Name: isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice
Uploaded: 2021-01-25T14:00:00
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Los autores agradecen a Cristina Godio en el Centro Nacional de Biotecnología en Madrid, España, Mari Gantner en el Scripps Research Institute, La Jolla, y Anastasia Kralli en la Universidad Johns Hopkins, Baltimore, por la ayuda para optimizar este protocolo basado en el trabajo inicial de Kahn et al.18. Este trabajo fue financiado por las subvenciones DK114785 y DK121196 de los NIH a E.S.

Este protocolo sigue todas las directrices de la IACUC del Instituto de Investigación Scripps y la Facultad de Medicina y Salud Pública de la Universidad de Wisconsin – Madison.
1. Recolección y digestión de depósitos adiposos (día 1)
<ol><li>Prepare dos tubos de 1,5 mL para cada cachorro: uno para el tejido adiposo marrón (BAT) y otro para el tejido adiposo blanco (WAT). Agregue 250 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) + 200 μL de tampón de aislamiento 2x (123 mM d...

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>McGarry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Banting+lecture+2001:+Dysregulation+of+fatty+acid+metabolism+in+the+etiology+of+type+2+diabetes.">Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes.</a> Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).</li><li>Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+adipose+tissue+in+the+treatment+of+obesity-associated+diabetes.">Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).</li><li>Waki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+molecule+harmine+is+an+antidiabetic+cell-type-specific+regulator+of+PPARgamma+expression.">The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression.</a> Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).</li><li>Dominguez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+phenotypic+and+activity-based+profiling+links+Ces3+to+obesity+and+diabetes.">Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes.</a> Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).</li><li>Galmozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThermoMouse:+an+in+vivo+model+to+identify+modulators+of+UCP1+expression+in+brown+adipose+tissue.">ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue.</a> Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV4+is+a+regulator+of+adipose+oxidative+metabolism,+inflammation,+and+energy+homeostasis.">TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis.</a> Cell. 151 (1), 96-110 (2012).</li><li>Lynes, M. D., Tseng, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+adipose+tissue+heterogeneity.">Deciphering adipose tissue heterogeneity.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1411 (1), 5-20 (2018).</li><li>Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+adipose+tissue+in+development+and+metabolic+function.">Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function.</a> Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958 (2018).</li><li>Sponton, C. H., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+roles+of+beige+fat+in+energy+homeostasis+beyond+UCP1.">Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1.</a> Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).</li><li>Gao, W., Kong, X., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+primary+culture,+and+differentiation+of+preadipocytes+from+mouse+brown+adipose+tissue.">Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).</li><li>Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+murine+primary+brown/beige+preadipocytes.">Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes.</a> Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).</li><li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+preadipocytes+from+rodent+white+adipose+tissue.">Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).</li><li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122 (1), 133-143 (2005).</li><li>Spalding, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fat+cell+turnover+in+humans.">Dynamics of fat cell turnover in humans.</a> Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).</li><li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+adipogenesis+during+white+adipose+tissue+development,+expansion+and+regeneration.">Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).</li><li>Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+brown+fat+preadipocytes.">Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes.</a> Sprotocols. , (2014).</li><li>Mills, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+succinate+controls+activation+of+adipose+tissue+thermogenesis.">Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis.</a> Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).</li><li>Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+and+beige+fat:+physiological+roles+beyond+heat+generation.">Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).</li><li>Pydi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+&#946;-arrestin-2+is+essential+for+maintaining+whole+body+glucose+and+energy+homeostasis.">Adipocyte &#946;-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis.</a> Nature Communications. 10 (1), 2936 (2019).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=snRNA-seq+reveals+a+subpopulation+of+adipocytes+that+regulates+thermogenesis.">snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis.</a> Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).</li><li>Galmozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGRMC2+is+an+intracellular+haem+chaperone+critical+for+adipocyte+function.">PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function.</a> Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).</li><li>Brown, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-related+receptors+mediate+the+adaptive+response+of+brown+adipose+tissue+to+adrenergic+stimulation.">Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation.</a> iScience. 2, 221-237 (2018).</li><li>Shinoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+functional+characterization+of+clonally+derived+adult+human+brown+adipocytes.">Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes.</a> Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).</li><li>Wang, Q. A., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AdipoChaser+mouse:+A+model+tracking+adipogenesis+in+vivo.">The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo.</a> Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).</li></ol>

El tejido adiposo es crítico para la sensibilidad sistémica a la insulina y la homeostasis de la glucosa20. la disfunción obesidad-ligada del adipocyte se asocia firmemente al inicio del tipo - diabetes 2. Por lo tanto, una mayor comprensión de la biología y de la fisiología básicas del tejido adiposo puede permitir el diseño de nuevos tratamientos para los desordenes metabólicos. Como complemento al análisis funcional y transcripcional directo de adipocitos maduros aislados de depósito...

