Name: sample preparation for metabolic profiling using maldi mass spectrometry imaging
Uploaded: 2020-12-22T14:30:00
Duration: 9 min 8 s
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सुनो वह और Rinat Abzalimov पेशेवर स्टाफ कांग्रेस-न्यूयॉर्क के शहर विश्वविद्यालय (पीएससी-CUNY) अनुसंधान पुरस्कार कार्यक्रम द्वारा समर्थित हैं । युकी चेन और केली वीरामी अल्फ्रेड पी स्लोन फाउंडेशन CUNY ग्रीष्मकालीन स्नातक अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा समर्थित हैं ।

<ol>
	<li>Watkins, S. M., German, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+and+biochemical+profiling+in+drug+discovery+and+development.">Metabolomics and biochemical profiling in drug discovery and development.</a> Current Opinion in Molecular Therapeutics. 4, 224-228 (2002).</li><li>Fernie, A. R., Trethewey, R. N., Krotzky, A. J., Willmitzer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+profiling:+from+diagnostics+to+systems+biology.">Metabolite profiling: from diagnostics to systems biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 763-769 (2004).</li><li>Theodoridis, G. A., Gika, H. G., Want, E. J., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography-mass+spectrometry+based+global+metabolite+profiling:+a+review.">Liquid chromatography-mass spectrometry based global metabolite profiling: a review.</a> Analytica Chimica Acta. 711, 7-16 (2012).</li><li>Dienel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+and+Imaging+Mass+Spectrometric+Assays+of+Labile+Brain+Metabolites:+Critical+Importance+of+Brain+Harvest+Procedures.">Metabolomic and Imaging Mass Spectrometric Assays of Labile Brain Metabolites: Critical Importance of Brain Harvest Procedures.</a> Neurochemistry Research. 45, 2586-2606 (2020).</li><li>Dienel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+Assays+of+Postmortem+Brain+Extracts:+Pitfalls+in+Extrapolation+of+Concentrations+of+Glucose+and+Amino+Acids+to+Metabolic+Dysregulation+In+Vivo+in+Neurological+Diseases.">Metabolomic Assays of Postmortem Brain Extracts: Pitfalls in Extrapolation of Concentrations of Glucose and Amino Acids to Metabolic Dysregulation In Vivo in Neurological Diseases.</a> Neurochemistry Research. 44, 2239-2260 (2019).</li><li>Wasek, B., Arning, E., Bottiglieri, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+microwave+irradiation+for+quantitative+analysis+of+neurotransmitters+in+the+mouse+brain.">The use of microwave irradiation for quantitative analysis of neurotransmitters in the mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 307, 188-193 (2018).</li><li>Andres, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+workflow+for+mass+spectrometry-based+metabolomics+analysis+of+the+heart.">Improved workflow for mass spectrometry-based metabolomics analysis of the heart.</a> Journal of Biological Chemistry. 295, 2676-2686 (2020).