Name: isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice
Uploaded: 2021-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice at JoVE.com

Yazarlar, Madrid, İspanya'daki Centro Nacional de Biotecnología'daki Cristina Godio'ya, Scripps Araştırma Enstitüsü'nden Mari Gantner'e, La Jolla'ya ve Baltimore Johns Hopkins Üniversitesi'nden Anastasia Kralli'ye, Kahn ve ark.18'inilk çalışmalarına dayanarak bu protokolün optimize edilmesine yardımcı oldukları için minnettarlar. Bu çalışma NIH tarafından FINANSE EdİlDİ DK114785 ve DK121196 E.S.

Bu protokol, Scripps Araştırma Enstitüsü ve Wisconsin Üniversitesi - Madison Tıp ve Halk Sağlığı Okulu'nun tüm IACUC yönergelerini takip eder.
1. Yağ depolarının toplanması ve sindirimi (gün 1)
<ol><li>Her yavru için iki adet 1,5 mL tüp hazırlayın: biri kahverengi yağ dokusu (BAT) ve diğeri beyaz yağ dokusu (WAT) için. 250 μL fosfat tamponlu salin (PBS) + 200 μL 2x izolasyon tamponu (123 mM NaCl, Her tüpe 5 mM KCl, 1.3 mM CaCl2,5 mM glikoz, 100 mM 4-(2-...

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>McGarry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Banting+lecture+2001:+Dysregulation+of+fatty+acid+metabolism+in+the+etiology+of+type+2+diabetes.">Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes.</a> Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).</li><li>Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+adipose+tissue+in+the+treatment+of+obesity-associated+diabetes.">Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).</li><li>Waki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+molecule+harmine+is+an+antidiabetic+cell-type-specific+regulator+of+PPARgamma+expression.">The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression.</a> Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).</li><li>Dominguez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+phenotypic+and+activity-based+profiling+links+Ces3+to+obesity+and+diabetes.">Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes.</a> Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).</li><li>Galmozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThermoMouse:+an+in+vivo+model+to+identify+modulators+of+UCP1+expression+in+brown+adipose+tissue.">ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue.</a> Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV4+is+a+regulator+of+adipose+oxidative+metabolism,+inflammation,+and+energy+homeostasis.">TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis.</a> Cell. 151 (1), 96-110 (2012).</li><li>Lynes, M. D., Tseng, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+adipose+tissue+heterogeneity.">Deciphering adipose tissue heterogeneity.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1411 (1), 5-20 (2018).</li><li>Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+adipose+tissue+in+development+and+metabolic+function.">Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function.</a> Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958 (2018).</li><li>Sponton, C. H., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+roles+of+beige+fat+in+energy+homeostasis+beyond+UCP1.">Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1.</a> Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).</li><li>Gao, W., Kong, X., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+primary+culture,+and+differentiation+of+preadipocytes+from+mouse+brown+adipose+tissue.">Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).</li><li>Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+murine+primary+brown/beige+preadipocytes.">Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes.</a> Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).</li><li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+preadipocytes+from+rodent+white+adipose+tissue.">Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).</li><li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122 (1), 133-143 (2005).</li><li>Spalding, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fat+cell+turnover+in+humans.">Dynamics of fat cell turnover in humans.</a> Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).</li><li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+adipogenesis+during+white+adipose+tissue+development,+expansion+and+regeneration.">Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).</li><li>Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+brown+fat+preadipocytes.">Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes.</a> Sprotocols. , (2014).</li><li>Mills, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+succinate+controls+activation+of+adipose+tissue+thermogenesis.">Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis.</a> Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).</li><li>Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+and+beige+fat:+physiological+roles+beyond+heat+generation.">Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).</li><li>Pydi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+&#946;-arrestin-2+is+essential+for+maintaining+whole+body+glucose+and+energy+homeostasis.">Adipocyte &#946;-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis.</a> Nature Communications. 10 (1), 2936 (2019).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=snRNA-seq+reveals+a+subpopulation+of+adipocytes+that+regulates+thermogenesis.">snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis.</a> Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).</li><li>Galmozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGRMC2+is+an+intracellular+haem+chaperone+critical+for+adipocyte+function.">PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function.</a> Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).</li><li>Brown, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-related+receptors+mediate+the+adaptive+response+of+brown+adipose+tissue+to+adrenergic+stimulation.">Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation.</a> iScience. 2, 221-237 (2018).</li><li>Shinoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+functional+characterization+of+clonally+derived+adult+human+brown+adipocytes.">Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes.</a> Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).</li><li>Wang, Q. A., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AdipoChaser+mouse:+A+model+tracking+adipogenesis+in+vivo.">The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo.</a> Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).</li></ol>

