Name: sample preparation for metabolic profiling using maldi mass spectrometry imaging
Uploaded: 2020-12-22T14:30:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging at JoVE.com

Ye He och Rinat Abzalimov stöds av Professional Staff Congress-City University of New York (PSC-CUNY) Research Award Program. Yuki Chen och Kelly Veerasammy stöds av Alfred P. Sloan Foundation CUNY Summer Undergraduate Research Program.

Protokollet följer riktlinjerna från City University of New York (CUNY) Advanced Science Research Center (ASRC) institutionella kommitté för djurvård och användning (IACUC).
1. Skörda vävnaden
<ol><li>Förbered aluminiumbåten. Förbered en rektangel aluminium 10cm x 20 cm, vik i mitten för att göra 10 cm dubbelskikt kvadrat. Märk provinformationen på ena sidan och vik den andra sidan för att bilda en båt med bottenyta ca 4 cm x 4 cm.</li>
	<li>Förkyl båten på det flytande kvävet (LN2)i en frigolitlåda. OBS: Om båten är för liten kan provet falla ut ur båten och bli över fruset genom att direkt kontakta LN2, vilket kan leda till fragmentering under kryosectioning.</li>
	<li>Avliva djuret genom livmoderhalsförskjutning enligt institutionella IACUC-riktlinjer, dissekera omedelbart ut vävnaden av intresse.<ol>
<li>Håll intervallet mellan djuranestesi och snäppfrysning så kort som möjligt för att minimera förändringen av metaboliter under vävnadsskörden, särskilt de labiala metaboliterna i hjärnan på grund av postmortem ischemi. OBS: Perfusion djuret med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kommer att öka varaktigheten av ischemi, ytterligare ändra koncentrationerna av labila metaboliter och överdriva artefaktresultaten. Därför rekommenderas inte perfusion eller tvättning av vävnaden med PBS, såvida inte föroreningen av blod eller kroppsvätska är mer oroad än metaboliter försämring eller washout för enskilda projekt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placera omedelbart vävnaden i aluminiumbåten flytande på flytande kväve, stäng locket på frigolitlådan och frys i 2-10 minuter beroende på vävnadens storlek: 2 min, 5 min, 7 min för postnatal dag 1 (P1), P21, P60 mushjärna respektive 10 min för P60 råtta hjärna. OBS: Frys inte vävnaden under längre tid (t.ex. 5 min för P1-mushjärnan) eftersom överfryst kan leda till vävnadsfragmentering under kryosectioning.</li>
	<li>Ta bort båten med tång, vik folien för att linda vävnaden, transportera på torr is och förvara vid -80 °C för senare användning. Om det följs av omedelbar sektionering, bär proverna på torr is till kryostaten. OBS: För att bättre bevara metaboliterna är det att föredra att förvara provet i intakt vävnad och dela upp det precis innan du fortsätter till MALD-avbildning. Vävnaden kan förvaras i -80 °C i upp till 24 månader.</li>
</ol>2. Cryosection vävnaden
OBS: Använd alltid handskar när du hanterar indium tinoxid (ITO) diabilder. Undvik direkt andning på rutschkanan eller använd masker (tillval) för att förhindra kontaminering av mänskligt saliv på vävnadsdelen.
<ol><li>Innan du delar upp vävnaden, samla önskat antal MALDI-kompatibla ITO-belagd glasrutschbanor.</li>
	<li>Testa glidningens ledningsförmåga med hjälp av en voltmeter inställd på motstånd. Märk den sida där en resistensmätning läses: detta är den sida som vävnadssektionerna fäster vid. Placera alltid rutschkanan på en ren pappershandduk för att undvika kontaminering.</li>
	<li>Förkyl rutschkanorna i en kryostat inställd på -20 °C.</li>
	<li>Om vävnadsprover togs bort från -80 °C, låt vävnaden jämvikta i kryostatkammaren i ca 45-60 min beroende på vävnadens storlek. Om proverna avlägsnas från torris, balansera den i ca 30 min.</li>
	<li>Rengör kryostaten noggrant med 70% etanol. Förkyl alla nödvändiga verktyg inklusive tunnspetsad konstnärsborste och tång i kryostatkammaren.</li>
	<li>Ställ in temperaturen på kryostatkammaren och provhuvudet enligt vävnadens typ: -14 °C för lever, -20 °C för muskler och -25 °C för hud9.</li>
	<li>Montera vävnaden på chucken med kryovävnadsinbäddning av förening OCT, undvika OCT från intresseområdet.</li>
	<li>Placera ett rent blad i scenen och lås. Justera scenens läge och provexemplarets vinkel för att uppnå önskad skärvinkel. OBS: Om olika typer/genotyper av vävnad ska skäras, se till att antingen flytta provet så att en ren del av bladet används , eller byt till ett nytt blad innan du skär nästa prov för att förhindra korskontaminering.</li>