La obesidad resulta de un desequilibrio crónico entre la toma de energía y el gasto energético. A medida que se desarrolla la obesidad, los adipocitos blancos experimentan una expansión masiva en el tamaño celular que resulta en hipoxia en el microambiente, muerte celular, inflamación y resistencia a la insulina1. Los adipocitos hipertrofiados disfuncionales no pueden almacenar adecuadamente el exceso de lípidos, que se acumulan en cambio en otros tejidos donde amortiguan la acción de la insulina2,3. Los agentes que mejoran la función del adipocyte y restauran el lípido normal que repique entre tejidos se predicen para ser beneficiosos para el tratamiento de las condiciones obesidad-asociadas caracterizadas por resistencia a la insulina tal como tipo - diabetes 2. Las pantallas fenotípicas en adipocitos utilizando líneas celulares inmortalizadas, como 3T3-L1, F442A y 10T 1/2, han demostrado ser útiles para identificar factores genéticos que regulan la adipogénesis y aislar moléculas pro-adipógenas con propiedades antidiabéticas4,5,6,7. Estas líneas celulares, sin embargo, no reflejan completamente la heterogeneidad de los tipos celulares presentes en los depósitos adiposos, que incluye subtipos blancos, marrones, beige y otros adipocitos con características únicas, todos los cuales contribuyen a la homeostasis sistémica8,9,10. Además, las variedades de células cultivadas muestran a menudo una respuesta disminuida a los estímulos externos.
En cambio, las culturas de adipocytes primarios recapitulan más exactamente la complejidad del adipogenesis in vivo, y los adipocytes primarios demuestran respuestas funcionales robustas. Los preadipocitos primarios se aíslan típicamente de la fracción vascular del estroma de los depósitos adiposos de ratones adultos11,12,13,14. Sin embargo, debido a que los depósitos adiposos de animales adultos consisten principalmente en adipocitos completamente maduros que tienen una tasa de rotación muy lenta15,16,17,este enfoque produce una cantidad limitada de preadipocitos con una baja tasa de proliferación. Por lo tanto, el aislamiento de preadipocytes de ratones recién nacidos es preferible obtener las cantidades grandes de células de rápido crecimiento que se puedan distinguir in vitro. Aquí se ha descrito un protocolo, inspirado en el trabajo inicial con adipocitos primarios marrones de Kahn et al.18 para aislar eficientemente preadipocitos blancos y marrones que pueden ser expandidos y diferenciados in vitro en adipocitos primarios completamente funcionales(Figura 1A). La ventaja de aislar las células primarias de los recién nacidos, a diferencia de los ratones adultos, es que los depósitos adiposos están creciendo rápidamente y, por lo tanto, son una rica fuente de preadipocitos que proliferan activamente17. Las células aisladas usando este protocolo tienen alta capacidad proliferativa, permitiendo el escalado rápido de culturas. Además, los preadipocitos de crías recién nacidas muestran un mayor potencial de diferenciación que los progenitores adultos, lo que reduce la variabilidad de pozo a pozo en el grado de diferenciación y, por lo tanto, aumenta la reproducibilidad.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdipoRed (Nile Red)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bioproducts LLC</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1&#160;&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td>For Bioenergetics studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose, Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid-Free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norepinephrine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>557368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>For Bioenergetics studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>T1317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triiodothyronine (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>642511</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice

La comprensión de los mecanismos que son la base de la diferenciación y de la función del adipocyte se ha beneficiado grandemente del uso de las variedades de células blancas inmortalizadas del preadipocyte. Estas variedades de células cultivadas, sin embargo, tienen limitaciones. No capturan completamente el espectro funcional diverso de las poblaciones heterogéneas del adipocyte que ahora se saben para existir dentro de depósitos adiposos blancos. Para proporcionar un modelo más fisiológicamente relevante para estudiar la complejidad del tejido adiposo blanco, se ha desarrollado y optimizado un protocolo para permitir el aislamiento simultáneo de progenitores primarios de adipocitos blancos y marrones de ratones recién nacidos, su rápida expansión en cultivo y su diferenciación in vitro en adipocitos maduros y completamente funcionales. La principal ventaja de aislar las células primarias de los recién nacidos, en lugar de ratones adultos, es que los depósitos adiposos se están desarrollando activamente y son, por lo tanto, una rica fuente de preadipocitos proliferantes. Los preadipocitos primarios aislados mediante este protocolo se diferencian rápidamente al alcanzar la confluencia y se vuelven completamente maduros en 4-5 días, una ventana temporal que refleja con precisión la aparición de almohadillas de grasa desarrolladas en ratones recién nacidos. Los cultivos primarios preparados con esta estrategia pueden ampliarse y estudiarse con alta reproducibilidad, lo que los hace adecuados para pantallas genéticas y fenotípicas y permite el estudio de los fenotipos de adipocitos autónomos celulares de los modelos genéticos de ratón. Este protocolo ofrece un acercamiento simple, rápido, y barato para estudiar la complejidad del tejido adiposo in vitro.