</li><li>Lu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+Measurement:+Pitfalls+to+Avoid+and+Practices+to+Follow.">Metabolite Measurement: Pitfalls to Avoid and Practices to Follow.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).</li><li>Norris, J. L., Caprioli, R. 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A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+tissue+analysis+using+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry:+practical+aspects+of+sample+preparation.">Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation.</a> Journal of Mass Spectrometry. 38, 699-708 (2003).</li><li>Greco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+proteomics.">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical proteomics.</a> Expert Review of Proteomics. 15, 683-696 (2018).</li><li>Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+Quantification+of+Rifampicin+by+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry+Using+Multiple+TOF/TOF+Events+in+a+Single+Laser+Shot.">Absolute Quantification of Rifampicin by MALDI Imaging Mass Spectrometry Using Multiple TOF/TOF Events in a Single Laser Shot.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (1), 136-144 (2017).</li><li>Quanico, J., Franck, J., Wisztorski, M., Salzet, M., Fournier, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+MALDI+Mass+Spectrometry+Imaging+and+Parafilm-Assisted+Microdissection-Based+LC-MS/MS+Workflows+in+the+Study+of+the+Brain.">Combined MALDI Mass Spectrometry Imaging and Parafilm-Assisted Microdissection-Based LC-MS/MS Workflows in the Study of the Brain.</a> Methods in Molecular Biology. 1598, 269-283 (2017).</li><li>Trim, P. J., Snel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+MALDI+MS+imaging:+Current+technologies+and+future+challenges.">Small molecule MALDI MS imaging: Current technologies and future challenges.</a> Methods. 104, 127-141 (2016).</li></ol>

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं ।

माल्डी-इमेजिंग (माल्डी-एमएसआई) एक लेबल-मुक्त इमेजिंग तकनीक है जो शोधकर्ताओं को विभिन्न जैव अणुओं के वितरण और ऊतक में उनके संशोधनों, विकृति के आणविक आधार की जांच करने की अनुमति देती है। ऊतक विश्लेषण के लिए पारंपरिक एलसी-एमएस दृष्टिकोणों के साथ माल्दी-एमएसआई का संयुक्त उपयोग पारंपरिक ओमिक्स वर्कफ्लो के समान आणविक गहराई प्रदान करता है लेकिन जो सेलुलर नेटवर्क के भीतर उन संकेतों के स्थानिक संबंध को भी बरकरार रखता है। नमूना तैयार करना मालदी एमएसआई में सबसे महत्वपूर्ण कदम है और विभिन्नप्रयोगशालाओंमें किए गए मेटाबोलोमिक्स अध्ययनों के अंतिम पठन-पासियों में भिन्नता के लिए खाते हैं । यहां हम माल्डी एमएसआई का उपयोग करके मेटाबोलॉमिक प्रोफाइलिंग के लिए नमूना तैयारी को मानकीकृत करने के लिए एक व्यापक अभी तक व्यावहारिक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, इस आशा में कि यह बुनियादी जीव विज्ञान से ट्रांसलेशनल अध्ययन तक अपने वर्तमान और भविष्य के अनुसंधान में माल्डी एमएसआई को लागू करने के लिए एक व्यापक अनुसंधान समुदाय को लाभ पहुंचाता है।