Yağ dokusu sistemik insülin duyarlılığı ve glikoz homeostaz için kritiktir20. Obeziteye bağlı adiposit disfonksiyonu tip 2 diyabetin başlangıcı ile sıkı bir şekilde ilişkilidir. Bu nedenle, yağ dokusunun temel biyolojisinin ve fizyolojisinin daha iyi anlaşılması metabolik bozukluklar için yeni tedavilerin tasarlanmasını sağlayabilir. Yağ depolarından izole olgun adipositlerin doğrudan fonksiyonel ve transkripsiyonel analizinin tamamlayıcısı olarak21<...

Obezite, enerji alımı ve enerji harcaması arasındaki kronik dengesizlikten kaynaklanır. Obezite geliştikçe, beyaz adipositler hücre boyutunda mikroçevrimde hipoksi, hücre ölümü, iltihaplanma ve insülin direnci ile sonuçlanan büyük bir genişlemeye uğrar1. İşlevsel olmayan, hipertrofiked adipositler, insülin eylemini sönümledikleri diğer dokularda biriken fazla lipitleri düzgün bir şekildedepolayamazlar 2,3. Adiposit fonksiyonunu iyileştiren ve dokular arasında normal lipid bölünmesini geri kazandıran ajanların tip 2 diyabet gibi insülin direnci ile karakterize obezite ile ilişkili durumların tedavisi için faydalı olacağı öngörülmektedir. 3T3-L1, F442A ve 10T 1/2 gibi ölümsüzleştirilmiş hücre hatları kullanan adipositlerdeki fenotipik ekranlar, adipogenez düzenleyen genetik faktörleri tanımlamak ve anti-diyabetik özelliklere sahip anti-adipojenik molekülleri izole etmek için yararlı olduğu kanıtlanmıştır4,5,6,7. Bununla birlikte, bu hücre çizgileri, hepsi sistemik homeostaz 8 ,9,10'akatkıda bulunan benzersiz özelliklere sahip beyaz, kahverengi, bej ve diğer adiposit alt tiplerini içeren yağ depolarında bulunan hücre tiplerinin heterojenliğini tam olarak yansıtmaz. Ayrıca, kültürlü hücre hatları genellikle dış uyaranlara karşı azalmış bir yanıt gösterir.
Buna karşılık, birincil adiposit kültürleri in vivo adipogenezin karmaşıklığını daha doğru bir şekilde rekapitüle eder ve birincil adipozitler sağlam işlevsel yanıtlar gösterir. Birincil preadipositler tipik olarak yetişkin farelerin yağ depolarının stromal vasküler fraksiyonundan izole edilir11,12,13,14. Bununla birlikte, yetişkin hayvanların yağ depoları öncelikle çok yavaş bir ciro oranına sahip tamamen olgun adipositlerden oluştuğundan15,16,17, bu yaklaşım düşük çoğalma oranına sahip sınırlı miktarda preadiposit verir. Bu nedenle, preadipositlerin yenidoğan farelerden izole edilmesi, in vitro olarak ayırt edilebilen büyük miktarlarda hızla büyüyen hücreler elde etmek için tercih edilir. Burada, in vitro'yu tamamen işlevsel birincil adipositlere genişletilebilen ve ayırt edilebilen hem beyaz hem de kahverengi preadipositleri verimli bir şekilde izole etmek için Kahn ve ark.18'in birincil kahverengi adipositleri ile yapılan ilk çalışmalardan esinlenen bir protokol tanımlanmıştır (Şekil 1A). Yetişkin farelerin aksine, birincil hücreleri yenidoğandan izole etmenin avantajı, yağ depolarının hızla büyümesi ve böylece aktif olarak çoğalan zengin bir preadiposit kaynağıolmasıdır 17. Bu protokol kullanılarak yalıtılmış hücreler, kültürlerin hızlı bir şekilde ölçeklendirilmesini sağlayan yüksek proliferatif kapasiteye sahiptir. Ek olarak, yenidoğan yavrularından gelen preadipositler, yetişkin atalardan daha yüksek farklılaşma potansiyeli gösterir, bu da farklılaşma derecesinde iyiden kuyuya değişkenliği azaltır ve böylece tekrarlanabilirliği arttırır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdipoRed (Nile Red)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bioproducts LLC</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1&#160;&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td>For Bioenergetics studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose, Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid-Free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norepinephrine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>557368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>For Bioenergetics studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>T1317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triiodothyronine (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>642511</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice

Adiposit farklılaşması ve işlevinin altında kalan mekanizmaların anlaşılması, ölümsüzleştirilmiş beyaz preadiposit hücre çizgilerinin kullanımından büyük ölçüde yararlanmıştır. Ancak bu kültürlü hücre çizgilerinin sınırlamaları vardır. Şu anda beyaz yağ depolarında var olduğu bilinen heterojen adiposit popülasyonlarının çeşitli fonksiyonel spektrumlarını tam olarak yakalaymıyorlar. Beyaz yağ dokusunun karmaşıklığını incelemek için fizyolojik olarak daha ilgili bir model sağlamak için, birincil beyaz ve kahverengi adiposit atalarının yenidoğan farelerden eşzamanlı izolasyonunu, kültürdeki hızlı genişlemelerini ve in vitro'yu olgun, tamamen işlevsel adipositlere ayırmalarını sağlayacak bir protokol geliştirilmiş ve optimize edilmiştir. Birincil hücreleri yetişkin fareler yerine yenidoğandan izole etmenin birincil avantajı, yağ depolarının aktif olarak gelişmesi ve bu nedenle çoğalan preadipositlerin zengin bir kaynağı olmasıdır. Bu protokol kullanılarak izole edilen birincil preadipositler, birleşmeye ulaştıktan sonra hızla farklılaşır ve yenidoğan farelerde gelişmiş yağ pedlerinin görünümünü doğru bir şekilde yansıtan zamansal bir pencere olan 4-5 gün içinde tamamen olgunlaşır. Bu strateji kullanılarak hazırlanan birincil kültürler, yüksek tekrarlanabilirlik ile genişletilebilir ve incelenebilir, genetik ve fenotipik ekranlar için uygun hale getirilebilir ve genetik fare modellerinin hücre otonom adiposit fenotiplerinin incelenmesini sağlar. Bu protokol, yağ dokusu in vitro karmaşıklığını incelemek için basit, hızlı ve ucuz bir yaklaşım sunar.

Protokolün Bölüm 1'i, standart bir ışık mikroskobu altında görülebilen hücrelerin heterojen bir süspansiyonu sağlayacaktır. Sindirilmiş dokuların hücre süzgeci ile filtrelanması (bölüm 2) sindirilmemiş dokuyu uzaklaştıracaktır. Bununla birlikte, bazı hücresel döküntüler, kan hücreleri ve olgun adipozitler geçecektir (Şekil 1C). Kaplamadan sonra nazik yıkamalar 1 saat, preadipositler kuyunun dibine hızla yapıştıkça ilgili ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice at JoVE.com

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

Bu rapor, birincil kahverengi ve beyaz preadipositlerin yenidoğan farelerden eşzamanlı izolasyonu için bir protokol açıklanmaktadır. İzole hücreler kültürde yetiştirilebilir ve tamamen olgun beyaz ve kahverengi adipozitlere farklılaşmaya teşvik edilebilir. Yöntem, kültürdeki primer yağ hücrelerinin genetik, moleküler ve fonksiyonel olarak karakterizeini sağlar.

Primer Beyaz ve Kahverengi Preadipositlerin Yenidoğan Farelerden İzolasyonu ve Farklılaşması

