Кралли в Университете Джона Хопкинса, Балтимор, за помощь в оптимизации этого протокола на основе первоначальной работы Кана и др.18. Эта работа финансировалась грантами NIH DK114785 и DK121196 для E.S.

Этот протокол следует всем руководящим принципам IACUC Научно-исследовательского института Скриппса и Университета Висконсина - Мэдисонской школы медицины и общественного здравоохранения.
1. Сбор и переваривание жировых депо (день 1)
<ol><li>Подготовьте две трубки по 1,5 мл дл...

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>McGarry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Banting+lecture+2001:+Dysregulation+of+fatty+acid+metabolism+in+the+etiology+of+type+2+diabetes.">Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes.</a> Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).</li><li>Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+adipose+tissue+in+the+treatment+of+obesity-associated+diabetes.">Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).</li><li>Waki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+molecule+harmine+is+an+antidiabetic+cell-type-specific+regulator+of+PPARgamma+expression.">The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression.</a> Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).</li><li>Dominguez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+phenotypic+and+activity-based+profiling+links+Ces3+to+obesity+and+diabetes.">Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes.</a> Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).</li><li>Galmozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThermoMouse:+an+in+vivo+model+to+identify+modulators+of+UCP1+expression+in+brown+adipose+tissue.">ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue.</a> Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV4+is+a+regulator+of+adipose+oxidative+metabolism,+inflammation,+and+energy+homeostasis.">TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis.</a> Cell. 151 (1), 96-110 (2012).</li><li>Lynes, M. D., Tseng, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+adipose+tissue+heterogeneity.">Deciphering adipose tissue heterogeneity.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1411 (1), 5-20 (2018).</li><li>Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+adipose+tissue+in+development+and+metabolic+function.">Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function.</a> Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958 (2018).</li><li>Sponton, C. H., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+roles+of+beige+fat+in+energy+homeostasis+beyond+UCP1.">Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1.</a> Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).</li><li>Gao, W., Kong, X., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+primary+culture,+and+differentiation+of+preadipocytes+from+mouse+brown+adipose+tissue.">Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).</li><li>Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+murine+primary+brown/beige+preadipocytes.">Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes.</a> Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).</li><li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+preadipocytes+from+rodent+white+adipose+tissue.">Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).</li><li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122 (1), 133-143 (2005).</li><li>Spalding, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fat+cell+turnover+in+humans.">Dynamics of fat cell turnover in humans.</a> Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).</li><li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+adipogenesis+during+white+adipose+tissue+development,+expansion+and+regeneration.">Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).</li><li>Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+brown+fat+preadipocytes.">Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes.</a> Sprotocols. , (2014).</li><li>Mills, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+succinate+controls+activation+of+adipose+tissue+thermogenesis.">Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis.</a> Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).</li><li>Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+and+beige+fat:+physiological+roles+beyond+heat+generation.">Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).</li><li>Pydi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+&#946;-arrestin-2+is+essential+for+maintaining+whole+body+glucose+and+energy+homeostasis.">Adipocyte &#946;-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis.</a> Nature Communications. 10 (1), 2936 (2019).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=snRNA-seq+reveals+a+subpopulation+of+adipocytes+that+regulates+thermogenesis.">snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis.</a> Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).</li><li>Galmozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGRMC2+is+an+intracellular+haem+chaperone+critical+for+adipocyte+function.">PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function.</a> Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).</li><li>Brown, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-related+receptors+mediate+the+adaptive+response+of+brown+adipose+tissue+to+adrenergic+stimulation.">Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation.</a> iScience. 2, 221-237 (2018).</li><li>Shinoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+functional+characterization+of+clonally+derived+adult+human+brown+adipocytes.">Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes.</a> Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).</li><li>Wang, Q. A., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AdipoChaser+mouse:+A+model+tracking+adipogenesis+in+vivo.">The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo.</a> Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).</li></ol>

Жировая ткань имеет решающее значение для системной чувствительности к инсулину и глюкозного гомеостаза20. Дисфункция адипоцитов, связанная с ожирением, тесно связана с началом диабета 2 типа. Таким образом, более глубокое понимание базовой биологии и физиологии жировой т?...