नमूना तैयारी के दौरान आणविक प्रोफाइल (बहुतायत और स्थानिक वितरण दोनों) में परिवर्तन को कम करने और संदूषण से बचने के लिए हमेशा सभी सावधानियों को ध्यान में रखना चाहिए। सबसे पहले, पशु इच्छामृत्यु और ऊतक संचयन के बीच के समय को कम करें, जैसे सीटू में जमे हुए या माइक्रोवेव निर्धारण द्वारा गर्म करने के लिए मस्तिष्क में एंजाइमों को निष्क्रिय करने के लिए पोस्टमॉर्टम इस्केमिया4,5,6के लिए देयता को कम करने के लिए । दूसरे, नमूने की स्नैप ठंड की स्थिति गंभीर है । अपर्याप्त ठंड से मेटाबोलाइट्स की गिरावट और हानि होगी, जबकि ओवर फ्रीजिंग से क्रायोसेक्शनिंग के दौरान ऊतक विखंडन होगा। ठंड समय हमेशा पिछले रिपोर्ट किए गए अध्ययनों के अनुसार पहले परीक्षण किया जाना चाहिए, और इस पेपर में प्रस्तुत विकासात्मक माउस मस्तिष्क का अध्ययन कृंतक मस्तिष्क ऊतक के लिए संदर्भ अंक प्रदान करता है। तीसरा, जैविक ऊतकों को काटना और आईटीओ स्लाइड्स में उनके वर्गों को स्थानांतरित करने के लिए पर्याप्त अभ्यास की आवश्यकता होगी । यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि मंच से अनुभाग लेने के लिए ब्रश का उपयोग करते समय, ब्रश का उपयोग नाजुक रूप से किया जाना चाहिए। ब्रश के ब्रिस्टल को केवल ऊतक अनुभाग के किनारों के संपर्क में आने की अनुमति दें ताकि संदूषण और अनुभाग विखंडन के जोखिम को कम किया जा सके। जितना संभव हो स्लाइड पर अनुभाग को समतल करें, यह उंगली-वार्मिंग के दौरान अनुभाग के कर्लिंग को रोक देगा। चौथा, आईटीओ स्लाइड पर बढ़ते हुए, सुनिश्चित करें कि पूरे खंड अच्छी तरह से आईटीओ स्लाइड से जुड़ा हुआ है के रूप में ऊतक के विभिंन क्षेत्रों उंगली वार्मिंग के विभिंन समय की आवश्यकता हो सकती है । उदाहरण के लिए, ब्रेन ट्यूमर ऊतक सामान्य मस्तिष्क ऊतक की तुलना में लंबे समय तक वार्मिंग की आवश्यकता होती है। एक गरीब बढ़ते माल्डी-एमएस स्कैनिंग के दौरान ऊतक की टुकड़ी और विखंडन का कारण बन सकता है। ध्यान रखें कि उंगली वार्मिंग एंजाइम क्रिया और चयापचय मेटाबोलाइट्स के विरूपण साक्ष्य परिवर्तन के कारण सक्षम हो सकता है । पांचवां, माल्डी मैट्रिक्स का एक अच्छा और समान जमाव सटीक स्थानिक जानकारी और मजबूत मालदी-एमएस सिग्नल प्राप्त करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एक खाली स्लाइड पर मैट्रिक्स छिड़काव का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है, और कीमती नमूना स्लाइड की कोटिंग पर आगे बढ़ने से पहले उचित कवरेज को सत्यापित करने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे क्रिस्टल पैटर्न का निरीक्षण करना। और अंत में, चूंकि एक व्यक्तिगत शोधकर्ता ऊतक संचयन और स्लाइड तैयारी को विभिन्न गति से निष्पादित करता है, इसलिए भिन्नता को कम करने के लिए एक ही पलटन में नमूने की तैयारी को संभालने के लिए एक व्यक्ति होना आदर्श होगा।
प्रोटोकॉल विवरण मानक प्रक्रियाओं से ऊपर प्रदान की है, जो विशेष प्रयोगों की जरूरतों के अनुरूप किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, एक क्रायो-सेक्शनिंग जेल OCT, जिसका उपयोग सामान्य रूप से नमूने के क्रायो-सेक्शनिंग में किया जाता है, को ऊतक चक (जैसा कि ऊपर वर्णित अध्ययन में) के लिए बढ़ते गोंद के रूप में उपयोग किया जा सकता है। पूर्व अध्ययनों से पता चला है कि अक्टूबर में बहुलक घटक मजबूत आयन दमन14का कारण बनता है । हालांकि, नमूने को एम्बेड करना उन मामलों में अपरिहार्य हो सकता है जहां ऊतक पॉलीमर जेल से अतिरिक्त सहायता के बिना काटा जाना बहुत नाजुक है। इन मामलों में संकेत दमन का मुकाबला करने के लिए, ऊतकों को प्रोटीन या लिपिड का पता लगाने के लिए अवशिष्ट अक्टूबर को हटाने के लिए 70% इथेनॉल और 95% इथेनॉल में सीरियल धोने के साथ धोने की आवश्यकता हो सकती है, जबकि छोटे आणविक मेटाबोलाइट्स9का पता लगाने के लिए धोने की सिफारिश नहीं की जाती है।
