Name: isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice
Uploaded: 2021-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice at JoVE.com

Författarna är tacksamma mot Cristina Godio vid Centro Nacional de Biotecnología i Madrid, Spanien, Mari Gantner vid The Scripps Research Institute, La Jolla, och Anastasia Kralli vid Johns Hopkins University, Baltimore, för hjälp med att optimera detta protokoll baserat på kahn et al.18. Detta arbete finansierades av NIH-bidrag DK114785 och DK121196 till E.S.

Detta protokoll följer alla IACUC-riktlinjer från The Scripps Research Institute och University of Wisconsin - Madison School of Medicine and Public Health.
1. Insamling och nedsmältning av fettdepåer (dag 1)
<ol><li>Förbered två 1,5 ml-rör för varje valp: ett för brun fettvävnad (BAT) och ett för vit fettvävnad (WAT). Tillsätt 250 μL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) + 200 μL 2x isoleringsbuffert (123 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM CaCl2,5 mM glukos, 100 mM 4-(2-hydroxye...

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>McGarry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Banting+lecture+2001:+Dysregulation+of+fatty+acid+metabolism+in+the+etiology+of+type+2+diabetes.">Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes.</a> Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).</li><li>Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+adipose+tissue+in+the+treatment+of+obesity-associated+diabetes.">Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).</li><li>Waki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+molecule+harmine+is+an+antidiabetic+cell-type-specific+regulator+of+PPARgamma+expression.">The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression.</a> Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).</li><li>Dominguez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+phenotypic+and+activity-based+profiling+links+Ces3+to+obesity+and+diabetes.">Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes.</a> Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).</li><li>Galmozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThermoMouse:+an+in+vivo+model+to+identify+modulators+of+UCP1+expression+in+brown+adipose+tissue.">ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue.</a> Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV4+is+a+regulator+of+adipose+oxidative+metabolism,+inflammation,+and+energy+homeostasis.">TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis.</a> Cell. 151 (1), 96-110 (2012).</li><li>Lynes, M. D., Tseng, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+adipose+tissue+heterogeneity.">Deciphering adipose tissue heterogeneity.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1411 (1), 5-20 (2018).</li><li>Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+adipose+tissue+in+development+and+metabolic+function.">Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function.</a> Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958 (2018).</li><li>Sponton, C. H., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+roles+of+beige+fat+in+energy+homeostasis+beyond+UCP1.">Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1.</a> Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).</li><li>Gao, W., Kong, X., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+primary+culture,+and+differentiation+of+preadipocytes+from+mouse+brown+adipose+tissue.">Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).</li><li>Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+murine+primary+brown/beige+preadipocytes.">Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes.</a> Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).</li><li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+preadipocytes+from+rodent+white+adipose+tissue.">Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).</li><li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122 (1), 133-143 (2005).</li><li>Spalding, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fat+cell+turnover+in+humans.">Dynamics of fat cell turnover in humans.</a> Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).</li><li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+adipogenesis+during+white+adipose+tissue+development,+expansion+and+regeneration.">Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).</li><li>Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+brown+fat+preadipocytes.">Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes.</a> Sprotocols. , (2014).</li><li>Mills, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+succinate+controls+activation+of+adipose+tissue+thermogenesis.">Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis.</a> Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).</li><li>Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+and+beige+fat:+physiological+roles+beyond+heat+generation.">Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).</li><li>Pydi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+&#946;-arrestin-2+is+essential+for+maintaining+whole+body+glucose+and+energy+homeostasis.">Adipocyte &#946;-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis.</a> Nature Communications. 10 (1), 2936 (2019).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=snRNA-seq+reveals+a+subpopulation+of+adipocytes+that+regulates+thermogenesis.">snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis.</a> Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).</li><li>Galmozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGRMC2+is+an+intracellular+haem+chaperone+critical+for+adipocyte+function.">PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function.</a> Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).</li><li>Brown, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-related+receptors+mediate+the+adaptive+response+of+brown+adipose+tissue+to+adrenergic+stimulation.">Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation.</a> iScience. 2, 221-237 (2018).</li><li>Shinoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+functional+characterization+of+clonally+derived+adult+human+brown+adipocytes.">Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes.</a> Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).</li><li>Wang, Q. A., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AdipoChaser+mouse:+A+model+tracking+adipogenesis+in+vivo.">The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo.</a> Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).</li></ol>

Fettvävnad är avgörande för systemisk insulinkänslighet och glukoshomeostas20. Fetma-kopplade adipocyte dysfunktion är tätt associerad med uppkomsten av typ 2 diabetes. Därför kan större förståelse för fettvävnadens grundläggande biologi och fysiologi möjliggöra utformningen av nya behandlingar för metabola störningar. Som ett komplement till direkt funktionell och transkriptionell analys av mogna adipocyter isolerade frånfettdepåer 21,<sup c...