Ожирение является результатом хронического дисбаланса между потреблением энергии и расходом энергии. По мере развития ожирения белые адипоциты подвергаются массивному увеличению размера клеток, что приводит к гипоксии в микросреде, гибели клеток, воспалению и резистентности к инсулину1. Дисфункциональные, гипертрофированные адипоциты не могут должным образом хранить избыток липидов, которые накапливаются вместо этого в других тканях, где они ослабляют действие инсулина2,3. Агенты, которые улучшают функцию адипоцитов и восстанавливают нормальное разделение липидов между тканями, по прогнозам, будут полезны для лечения связанных с ожирением состояний, характеризующихся резистентностью к инсулину, таких как диабет 2 типа. Фенотипические экраны в адипоцитах с использованием увековеченных клеточных линий, таких как 3T3-L1, F442A и 10T 1/2, оказались полезными для выявления генетических факторов, регулирующих адипогенез, и для выделения проадипогенных молекул с антидиабетическими свойствами4,5,6,7. Эти клеточные линии, однако, не полностью отражают гетерогенность типов клеток, присутствующих в адипозов, которые включают белые, коричневые, бежевые и другие подтипы адипоцитов с уникальными характеристиками, все из которых способствуют системному гомеостазу8,9,10. Кроме того, культивируемые клеточные линии часто показывают уменьшенную реакцию на внешние раздражители.
Напротив, культуры первичных адипоцитов более точно повторяют сложность адипогенеза in vivo, а первичные адипоциты демонстрируют надежные функциональные реакции. Первичные преадипоциты обычно выделяют из стромальной сосудистой фракции адипозных депо взрослых мышей11,12,13,14. Однако, поскольку жировые депо взрослых животных состоят в основном из полностью зрелых адипоцитов, которые имеют очень медленную скорость оборота15,16,17,такой подход дает ограниченное количество преадипоцитов с низкой скоростью пролиферации. Поэтому выделение преадипоцитов у новорожденных мышей предпочтительнее для получения большого количества быстро растущих клеток, которые можно дифференцировать in vitro. Здесь был описан протокол, вдохновленный первоначальной работой с первичными коричневыми адипоцитами Kahn et al.18 для эффективного выделения как белых, так и коричневых преадипоцитов, которые могут быть расширены и дифференцированы in vitro в полностью функциональные первичные адипоциты(рисунок 1A). Преимущество выделения первичных клеток у новорожденных, в отличие от взрослых мышей, заключается в том, что жировые депо быстро растут и, таким образом, являются богатым источником активно пролиферирующие преадипоциты17. Клетки, изолированные с использованием этого протокола, обладают высокой пролиферативной способностью, что позволяет быстро масштабировать культуры. Кроме того, преадипоциты новорожденных щенков демонстрируют более высокий дифференцировальный потенциал, чем взрослые прародители, что снижает вариабельность в степени дифференцировки и, таким образом, повышает воспроизводимость.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdipoRed (Nile Red)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bioproducts LLC</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1&#160;&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td>For Bioenergetics studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose, Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid-Free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norepinephrine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>557368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>For Bioenergetics studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>T1317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triiodothyronine (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>642511</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice

Понимание механизмов, лежащих в основе дифференцировки и функции адипоцитов, значительно выиграло от использования увековеченных белых клеточных линий преадипоцитов. Однако эти культивные клеточные линии имеют ограничения. Они не полностью охватывают разнообразный функциональный спектр гетерогенных популяций адипоцитов, которые, как теперь известно, существуют в депо белого жирового полотна. Чтобы обеспечить более физиологически релевантную модель для изучения сложности белой жировой ткани, был разработан и оптимизирован протокол, позволяющий одновременно выделить первичные белые и коричневые адипоцитарные прародители от новорожденных мышей, их быстрое расширение в культуре и их дифференцировку in vitro в зрелые, полностью функциональные адипоциты. Основным преимуществом выделения первичных клеток у новорожденных, а не взрослых мышей, является то, что жировые депо активно развиваются и, следовательно, являются богатым источником пролиферирующие преадипоциты. Первичные преадипоциты, выделенные с использованием этого протокола, быстро дифференцируются по достижении слияния и становятся полностью зрелыми через 4-5 дней, временное окно, которое точно отражает появление развитых жировых подушечек у новорожденных мышей. Первичные культуры, полученные с использованием этой стратегии, могут быть расширены и изучены с высокой воспроизводимостью, что делает их пригодными для генетических и фенотипических скринингов и позволяет изучать клеточно-автономные фенотипы адипоцитов генетических моделей мышей. Этот протокол предлагает простой, быстрый и недорогой подход к изучению сложности жировой ткани in vitro.