माल्डी एमएसआई अनुसंधान प्रयोगशाला और नैदानिक अभ्यास सेटिंग दोनों में तेजी से प्रासंगिक हो गया है। उदाहरण के लिए, मालडी एमएसआई ने हाल ही में प्रोटेओमिक्स के अध्ययन में उपयोगी साबित किया है ताकि जीव15की फेनोटाइपिक कार्यात्मक स्थिति की विशेषता हो और बाद में बीमारी के माइक्रोबियल पहचान और निदान के लिए एक एजेंट के रूप में कार्य करने में16। जबकि माल्डी एमएसआई अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला का समर्थन करता है, इस तकनीक पर पूरी तरह से भरोसा करने के साथ जुड़ी कुछ सीमाएं हैं, खासकर जब समान प्रजातियों या मेटाबोलाइट्स के बीच अंतर करने की बात आती है, और विशिष्ट लक्ष्यों की पहचान होती है। एक और चुनौती मालडी एमएसआई संकेतों के अनुसार मेटाबोलाइट्स एकाग्रता का मात्राकरण है। अक्सर यह माना जाता है कि माल्डी एमएसआई स्पेक्ट्रा में आयन बहुतायत और विच्छेदित ऊतकों में इसी आणविक प्रजातियों के स्थानिक वितरण (या सापेक्ष बहुतायत) अच्छी तरह से सहसंबद्ध हैं। हालांकि, किसी को हमेशा यह ध्यान में रखना चाहिए कि आयन तीव्रता और संबंधित आणविक प्रजातियों की मात्रा के बीच संबंध कई कारकों से जटिल है, लेकिन आयन दमन के प्रभाव, ऊतक संरचना में परिवर्तन और आयन-अणु प्रतिक्रियाओं17तक सीमित नहीं है। आंतरिक मानकों का उपयोग करने वाली तकनीकों को मालडी-एमएसआई18में पूर्ण मात्राकरण (μmol/g ऊतक) के लिए लागू किया जा सकता है । इन दो चुनौतियों को आम तौर पर तरल क्रोमेटोग्राफी टैंडेम एमएस (एलसी-एमएस/एमएस) तकनीकों के साथ माल्डी एमएसआई के संयुक्त कार्यप्रवाह के साथ संबोधित किया जाता है, जिससे मालडी-एमएस ब्याज के क्षेत्र के मानचित्रण के लिए अनुमति देता है, जो बाद में मेटाबोलाइट19की पहचान के लिए अधिक जानकारी प्रदान करने के लिए माइक्रोएक्सट्राक्शन और एलसी-एमएस/एमएस के अधीन है ।
एमएस आधारित इमेजिंग विधियों को हाल के वर्षों में छोटे अणु मेटाबोलाइट्स इमेजिंग के लिए पिछली तकनीकों के वैकल्पिक तौर-तरीके के रूप में विकसित किया गया है । माल्डी एमएसआई की प्रगति और बढ़ती लोकप्रियता के साथ, यह उम्मीद की जाती है कि माल्डी इमेजिंग छोटे अणुओं की कल्पना के लिए एक नया मानक उपकरण बन जाएगा। जैविक संदर्भ में लिपिड और अंतर्जात छोटे अणुओं (जैसे न्यूरोट्रांसमीटर और मेटाबोलाइट्स) की इमेजिंग, साथ ही नए दवा एजेंटों के विकास के लिए ज़ेनोबायोटिक्स की इमेजिंग विशेष रुचि के हैं। निकटभविष्यमें मालदी एमएसआई के आवेदन के साथ इन तीनों क्षेत्रों में तेजी से प्रगति होने की संभावना है ।