Fetma är ett resultat av en kronisk obalans mellan energiintag och energiförbrukning. När fetma utvecklas genomgår vita adipocyter en massiv expansion i cellstorlek som resulterar i hypoxi i mikromiljön, celldöd, inflammation och insulinresistens1. Dysfunktionella, hypertrofierade adipocyter kan inte korrekt lagra överflödiga lipider, som ackumuleras istället i andra vävnader där de dämparinsulinåtgärden 2,3. Medel som förbättrar adipocyte funktion och återställa normala lipid partitionering bland vävnader förutspås vara fördelaktigt för behandling av fetma-associerade villkor som kännetecknas av insulinresistens såsom typ 2 diabetes. Fenotypiska skärmar i adipocyter med hjälp av odödliga cellinjer, såsom 3T3-L1, F442A och 10T 1/2, har visat sig vara användbara för att identifiera genetiska faktorer som reglerar adipogenes och för att isolera pro-adipogenic molekyler med anti-diabetiker egenskaper4,5,6,7. Dessa cellinjer återspeglar dock inte helt heterogeniteten hos celltyper som finns i fettdepåer, vilket inkluderar vita, bruna, beige och andra adipocytundertyper med unika egenskaper, som alla bidrar till systemisk homeostas8,9,10. Vidare visar odlade cellinjer ofta ett minskat svar på yttre stimuli.
Däremot rekapitulerar kulturer av primära adipocyter mer exakt komplexiteten i in vivo adipogenesis, och primära adipocyter visar robusta funktionella svar. Primära preadipocyter isoleras vanligtvis från den stromala vaskulär fraktionen av fettdepåer av vuxna möss11,12,13,14. Men eftersom fettdepåerna hos vuxna djur huvudsakligen består av fullt mogna adipocyter som har en mycket långsamomsättningshastighet 15,16,17, ger detta tillvägagångssätt en begränsad mängd preadipocyter med låg spridningshastighet. Därför är isolering av preadipocyter från nyfödda möss att föredra för att få stora mängder snabbt växande celler som kan differentieras in vitro. Här har ett protokoll beskrivits, inspirerat av det inledande arbetet med primära bruna adipocyter av Kahn et al.18 för att effektivt isolera både vita och bruna preadipocyter som kan utvidgas och differentieras in vitro till fullt fungerande primära adipocyter (Figur 1A). Fördelen med att isolera primära celler från nyfödda, i motsats till vuxna möss, är att fettdepåerna växer snabbt och därmed är en rik källa till aktivt prolifererande preadipocyter17. Celler som isoleras med detta protokoll har hög proliferativ kapacitet, vilket möjliggör snabb uppskalning av kulturer. Dessutom uppvisar preadipocyter från nyfödda valpar högre differentieringspotential än vuxna stamceller, vilket minskar välbefinnandet i differentieringsens omfattning och därmed ökar reproducerbarheten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdipoRed (Nile Red)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bioproducts LLC</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1&#160;&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td>For Bioenergetics studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose, Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid-Free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norepinephrine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>557368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>For Bioenergetics studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>T1317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triiodothyronine (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>642511</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice

Förståelsen av mekanismerna bakom adipocyte differentiering och funktion har i hög grad gynnats av användningen av odödliga vita preadipocyte cellinjer. Dessa odlade cellinjer har dock begränsningar. De fångar inte helt det olika funktionella spektrumet av de heterogena adipocytpopulationerna som nu är kända för att existera inom vita fettdepåer. För att ge en mer fysiologiskt relevant modell för att studera komplexiteten hos vit fettvävnad har ett protokoll utvecklats och optimerats för att möjliggöra samtidig isolering av primära vita och bruna adipocyt-stamceller från nyfödda möss, deras snabba expansion i kulturen och deras differentiering in vitro till mogna, fullt funktionella adipocyter. Den främsta fördelen med att isolera primära celler från nyfödda, snarare än vuxna möss, är att fettdepåerna aktivt utvecklas och därför är en rik källa till prolifererande preadipocyter. Primära preadipocytes isolerade med detta protokoll skiljer sig snabbt när du når sammanflöde och blir helt mogen i 4-5 dagar, ett tidsmässigt fönster som exakt återspeglar utseendet på utvecklade fettkuddar hos nyfödda möss. Primära kulturer som utarbetas med hjälp av denna strategi kan utökas och studeras med hög reproducerbarhet, vilket gör dem lämpliga för genetiska och fenotypiska skärmar och möjliggör studier av cellautonoma adipocyte fenotyper av genetiska musmodeller. Detta protokoll erbjuder ett enkelt, snabbt och billigt tillvägagångssätt för att studera komplexiteten hos fettvävnad in vitro.