La sección 1 del protocolo producirá una suspensión heterogénea de células que son visibles bajo un microscopio de luz estándar. El filtrado de tejidos digeridos con un colador celular (sección 2) eliminará el tejido no digerido. Sin embargo, algunos desechos celulares, células sanguíneas y adipocitos maduros pasarán a través de (Figura 1C). Los lavados suaves 1 h después del revestimiento eliminarán las células no relevantes, ya que los preadi...

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Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

Este informe describe un protocolo para el aislamiento simultáneo de preadipocytes marrones y blancos primarios de ratones recién nacidos. Las células aisladas se pueden cultivar en cultivo e inducir a diferenciarse en adipocitos blancos y marrones completamente maduros. El método permite la caracterización genética, molecular y funcional de las células de grasa primarias en cultivo.

Aislamiento Y Diferenciación De Preadipocitos Blancos Y Marrones Primarios De Ratones Recién Nacidos

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Este protocolo proporciona una estrategia sencilla para generar modelos de cultivo celular de adipocitos blancos y marrones que recapitulan fielmente in vitro, la fisiología del tejido adiposo que tenemos in vivo. Este protocolo permite el aislamiento simultáneo de preadipocitos blancos y marrones de ratones recién nacidos y las células que aislamos mediante este método evalúan la alta capacidad proliferativa y el potencial de diferenciación. Las células aisladas usando este acercamiento reflejan la complejidad del tejido adiposo mejor que otros modelos de la cultura.Y se puede utilizar para estudiar con mayor precisión la función de los adipocitos en la obesidad y la diabetes. Nos centramos principalmente en la comprensión de la disfunción del tejido adiposo en la obesidad. Sin embargo, las células preparadas con este método también se pueden utilizar para estudiar preguntas básicas sobre la célula en la biología del desarrollo.La clave para un experimento exitoso es determinar cómo identificar los depósitos adiposos blancos como estos depósitos, que son pequeños, pero muy ricos y proliferando preadipocitos puede ser difícil de distinguir en cachorros. La demostración visual ilustra lo simple que es este protocolo y permite la provisión de consejos para localizar y diseccionar los depósitos adiposos blancos y marrones. Ver el aislamiento del depósito es muy útil.Para recolectar tejido adiposo blanco subcutáneo, corte la piel alrededor del abdomen de un cachorro recién nacido eutanásico y tire suavemente de la piel debajo de las piernas. Sin recoger ningún tejido de la piel, cosechar cuidadosamente el depósito de grasa, que aparecerá como un tejido alargado claro o blanco, delgado unido al interior de la piel o en la parte superior del cuádriceps. Enjuague el depósito cosechado en PBS y coloque el tejido adiposo en un tubo de 1,5 mililitros que contenga 250 microlitros de PBS y 200 microlitros de tampón de aislamiento 2X sobre hielo.Para recolectar tejido adiposo marrón interescapular, tire de la piel de los omóplatos sobre la cabeza y levante el tejido adiposo marrón rojo profundo ubicado entre los omóplatos. Haga incisiones cuidadosamente alrededor del adiposo para separarlo del cuerpo y revise la consistencia y el color del tejido. Después del enjuague, coloque el tejido en un segundo tubo de 1,5 mililitros que contenga 250 microlitros de PBS y 200 microlitros de tampón de aislamiento 2X sobre hielo.Cuando todos los depósitos hayan sido recolectados, use tijeras para picar suavemente cada depósito de cuatro a seis veces directamente dentro de los tubos y agregue 50 microlitros de colagenasa 10X en un tampón de aislamiento 2X a cada tubo. Luego invierta los tubos rápidamente para mezclar y colocar los tejidos en un mezclador de temperatura controlada durante 30 minutos a 37 grados Celsius y 1400 revoluciones por minuto. Al final de la digestión, coloque los tubos de nuevo en el hielo y filtrar los tejidos digestivos a través de coladores de células de 100 micras en nuevos tubos de 50 mililitros.Para maximizar el rendimiento celular, enjuague cada tubo con un mililitro de medio de aislamiento y filtre este lavado a través del colador. Diluya las soluciones de tejido adiposo marrón y blanco a dos mililitros de suspensión de tejido por pozo por depósito en medio de aislamiento fresco. Luego platee dos mililitros de suspensión de tejido adiposo blanco a cada uno de cuatro a seis pozos y dos mililitros de suspensión de tejido adiposo marrón a cada uno de dos a tres pozos de una placa de seis pozos a través de un filtro de 100 micras por pozo.Cuando todas las células hayan sido plateadas, coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante 60 a 90 minutos. Al final de la incubación, lave cada pozo con dos mililitros de medio sin suero y agite suavemente la placa para separar cualquier célula sanguínea del fondo de los pozos. Después de tres lavados, agregue dos