मेटाबोलाइट्स, मेटाबोलिज्म के मध्यवर्ती या अंत उत्पाद, जिनमें न्यूक्लियोटाइड, अमीनो या कार्बनिक एसिड, लिपिड शामिल हैं, जैविक कार्यों और प्रक्रियाओं के प्रमुख घटक हैं। मेटाबोलोमिक्स, मेटाबोलाइट्स का अध्ययन, उनके जैव रासायनिक बातचीत की खोज और बुनियादी, अनुवादात्मक और नैदानिक अनुसंधान के संदर्भ में उनकी भूमिकाओं की समझ के लिए अनुमति देता है। मेटाबोलाइट्स जीवों के फेनोटाइप से दृढ़ता से जुड़े होते हैं और सेलुलर मेटाबॉलिज्म के दौरान होने वाली जैव रासायनिक गतिविधियों के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं1. इसलिए, जीनोमिक्स और प्रोटेओमिक्स के अलावा, मेटाबोलोमिक्स शारीरिक और रोग दोनों स्थितियों को समझने में एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में उभरा है। उदाहरण के लिए, मेटाबोलोमिक्स का उपयोग मौजूदा दवाओं के पीछे तंत्र को स्पष्ट करने के साथ-साथ उनकी सहिष्णुता को स्पष्ट करने में किया जाता है। दवा के विकास में, ज़ेनोबायोटिक मेटाबोलिज्म प्रजातियों में मेटाबोलाइट्स की गतिविधि या विषाक्तता का आकलन करने में उपयोगी है, जो बाद में व्यक्तिगत दवा2का समर्थन करने के लिए अनुवाद करता है। मेटाबोलोमिक्स के व्यापक अनुप्रयोग के बावजूद, मेटाबोलाइट्स की इमेजिंग मेटाबोलाइट्स की रासायनिक प्रतिक्रियाशीलता, संरचनात्मक विषमता और व्यापक एकाग्रता रेंज3के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकती है। हालांकि, उच्च ऊर्जा यौगिकों, ग्लूकोज, लैक्टेट, ग्लाइकोलिटिक, पेंटोज शंट मार्ग, और टीसीए चक्र मध्यवर्ती, फॉस्फोलिपिड्स, न्यूरोट्रांसमीटर, सिग्नलिंग यौगिकों सहित लैबिल मेटाबोलाइट्स की सांद्रता सेकंड के भीतर बदल सकती है और मिनटों में प्रगति कर सकती है जब ऊतक ऊतक संचयन प्रक्रियाओं के दौरान सक्रिय होते हैं, जैसे मस्तिष्क संचयन में पोस्टमॉर्टम इस्केमिया4,5,6 . सटीक मेटाबोलोमिक्स डेटा अधिग्रहण सुनिश्चित करने के लिए, उचित और सावधान नमूना तैयारी महत्वपूर्ण है7,8। मेटाबोलाइट्स को मापने के लिए वर्तमान स्थापित प्लेटफार्मों में एनएमआर, एंजाइम परख और द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री (तरल और गैस क्रोमेटोग्राफी सहित) शामिल हैं, जिनमें से अंतिम नीचे चर्चा की जाती है।
माल्डी-एमएसआई एक अत्याधुनिक तकनीक है जो व्यक्तिगत आणविक प्रजातियों का पता लगाने के माध्यम से जटिल नमूनों के विश्लेषण के लिए अनुमति देती है। माल्डी एमएसआई जैविक नमूनों में विभिन्न आणविक यौगिकों को जल्दी और पुन: उत्पन्न करने में सक्षम होने का लाभ प्रदान करता है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग आगे छवियों के उत्पादन के लिए अनुमति देता है जो अपने समग्र मेटाबोलाइट्स के आधार पर ऊतक जीव विज्ञान का प्रतिनिधित्व करते हैं, और नमूना 9 में मेटाबोलाइट्स के स्थानिक वितरण को संरक्षित करते हुए ऐसा करतेहैं। एंटीबॉडी लेबलिंग, संरचनात्मक संशोधनों, या अन्य विशेष अभिकर्मकों के उपयोग के बिना नमूने में विश्लेषण का पता लगाने की माल्डी की क्षमता, जैसे इम्यूनोस्टेटिंग में उपयोग किए जाने वाले, एक ही प्रयोग के भीतर सैकड़ों अणुओं की निगरानी करने की क्षमता के साथ, जब मेटाबॉलिक प्रोफाइलिंग10की बात आती है तो एमएस इमेजिंग अनुदान के कुछ फायदे शामिलहैं, 11. आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले मैट्रिक्स के अलावा 2,5-डाइहाइड्रोक्सीबेन्जोइक एसिड (डीएचबी) और 9-अमीनोक्रिडीन (9-एए), हाल ही में खोजे गए उपन्यास मैट्रिक्स एन -(1-नेफ्थिल) एथिलीनडाइमाइन डिहाइड्रोक्लोराइड (एनईडीसी), जो विभिन्न कम आणविक वजन मेटाबॉलिज् म के विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से उपयुक्त है आगे मेटाबॉलिक प्रोफाइलिंग12में माल्डी एमएसआई के आवेदन में सुधार किया है .