Avsnitt 1 i protokollet kommer att ge en heterogen suspension av celler som är synliga under ett standardljusmikroskop. Filtrering av smälta vävnader med cellsil (avsnitt 2) tar bort osmält vävnad. Vissa cellulära skräp, blodkroppar och mogna adipocyter kommer dock att passera (Figur 1C). Skonsamma tvättar 1 timme efter plätering tar bort icke-relevanta celler eftersom preadipocyter fästs snabbt på brunnens botten(figur 1C).</s...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice at JoVE.com

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

Denna rapport beskriver ett protokoll för samtidig isolering av primära bruna och vita preadipocytes från nyfödda möss. Isolerade celler kan odlas i kultur och induceras för att skilja sig åt i fullt mogna vita och bruna adipocyter. Metoden möjliggör genetisk, molekylär och funktionell karakterisering av primära fettceller i kulturen.

Isolering och differentiering av primära vita och bruna preadipocyter från nyfödda möss

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Detta protokoll ger en enkel strategi för att generera cellkulturella modeller av vita och bruna adipocyter som troget rekapitulerar in vitro, fysiologin hos fettvävnaden som vi har in vivo. Detta protokoll möjliggör samtidig isolering av både vita och bruna preadipocyter från nyfödda möss och de celler som vi isolerar med denna metod bedömer hög proliferativ kapacitet och differentieringspotential. Celler som isoleras med detta tillvägagångssätt återspeglar komplexiteten hos fettvävnad bättre än andra odlingsmodeller.Och det kan användas för att mer exakt studera adipocyte funktion i fetma och diabetes. Vi fokuserar främst på att förstå fettvävnad dysfunktion i fetma. Men celler som är beredda med denna metod kan också användas för att studera grundläggande frågor om cell i utvecklingsbiologi.Nyckeln till ett framgångsrikt experiment är att bestämma hur man identifierar de vita fettdepåerna som dessa depåer, som är små, men mycket rika och prolifererande preadipocyter kan vara svåra att skilja hos valpar. Visuell demonstration illustrerar hur enkelt detta protokoll är och tillåter tillhandahållande av tips för att lokalisera och dissekera de vita och bruna fettdepåerna. Att se depåisoleringen är till stor hjälp.För att samla subkutan vit fettvävnad, skär huden runt buken på en avlivad nyfödd valp och dra försiktigt huden under benen. Utan att samla någon hudvävnad, skörda försiktigt fettdepån, som kommer att visas som en klar eller vit, tunn långsträckt vävnad fäst på insidan av huden eller ovanpå quadriceps. Skölj den skördade depån i PBS och placera fettvävnaden i ett 1,5 milliliter rör som innehåller 250 mikroliter PBS och 200 mikroliter 2X isoleringsbuffert på is.För att samla in interscapular brun fettvävnad, dra huden från axelbladen över huvudet och lyft den djupröda bruna fettvävnaden som ligger mellan axelbladen. Gör försiktigt snitt runt fettet för att lossa det från kroppen och kontrollera vävnaden för konsistens och färg. Efter sköljning, placera vävnaden i ett andra 1,5 milliliter rör som innehåller 250 mikroliter PBS och 200 mikroliter 2X isoleringsbuffert på is.När alla depåer har samlats in, använd sax för att försiktigt hacka varje depå fyra till sex gånger direkt inuti rören och tillsätt 50 mikroliter 10X kollagenas i 2X isoleringsbuffert till varje rör. Vänd sedan rören snabbt för att blanda och placera vävnaderna i en temperaturstyrd mixer i 30 minuter vid 37 grader Celsius och 1400 varv per minut. I slutet av matsmältningen, placera rören tillbaka på is och filtrera matsmältningsvävnaderna genom 100 mikroncellssilar i nya 50 milliliter rör.För att maximera cellutbytet, skölj varje rör med en milliliter isoleringsmedium och filtrera denna tvätt genom silen. Späd ut de bruna och vita fettvävnadslösningarna till två milliliter vävnadssuspension per brunn per depå i färskt isoleringsmedium. Plätera sedan två milliliter vit fettvävnadsupphängning till var och en av fyra till sex brunnar och två milliliter brun fettvävnadsupphängning till var och en av två till tre brunnar av en sex brunnsplatta genom ett 100 mikronfilter per brunn.När alla celler har pläterats, placera plattan i cellkulturinkubatorn i 60 till 90 minuter. I slutet av inkubationen, tvätta varje brunn med två milliliter serumfritt medium och rör försiktigt om plattan för att lossa eventuella blodkroppar från