Раздел 1 протокола даст гетерогенную суспензию клеток, которые видны под стандартным световым микроскопом. Фильтрация переваренных тканей с помощью клеточного ситечкового фильтра (раздел 2) удалит непереваренные ткани. Тем не менее, некоторые клеточные обломки, клетк...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice at JoVE.com

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

В этом отчете описывается протокол одновременного выделения первичных коричневых и белых преадипоцитов у новорожденных мышей. Изолированные клетки могут быть выращены в культуре и индуцированы для дифференцировки в полностью зрелые белые и коричневые адипоциты. Метод позволяет проводить генетическую, молекулярную и функциональную характеристику первичных жировых клеток в культуре.

Выделение и дифференциация первичных белых и коричневых преадипоцитов у новорожденных мышей

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Этот протокол обеспечивает простую стратегию для создания клеточных культурных моделей белых и коричневых адипоцитов, которые точно повторяют in vitro физиологию жировой ткани, которую мы имеем in vivo. Этот протокол позволяет одновременно выделять как белые, так и коричневые преадипоциты у новорожденных мышей, а клетки, которые мы изолируем с помощью этого метода, оценивают высокую пролиферативную способность и дифференцировонный потенциал. Клетки, выделенные с использованием этого подхода, отражают сложность жировой ткани лучше, чем другие модели культуры.И его можно использовать для более точного изучения функции адипоцитов при ожирении и диабете. Мы фокусируемся в первую очередь на понимании дисфункции жировой ткани при ожирении. Тем не менее, клетки, полученные с помощью этого метода, также могут быть использованы для изучения основных вопросов о клетке в биологии развития.Ключом к успешному эксперименту является определение того, как идентифицировать белые адипо, поскольку эти депо, которые являются небольшими, но очень богатыми и пролиферирующими преадипоцитами, может быть трудно различить у детенышей. Визуальная демонстрация иллюстрирует, насколько прост этот протокол, и позволяет предоставлять советы по обнаружению и рассечению белых и коричневых адипозных складов. Видеть изоляцию депо очень полезно.Чтобы собрать подкожную белую жировую ткань, разрежьте кожу вокруг живота усыпленного новорожденного щенка, и аккуратно потяните кожу ниже ног. Не собирая никаких кожных тканей, тщательно соберите жировое депо, которое будет выглядеть как прозрачная или белая, тонкая удлиненная ткань, прикрепленная к внутренней части кожи или поверх квадрицепсов. Промыть собранный депо в PBS и поместить жировую ткань в 1,5-миллилитрную трубку, содержащую 250 микролитров PBS и 200 микролитров 2X изоляционного буфера на льду.Чтобы собрать межлопапатку коричневой жировой ткани, вытяните кожу с лопаток над головой и поднимите темно-красную коричневую жировую ткань, расположенную между лопатками. Осторожно сделайте разрезы по всему жиру, чтобы отсоедить его от тела и проверить ткань на консистенцию и цвет. После промывки поместите ткань во вторую 1,5-миллилитровую трубку, содержащую 250 микролитров PBS и 200 микролитров 2X изоляционного буфера на льду.Когда все депо будут собраны, используйте ножницы, чтобы аккуратно изрезать каждое депо четыре-шесть раз непосредственно внутри трубок и добавить 50 микролитров коллагеназы 10X в буфере изоляции 2X в каждую трубку. Затем быстро переверняйте трубки, чтобы перемешать и поместить ткани в смеситель с контролируемой температурой в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия и 1400 оборотах в минуту. В конце пищеварения поместите трубки обратно на лед и отфильтруйте пищеварительные ткани через 100-микронные клеточные ситечики в новые 50-миллилитровые трубки.Чтобы максимизировать выход ячейки, промойте каждую трубку одним миллилитром изоляционного вещества и фильтруйте эту промывку через ситечко. Разбавляют бурые и белые растворы жировой ткани до двух миллилитров тканевой суспензии на лунку на депо в свежей изоляционной среде. Затем накладываем два миллилитра суспензии белой жировой ткани в каждую из четырех-шести лунок и два миллилитра суспензии бурой жировой ткани в каждую из двух-трех лунок шестищелочной пластины через один 100-микрон фильтр на лунку.Когда все клетки будут покрыты, поместите пластину в инкубатор клеточной культуры на 60-90 минут. В конце инкубации промыть каждую лунку двумя миллилитрами безымянного носителя и осторожно перемешать пластину, чтобы отсоединить любые клетки крови от дна лунок. После трех промывок добавить в лунки два миллилитра свежей изоляционной среды и вернуть пластину в инкубатор клеточных культур.