माल्डी एमएसआई के व्यापक अनुप्रयोग के बावजूद, साधन की उच्च लागत और प्रायोगिक प्रक्रिया की जटिलता व्यक्तिगत अनुसंधान प्रयोगशालाओं में इसके व्यापक कार्यान्वयन को रोकती है। इसलिए, अधिकांश मालडी एमएसआई अध्ययन साझा कोर सुविधाओं के माध्यम से समर्थित हैं। स्लाइड तैयार करने और मैट्रिक्स कोटिंग सहित नमूना तैयार करना, मालडी एमएसआई में सबसे महत्वपूर्ण कदम है। हालांकि, स्लाइड तैयारी आम तौर पर व्यक्तिगत शोधकर्ता की प्रयोगशाला में किया जाता है, जो बाद में माल्डी एमएसआई अधिग्रहण में संभावित विविधताएं पैदा करता है। यहां हम माल्डी एमएसआई मापों पर आगे बढ़ने से पहले जैविक नमूनों के नमूने तैयार करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करने का लक्ष्य रखते हैं, और एक उदाहरण के रूप में विकासात्मक माउस मस्तिष्क की मेटाबोलॉमिक प्रोफाइलिंग का उपयोग करते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Andwin Scientific&#160;Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-111-2302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex speed MALDI-TOF MS system</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>MALDI-TOF MS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Syringe with Luer-Lok Tips</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer General Use Syringe Needles</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Daltonics&#160;GLASS SLIDES MALDI IMAGNG</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>NC0380464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics&#160;</td>
			<td></td>
			<td>AC219095000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epson Perfection V600 Photo Scanner</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Perfection V600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;5-Place Slide Mailer</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Digital Auto-Range Multimeter</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>01-241-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexImaging v3.0</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>Bruker MS imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>MMX04751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Water</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>W5-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTX M5 Sprayer</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td></td>
			<td>Automatic heated matrix sprayer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#160;Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC&#160;Ziploc Freezer Bag</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-111-3769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N -(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride (NEDC)</td>
			<td>Millipore Sigma Aldrich</td>
			<td>222488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCiLS Lab (2015b)</td>
			<td>SCiLS Lab</td>
			<td></td>
			<td>Advanced MALDI MSI data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;CryoStar NX50 Cryostat</td>
			<td>Fisher Thermo Scientific</td>
			<td>95-713-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-642-7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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sample preparation for metabolic profiling using maldi mass spectrometry imaging