brunnens botten. Efter tre tvättar, tillsätt två milliliter färskt isoleringsmedium till brunnarna och sätt tillbaka plattan till cellkulturinkubatorn.När cellerna når 80 till 90% confluency, belägga nya destinationsplattor med sterilt 0,1% gelatin i destillerat vatten vid 37 grader Celsius i 10 minuter. Medan plattorna inkuberar, tvätta cellerna med PBS innan du behandlar med trypsin i tre minuter i cellkulturinkubatorn. När cellerna har lossnat fjädringspipetten flera gånger för att maximera cellåtervinningen och överföra cellerna till ett nytt rör.När alla celler har samlats in, tvätta varje brunn med en milliliter isoleringsmedium och dra tvättarna med cellupphängningen. Samla cellerna genom centrifugation och återanvänd pelleten i tre till fem milliliter isoleringsmedium för räkning. Späd cellerna till lämplig koncentration för plätering i färskt isoleringsmedium och tvätta gelatinbelagda plattor med PBS för att avlägsna eventuellt överskott av gelatin.Så sedan cellerna på gelatinbelagda plattor och returnera cellerna till cellkulturinkubatorn. När cellerna når sammanflöde, ersätt isoleringsmediet med differentieringsmedium. Om differentiering av bruna fettvävnadspreadipocyter, tillsätt också en nanomolar trijodyronin.Efter 48 timmar, uppdatera mediet med lämplig volym underhållsmedium per kultur. Vid denna tidpunkt bör ackumuleringen av små flytande droppar i cellerna bli synlig under ljus fältmikroskopi. Även efter filtrering finns en del cellulärt skräp och blodkroppar kvar i cellupphängningen.Skonsamma tvättar en timme efter plätering tar bort icke-relevanta celler eftersom preadipocyterna fästs snabbt på botten av brunnen. Även om både vita och bruna preadipocyter isolerade från nyfödda valpar har en hög proliferativ kapacitet, är utbytet av vita preadipocyter i allmänhet dubbelt så mycket som för bruna preadipocyter per depå. Därför, om synkroniserade kulturer önskas, måste denna starttäthet av de vita preadipocyterna beräknas i enlighet därmed.I slutet av differentiering kommer cellerna att verka vara laddade med lipiddroppar och kommer att uttrycka klassiska markörer av vita respektive bruna adipocyter. I denna jämförande analys av syreförbrukningen i ett mitokondriellt stresstest av primära vita och bruna adipocyter under basala förhållanden, samt som svar på kända stimulatorer av mitokondriell funktion, kan denna specifika bioenergetiska kapacitet hos varje celltyp observeras. Kom ihåg att vi isolerar levande celler och att vi vill odla dem i flera dagar.Så var noga med att upprätthålla sterila förhållanden under isoleringen för att undvika förorening, vilket kan äventyra den efterföljande kulturen. Denna metod genererar fullt mogna adipocyter som kan användas för olika tillämpningar, inklusive funktionella analyser, genetiska eller kemiska skärmar, eller omikprofilering för att studera cellautonoma mekanismer som påverkar adipocytfunktionen.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

Primär Kultur av hippocampus nervceller från P0 nyfödda råttor

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Isolering av immunceller från primära tumörer

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naiv Vuxna stamceller Isolering från primära humana fibroblastkulturer

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiering av nyfödda mus härledda hudens stamceller i Germ-liknande celler<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolering av primära Myofibroblaster från mus och Human Colon Tissue

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolering och kultur av primära muskeratinocyter från neonatal och vuxen mushud

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolering, karakterisering och differentiering av hjärt stamceller från vuxna mus hjärtat

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Isolering, rening och differentiering av Osteoklast prekursorer från råtta benmärg

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Isolering och kultur av primära aortic endotelceller från miniatyr svin

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Unveiling Inflammatory Arthritis&#58; Exploring Functions of Synovial Cells

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue (Video) | JoVE 

Isolering och odling av primära synoviala makrofager och fibroblaster från murin artritvävnad

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...