mililitros de medio de aislamiento fresco a los pozos y devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular.Cuando las células alcancen de 80 a 90% de confluencia, recubre las nuevas placas de destino con gelatina estéril al 0,1% en agua destilada a 37 grados Celsius durante 10 minutos. Mientras las placas están incubando, lave las células con PBS antes de tratar con tripsina durante tres minutos en la incubadora de cultivo celular. Cuando las células se han desprendido, pipetee la suspensión de la célula varias veces para maximizar la recuperación de la célula y transferir las células a un nuevo tubo.Cuando se hayan recogido todas las células, lave cada pozo con un mililitro de medio de aislamiento y tire de los lavados con la suspensión celular. Recoger las células por centrifugación y resuspend el pellet en tres a cinco mililitros de medio de aislamiento para el recuento. Diluya las células a la concentración adecuada para el revestimiento en medio de aislamiento fresco y lave las placas recubiertas de gelatina con PBS para eliminar cualquier exceso de gelatina.Luego sembra las células en las placas recubiertas de gelatina y devuelve las células a la incubadora de cultivo celular. Cuando las células alcancen la confluencia, substituya el medio de aislamiento por un medio de diferenciación. Si diferencia los preadipocitos de tejido adiposo marrón, agregue también una triyodotironina nanomolar.Después de 48 horas, actualice el medio con el volumen adecuado de medio de mantenimiento por cultivo. En este momento, la acumulación de pequeñas gotas de líquido dentro de las células debe hacerse visible bajo microscopía de campo brillante. Incluso después del filtrado, algunos desechos celulares y células sanguíneas permanecen dentro de la suspensión celular.Los lavados suaves una hora después del revestimiento eliminarán las células no relevantes, ya que los preadipocitos se unen rápidamente al fondo del pozo. Aunque los preadipocitos blancos y marrones aislados de crías recién nacidas tienen una alta capacidad proliferativa, el rendimiento de los preadipocitos blancos es generalmente el doble que el de los preadipocitos marrones por depósito. Por lo tanto, si se desean culturas sincronizadas, esta densidad inicial de los preadipocytes blancos se debe calcular por consiguiente.Al final de la diferenciación, las células aparecerán estar cargadas con gotitas de lípidos y expresarán marcadores clásicos de adipocitos blancos y marrones, respectivamente. En este análisis comparativo del consumo de oxígeno en una prueba de esfuerzo mitocondrial de adipocitos primarios blancos y marrones en condiciones basales, así como en respuesta a estimuladores conocidos de la función mitocondrial, se puede observar esta capacidad bioenergética específica de cada tipo celular. Recuerda que estamos aislando células vivas y que queremos cultivarlas durante varios días.Así que asegúrese de mantener condiciones estériles durante el aislamiento para evitar la contaminación, que puede comprometer el cultivo posterior. Este método genera adipocitos completamente maduros que se pueden utilizar para diferentes aplicaciones, incluyendo ensayos funcionales, pantallas genéticas o químicas, o perfiles ómicos para estudiar los mecanismos autónomos de las células que afectan la función de los adipocitos.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

Cultivo primario de neuronas del hipocampo de ratas recién nacidas P0

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Investigación

Biología

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

El aislamiento de las células inmunes de tumores primarios

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naïve Adult Stem Cells Aislamiento de Primaria cultivos de fibroblastos humanos

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

La diferenciación de ratón recién nacido piel derivados de las células madre en células germinales-como<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Aislamiento de Miofibroblastos primarias de ratón y el tejido del colon humano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Aislamiento y cultivo de queratinocitos de ratón primario de piel de ratón neonatal y adulto

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Aislamiento, caracterización y diferenciación de células cardiacas desde el corazón de ratón adulto

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Aislamiento, purificación y diferenciación de los precursores de osteoclastos de la médula ósea de rata

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Aislamiento y cultivo de células endoteliales aórticas primarias de cerdos en miniatura

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Unveiling Inflammatory Arthritis&#58; Exploring Functions of Synovial Cells

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue (Video) | JoVE 

Aislamiento y cultivo de macrófagos sinoviales primarios y fibroblastos a partir de tejido murino de artritis

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...