मेटाबोलोमिक्स, एक प्रयोगात्मक नमूने में मौजूद छोटे अणुओं और मेटाबोलाइट्स की पहचान करने और उन्हें निर्धारित करने के लिए अध्ययन, विकास और रोगों के दौरान जैविक गतिविधियों की जांच करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में उभरा है । मेटाबोलोमिक्स दृष्टिकोण कैंसर, पोषण/आहार, मधुमेह, और मेटाबोलिक प्रक्रियाओं से जुड़े अन्य शारीरिक और रोग स्थितियों के अध्ययन में व्यापक रूप से कार्यरत हैं । इस पेपर में वकालत की गई मेटाबोलॉमिक प्रोफाइलिंग में एड्स करने वाला एक लाभप्रद उपकरण मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर डिसोरप्शन/आयनाइजेशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग (माल्डी एमएसआई) है। बिना लेबलिंग, संरचनात्मक संशोधनों, या अन्य विशेष अभिकर्षकों के सीटू में मेटाबोलाइट्स का पता लगाने की इसकी क्षमता, जैसे इम्यूनोस्टेपिंग में उपयोग किए जाने वाले, मेटाबोलोमिक्स के क्षेत्र में प्रासंगिक पद्धतियों को आगे बढ़ाने में माल्डी एमएसआई एक अनूठा उपकरण बनाती है। इष्टतम परिणाम देने के लिए एक उपयुक्त नमूना तैयारी प्रक्रिया महत्वपूर्ण है और इस पेपर का ध्यान केंद्रित होगा।

प्रतिनिधि प्रयोग चित्रा 1में दिखाए गए कार्यप्रवाह के अनुसार किया गया था । प्रसवोत्तर दिन 1, 21, ६० (वयस्क) के विकास C57BL वाइल्डटाइप माउस दिमाग के रूप में CUNY IACUC दिशा निर्देशों के बाद ऊपर वर्णित काटा गया था और 2, 5 और 7 मिनट के लिए क्रमशः जमे हुए तस्वीर थे, एक एल्यूमीनियम तरल नाइट्रोजन पर तैर नाव पर । जमे हुए ऊतकों को नमूना सिर और कक्ष दोनों के लिए सेट −15 डिग्री सेल्सियस पर 10 माइक्रोन मोटाई वर्गों पर क्रायोसेक्शन किया गया था। ऊतक क्रायोसेक्शन को तब माल्डी इमेजिंग के लिए आईटीओ-लेपित ग्लास स्लाइड के पूर्व-कूल्ड प्रवाहकीय पक्ष पर धीरे से स्थानांतरित कर दिया गया था। आईटीओ स्लाइड पर घुड़सवार क्रायोसेक्शन कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए वैक्यूम में डिसक्ट किया गया था, जिसके बाद स्वचालित मैट्रिक्स स्प्रेयर का उपयोग करके मैट्रिक्स जमाव किया गया था। मैट्रिक्स एनईडीसी का उपयोग मेटाबोलाइट्स का पता लगाने के लिए किया गया था, और मेथनॉल/पानी (70/30, v/v) में 10 मिलीग्राम/एमएल का मैट्रिक्स समाधान ०.१ मिलीएल/न्यूनतम की प्रवाह दर पर जमा किया गया था और प्रत्येक चक्र के बीच 5 s सुखाने के साथ 12 चक्रों के लिए ७५ डिग्री सेल्सियस का नोजल तापमान जमा किया गया था । 1300 मिमी/मिनट का स्प्रे वेग, 2 एमएम का ट्रैक स्पेसिंग, 10 साई का एन2 गैस प्रेशर और 3 एल/मिन का फ्लो रेट और 40 एमएम की नोजल हाइट का इस्तेमाल किया गया।
माल्डी मास स्पेक्ट्रा को माल्दी टाइम ऑफ फ्लाइट (टीईएफ) एमएसआई इंस्ट्रूमेंट द्वारा निगेटिव आयन मोड में हासिल किया गया था । 0.5-1 μL लाल फास्फोरस (पीएन क्लस्टर्स विद एन = 1 - 90) मेथनॉल में पायस को आईटीओ स्लाइड्स पर जमा किया गया था, घुड़सवार ऊतकों के बगल में, और क्वाड्रेटिक कैलिब्रेशन वक्र13लागू करके 100-1000 मीटर/z मास रेंज में उपकरण को कैलिब्रेट करने के लिए उपयोग किया जाता था। लेजर स्पॉट व्यास 50 माइक्रोन रैस्टर चौड़ाई के लिए "मध्यम" संग्राहक बीम प्रोफ़ाइल के लिए केंद्रित थे। मीटर/जेड ५० से १० के लिए बड़े पैमाने पर सीमा के भीतर स्पेक्ट्रा ५०० शॉट्स के लिए एक १००० हर्ट्ज पर अधिग्रहीत किया गया । बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा डेटा दर्ज किए गए थे, और इमेजिंग को उन्नत माल्डी एमएसआई डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके आगे विश्लेषण किया गया था। आयन छवियों को ±0.25 डीए की बिन चौड़ाई पर रूट-मीन स्क्वायर (आरएमएस) सामान्यीकरण के साथ उत्पन्न किया गया था।