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Bu protokol, in vivo sahip olduğumuz yağ dokusunun fizyolojisi olan in vitro'yu sadık bir şekilde yeniden oluşturan beyaz ve kahverengi adipositlerin hücre kültürel modellerini oluşturmak için basit bir strateji sağlar. Bu protokol, yenidoğan farelerden hem beyaz hem de kahverengi preadipositlerin eşzamanlı olarak izolasyonunu sağlar ve bu yöntemi kullanarak izole ettiğimiz hücreler yüksek proliferatif kapasiteyi ve farklılaşma potansiyelini değerlendirir. Bu yaklaşım kullanılarak izole edilen hücreler yağ dokusunun karmaşıklığını diğer kültür modellerinden daha iyi yansıtır.Ve obezite ve diyabette adiposit fonksiyonunu daha doğru incelemek için kullanılabilir. Öncelikle obezitede yağ dokusu disfonksiyonu anlamaya odaklanıyoruz. Bununla birlikte, bu yöntemle hazırlanan hücreler, gelişim biyolojisinde hücre ile ilgili temel soruları incelemek için de kullanılabilir.Başarılı bir deneyin anahtarı, beyaz yağ depolarının küçük, ancak çok zengin ve çoğalan preadipositlerin yavrularda ayırt edilmesi zor olabilen bu depolar olarak nasıl tanımlanacağını belirlemektir. Görsel gösterim, bu protokolün ne kadar basit olduğunu gösterir ve beyaz ve kahverengi yağ depolarını bulmak ve parçalamak için ipuçları sağlanmasına izin verir. Depo izolasyonu görmek çok yararlıdır.Deri altı beyaz yağ dokusunu toplamak için, ötanazi bir yenidoğan yavrunun karnının etrafındaki cildi kesin ve cildi bacakların altına hafifçe çekin. Herhangi bir cilt dokusu toplamadan, cildin içine veya kuadriseps'in üstüne bağlı açık veya beyaz, ince uzun bir doku olarak görünecek olan yağ deposunu dikkatlice hasat edin. Hasat edilen depoyu PBS'de durulayın ve yağ dokusunu 250 mikrolitre PBS ve 200 mikrolitre 2X izolasyon tamponu içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.Kesitler arası kahverengi yağ dokusunu toplamak için, cildi omuz bıçaklarından başın üzerine çekin ve omuz bıçakları arasında bulunan koyu kırmızı kahverengi yağ dokusunu kaldırın. Vücuttan ayırmak ve dokuyu kıvam ve renk için kontrol etmek için yağlığın her yerinde dikkatlice kesiler yapın. Durulamadan sonra, dokuyu 250 mikrolitre PBS ve 200 mikrolitre 2X izolasyon tamponu içeren ikinci bir 1,5 mililitrelik tüpe yerleştirin.Tüm depolar toplandığında, her depoyu doğrudan tüplerin içine dört ila altı kez nazikçe kıymak için makas kullanın ve her tüpe 2X izolasyon tamponunda 50 mikrolitre 10X kollajenaz ekleyin. Daha sonra dokuları karıştırmak ve sıcaklık kontrollü bir karıştırıcıya 37 santigrat derecede 30 dakika ve dakikada 1400 devir yerleştirmek için tüpleri hızlı bir şekilde ters çevirin. Sindirimin sonunda, tüpleri tekrar buza yerleştirin ve sindirim dokularını 100 mikron hücre süzgeçlerinden yeni 50 mililitrelik tüplere filtreleyin.Hücre verimini en üst düzeye çıkarmak için, her tüpü bir mililitre izolasyon ortamı ile durulayın ve bu yıkamayı süzgeçten filtreleyin. Kahverengi ve beyaz yağ dokusu çözeltilerini taze izolasyon ortamında depo başına kuyu başına iki mililitre doku süspansiyonu ile seyreltin. Daha sonra dört ila altı kuyunun her birine iki mililitre beyaz yağ dokusu süspansiyonu ve altı kuyu plakasının iki ila üç kuyusunun her birine iki mililitre kahverengi yağ dokusu süspansiyonu, kuyu başına bir 100 mikron filtre ile plakaleyin.Tüm hücreler kaplandığında, plakayı 60 ila 90 dakika boyunca hücre kültürü inkübatöre yerleştirin. Kuluçkanın sonunda, her bir kuyuyu iki mililitre serumsuz ortamla yıkayın ve kuyuların dibinden herhangi bir kan hücresini ayırmak için plakayı hafifçe çalkalayın. Üç yıkamadan sonra, kuyulara iki mililitre taze izolasyon ortamı ekleyin ve plakayı hücre kültürü inkübatörüne geri verin.Hücreler% 80 ila 90 izdiah ulaştığında, yeni hedef plakaları 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede damıtılmış suda steril% 0.1 jelatin ile kaplayın. Plakalar inkübasyon yaparken, hücre kültürü inkübatöründe üç dakika tripin ile tedavi etmeden önce hücreleri PBS ile yıkayın. Hücreler ayrıldığında, hücre iyileşmesini en üst düzeye çıkarmak ve hücreleri yeni bir tüpe aktarmak için hücre süspansiyonunu birkaç kez pipetlayın.Tüm hücreler toplandığında, her bir kuyuyu bir mililitre izolasyon ortamıyla yıkayın ve yıkamaları hücre süspansiyonu ile çekin. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve saymak için peleti üç ila beş mililitre izolasyon ortamına yeniden koyun. Hücreleri taze izolasyon ortamında kaplamak için uygun konsantrasyona seyreltin ve fazla jelatinleri çıkarmak için jelatin kaplı plakaları PBS ile yıkayın.Daha sonra hücreleri jelatin kaplı plakalara tohumlayın ve hücreleri hücre kültürü inkübatörüne geri döndürün. Hücreler konfluense ulaştığında, yalıtım ortamını farklılaşma ortamıyla değiştirin. Kahverengi yağ dokusu preadipositlerini ayırt ediyorsanız, bir nanomoler triiyodotironin de ekleyin.48 saat sonra, ortamı kültür başına uygun bakım ortamı hacmiyle yenileyin. Şu anda, hücreler içindeki küçük sıvı damlacıklarının birikmesi parlak alan mikroskopisi altında görünür hale gelmelidir. Filtrelemeden sonra bile, bazı hücresel döküntüler ve kan hücreleri hücre süspansiyonu içinde kalır.Kaplamadan bir saat sonra nazik yıkamalar, preadipositler kuyunun dibine hızla yapıştıkça ilgili olmayan hücreleri uzaklaştırır. Yenidoğan yavrulardan izole edilen hem beyaz hem de kahverengi preadipositler yüksek proliferatif kapasiteye sahip olsa da, beyaz preadipositlerin verimi genellikle depo bazında kahverengi preadipositlerin iki katıdır. Bu nedenle, senkronize kültürler isteniyorsa, beyaz preadipositlerin bu başlangıç yoğunluğu buna göre hesaplanmalıdır.Farklılaşmanın sonunda, hücreler lipit damlacıkları ile yüklenmiş gibi görünecek ve sırasıyla beyaz ve kahverengi adipositlerin klasik belirteçlerini ifade edecektir. Bazal koşullar altında primer beyaz ve kahverengi adipositlerin mitokondriyal stres testinde oksijen tüketiminin bu karşılaştırmalı analizinde ve mitokondriyal fonksiyonun bilinen uyarıcılarına yanıt olarak, her hücre tipinin bu spesifik biyoenergetik yetenekleri gözlemlenebilir. Canlı hücreleri izole ettiğimizi ve onları birkaç gün boyunca kültüre etmek istediğimizi unutmayın.Bu nedenle, sonraki kültürü tehlikeye atabilecek kirlenmeyi önlemek için izolasyon sırasında steril koşulları koruduğunuzdan emin olun. Bu yöntem, adiposit işlevini etkileyen hücre otonom mekanizmalarını incelemek için fonksiyonel tahliller, genetik veya kimyasal ekranlar veya omik profilleme dahil olmak üzere farklı uygulamalar için kullanılabilecek tamamen olgun adipositler üretir.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

P0 Yenidoğan Ratlarda Hipokampal Nöronlar İlköğretim Kültür

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Primer Tümörler gelen Bağışıklık Hücre İzolasyonu

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

İlköğretim İnsan fibroblast Kültürler gelen naif Erişkin Kök Hücre İzolasyon

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Germ benzeri hücreler içine Yenidoğan Fare Cilt Türetilmiş Kök Hücre Farklılaşma<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Fare ve İnsan Kolon Doku Primer miyofibroblastlar İzolasyonu

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Yalıtım, karakterizasyonu ve yetişkin fare kalp kalp kök hücre farklılaşma

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Sıçan kemik Iliği Osteoclast precursors yalıtım, arıtma ve farklılaşma

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Minyatür Domuzlardan Birincil Aort Endotel Hücrelerinin İzolasyon ve Kültürü

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Unveiling Inflammatory Arthritis&#58; Exploring Functions of Synovial Cells

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue (Video) | JoVE 

Murin Artrit Dokusundan Primer Sinovyal Makrofaj ve Fibroblastların İzolasyonu ve Kültürü

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...