Когда клетки достигнут слияния от 80 до 90%, покрывать новые тарелки назначения стерильным 0,1% желатина в дистиллированной воде при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут. Пока пластины инкубируются, промыть клетки PBS перед обработкой трипсином в течение трех минут в инкубаторе клеточной культуры. Когда клетки отсоединяются, пипетка клеточной суспензии несколько раз, чтобы максимизировать восстановление клеток и перенести клетки в новую трубку.Когда все клетки будут собраны, промыть каждую лунку одним миллилитром изоляционного средства и вытащить промывки с клеточной суспензией. Соберите ячейки путем центрифугирования и повторно суспендировать гранулу в трех-пяти миллилитрах изоляционной среды для подсчета. Разбавьте клетки до соответствующей концентрации для нанесения покрытия в свежей изоляционной среде и промыть пластины с желатиновым покрытием PBS, чтобы удалить избыток желатина.Затем посейте клетки на пластины, покрытые желатином, и верните клетки в инкубатор клеточной культуры. Когда клетки достигнут слияния, замените изоляционную среду средой дифференцировки. При дифференциации преадипоцитов бурой жировой ткани добавляют также один наномолярный трийодтиронин.Через 48 часов обновите среду соответствующим объемом поддерживающей среды на культуру. В это время скопление мелких капель жидкости внутри клеток должно стать видимым при ярко-полевой микроскопии. Даже после фильтрации некоторые клеточные обломки и клетки крови остаются внутри клеточной суспензии.Мягкие промывки через час после покрытия удаляют нерелевантные клетки, поскольку преадипоциты быстро прикрепляются к дну колодца. Хотя как белые, так и коричневые преадипоциты, выделенные из новорожденных щенков, обладают высокой пролиферативной способностью, выход белых преадипоцитов, как правило, в два раза выше, чем у коричневых преадипоцитов на основе депо. Поэтому, если желательны синхронизированные культуры, эта начальная плотность белых преадипоцитов должна быть рассчитана соответствующим образом.В конце дифференцировки клетки будут казаться загруженными липидными каплями и будут экспрессировать классические маркеры белых и коричневых адипоцитов соответственно. При данном сравнительном анализе потребления кислорода в митохондриальном стресс-тесте первичных белых и коричневых адипоцитов в базальных условиях, а также в ответ на известные стимуляторы митохондриальной функции можно наблюдать эти специфические биоэнергетические возможности каждого типа клеток. Помните, что мы изолируем живые клетки и хотим культивировать их в течение нескольких дней.Поэтому обязательно поддерживайте стерильные условия во время изоляции, чтобы избежать загрязнения, которое может поставить под угрозу последующую культуру. Этот метод генерирует полностью зрелые адипоциты, которые могут быть использованы для различных применений, включая функциональные анализы, генетические или химические скрининги или профилирование омики для изучения клеточных автономных механизмов, которые влияют на функцию адипоцитов.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

Первичные культуры нейронов гиппокампа от P0 новорожденных крыс

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Выделение иммунных клеток из первичной опухоли

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Наивные стволовых клеток взрослых Изоляция от первичных человеческих культурах фибробластов

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Дифференциация новорожденных кожи мышей стволовые клетки в зародышевые-подобных клеток<em&gt; В пробирке</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Выделение первичных Миофибробласты из мышиных и человеческих ткань толстой кишки

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Изоляция и культура кератиноцитов первичной мыши от кожи новорожденных и взрослых мышей

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Изоляция, характеристика и дифференцировка сердца стволовых клеток от сердца взрослого мыши

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Изоляция, очищение, и дифференциация Остеокласт прекурсоров из костного мозга крысы

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Изоляция и культура первичных аортальных эндотелиальных клеток от миниатюрных свиней

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Unveiling Inflammatory Arthritis&#58; Exploring Functions of Synovial Cells

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue (Video) | JoVE 

Выделение и культивирование первичных синовиальных макрофагов и фибробластов из ткани мышиного артрита

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...