चित्रा 2 में परिणाम हर १०० डाल्टन अंतराल से चयनित एम/जेड स्पेक्ट्रा के MALDI MSI डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर से उत्पादन छवियों को दिखाते हैं, स्पष्ट रूप से छोटे अणु मेटाबोलाइट्स से उच्च आणविक वजन लिपिड के लिए स्पेक्ट्रा की पहचान के लिए उपयोगिता का चित्रण । प्रत्येक पंक्ति में संबंधित आयन हीट मानचित्रों को दर्शाया गया है जिसमें प्रसवोत्तर दिन 1, 21 और 60 में एकत्र तीन ऊतकों में एक निश्चित मेटाबोलाइट प्रजातियों की स्थानिक और स्पेक्ट्रल दोनों जानकारी शामिल है। प्रत्येक प्रतिनिधि एम/जेड के लिए, क्षेत्रीय वितरण और आयन बहुतायत के विश्लेषण का उपयोग विभिन्न उम्र के बीच संबंधित प्रजातियों की सापेक्ष मात्रा की तुलना करने के लिए किया जा सकता है । माल्डी एमएसआई पद्धति की एक ताकत एम/जेड द्वारा विकासात्मक मील के पत्थर या विशिष्ट शारीरिक संरचनाओं के लिए पहचानी गई कुछ प्रजातियों की विशिष्टता को समझने की क्षमता है । कुछ मेटाबोलाइट्स पी 1 नवजातों (एम/जेड 320.1) में समृद्ध होते हैं, जो P60 वयस्कों (m/z 846.5) में समृद्ध होते हैं, या समान रूप से उम्र में वितरित किए जाते हैं (एम/जेड 480.3); अन्य आणविक प्रजातियां विशेष रूप से ग्रे मैटर (एम/जेड ११७.१; ५२४.३; ७६५.१), सफेद पदार्थ (m/z ६७३.४; ८४६.५), या CSF/ventricles (m/z २३९.०)(चित्रा 2A)में समृद्ध हैं । हाइपोक्सेंथिन (एम/जेड 135.0), एन-एसिटिल-एल-एस्पार्टिक एसिड (एम/जेड 174.0), आरेकिडोनिक एसिड सहित प्रतिनिधि मेटाबोलाइट्स का स्थानिक वितरण (m/z 303.2), और लाइसोफोस्फेटिडिलेथेनोलामाइन एलपीई (18:1) (m/z 478.3), एलपीई (एलपीई(18:1) जैसे कई लिपिड 20:4) (m/z 500.3), एलपीई (22:6) (m/z 524.3), फॉस्फेटिडाइलथेनोलामाइन पीई (44:3 10) (m/z 838.5), फॉस्फेटिडिलिनोसिटॉल पीआई (38:4) (m/z 885.6) भी दिखाया गया है(चित्रा 2B)।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62008/62008fig01.jpg"> चित्रा 1। मालदी का कार्यप्रवाह- उड़ान का समय (टीओएफ) मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग। स्नैप जमे हुए ऊतक क्रायोस्टेट में क्रायोसैट में क्रायोसक्शन और आईटीओ स्लाइड पर घुड़सवार है। → ऊतक वर्गों के साथ स्लाइड स्वचालित मैट्रिक्स स्प्रेयर का उपयोग कर मैट्रिक्स की एक ठीक परत के साथ लेपित है। → मास स्पेक्ट्रा माल्डी-टीईएफ एमएसआई उपकरण द्वारा 20-200um के एक रैस्टर में एकत्र किया जाता है। → डेटा का विश्लेषण किया जाता है, और छवियों को उन्नत माल्डी एमएसआई डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके उत्पन्न किया जाता है। स्केल बार: 2 मिमी. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62008/62008fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62008/62008fig2v2.jpg"> चित्रा 2। 50 माइक्रोन पार्श्व संकल्प पर अधिग्रहीत मास स्पेक्ट्रोमेट्री से चयनित मेस/ जेड स्पेक्ट्रा के साथ प्रतिनिधि उत्पादन। (क) एकहीट मैप में पी 1, पी 21 और पी60 में पहचाने गए तीन विकासात्मक मील के पत्थरों में प्रत्येक 100 डाल्टन मीटर/जेड अंतराल से चयनित विशिष्ट मेटाबोलाइट प्रजातियों के स्थानिक वितरण को दर्शाया गया है। (ख)पी 1, पी 21 और पी 60 में प्रतिनिधि मेटाबोलाइट्स का स्थानिक वितरण, जिसमें शामिल हैं: हाइपोक्सेंथिन, एन-एसिटिल-एल-एस्पार्टिक एसिड, आरेकिडोनिक एसिड, और लाइसोफोस्फेटिडिलेथेनमाइन (एलपीई), फॉस्फेटिडिलामाइन (पीईई), फोस्फेटिडिलिनोसिटॉल (पीई) जैसी विभिन्न लिपिड प्रजातियां। स्केल बार, 500 माइक्रोन. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62008/62008fig2v2large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>

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Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

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