	<li>Fortsätt skära tills den region av intresse (t.ex. corpus callosum i hjärnan) hittas. Var noga med att hålla scenen ren genom att borsta bort extra bitar med en konstnärsborste som har balanserats i kryostaten.</li>
	<li>När den önskade regionen har avslöjats, skär mindre sektioner med 10-12 μm tjocklek. Om sektionen tenderar att flagna eller falla isär lätt, höj temperaturen på kryostaten och stanna i intervallet -22 °C till -11 °C. Vi har funnit att den optimala skärtemperaturen för hjärnvävnad är -15 °C till - 18 °C.</li>
	<li>När en bra sektion har skurits, fäst den på ITO-bilden (arbeta i kryostatkammaren).</li>
	<li>Överför en del av vävnaden till ITO-diabilder med hjälp av spetsen på konstnärsborsten.</li>
	<li>Fingervärm sektionen genom att placera ett finger under bilden för att värma upp sektionen för att säkerställa säker montering. Vävnadsdelen kommer först att vända sig till transparent i 5-10 s och sedan bli ogenomskinlig på ca 30-60 s.</li>
	<li>Ställ försiktigt rutschkanan åt sidan i kryostaten.</li>
	<li>Upprepa stegen för andra vävnadsprover, se till att varje del av vävnaden placeras jämnt på bilden och är så justerad som möjligt.</li>
	<li>Eftersom MALDI-målet kan innehålla upp till två bilder placerar du avsnitten från flera exempel på samma kohort på en enda bild eller på två bilder för att säkerställa att de kan analyseras samtidigt.</li>
	<li>När du är klar placerar du ITO-diabilder i en vakuumlåda och överför till en utsugare med torkmedel. Dammsug rutschkanan i 45-60 min. OBS: Om en vakuumdämpare inte finns i labbet, håll diabilderna under -20 °C hela tiden för att undvika försämring av metaboliter.</li>
	<li>Glidlagring och sjöfrakt: Om inte provet bereds av MALDI-bildkärnan för att gå direkt till maldaldiavbildning, lagra diabilderna vid -80 °C eller skicka till kärnanläggningar eller andra MALDI-forskningslaboratorier på torris.</li>
	<li>För att bäst bevara proverna, placera bilderna i glidtransportören, fyll den med kväve (valfritt), försegla med parafilm, placera i en zip-väska, som sedan placeras i en annan zip-väska som innehåller torkmedel. Märk den yttre zip-väskan.</li>
	<li>Fortsätt till förvaring vid -80 °C (upp till 6 månader) eller frakt med tillräcklig torris.</li>
</ol>3. Matris förberedelse
<ol><li>Förbered matrisen. OBS: Alla reagenser måste vara HPLC-klass.<ol>
<li>Bered NEDC vid en koncentration av 10 mg/ml. Bered 10 ml matris upplöst i ett lösningsmedel på 70 % metanol (100 mg NEDC, 7 ml metanol, 3 ml H2O).</li>
		<li>Förbered dessutom ytterligare 10 ml 70% metanol: vattenlösning för att spola sprutan systemet innan du fyller i matrisen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>När bilderna har torkats ut i steg 2.17 placerar du "X"-märkena på glasets tomma utrymme utanför vävnadssektionerna med hjälp av en fet punktsilvermarkör och placerar sedan ett andra "x" med en svart finpunktsmarkör ovanpå silver "X". Det svarta "X" med en skarp kontrast ut ur silverbakgrunden (det djärva silveret "X") kommer senare att fungera som förvaltningsmarkör för det senare masspektraförvärvet i MALDI-instrumentet.</li>
	<li>Ladda bilden i MALDI-glidmetallmålet. Använd plastkåpan och rita/skissera där proverna finns på plastkåpan. Avsätta.</li>
	<li>Skanna bilden av bilden tillsammans med MALDI-målet med flatbäddsskanner. Skruvarna på målytan fungerar som distans för att förhindra skador eller förorening av vävnadsdelen av skannern. Förhandsgranska och skanna det markerade bildområdet i 16-bitars gråskala och 2400 dpi. Spara bilden för senare användning i MALDI MSI.</li>
</ol>4. Matrisdeposition
OBS: Det finns flera metoder för att applicera ett jämnt lager av matris i fin kristallstorlek på MALDI-bilden, inklusive sublimering, droplet bläckstråleutskrift, automatisk matrisspruta och manuell spray med artist airbush9. Vi kommer att använda automatisk matrisspruta som exempel i detta protokoll för dess höga reproducerbarhet.
<ol><li>Start: Slå på matrissprutanheten, se till att ventilen är placerad vid LOAD och starta sprutprogramvaran. Kontrollera att frånluftsfläkten fungerar bra. Starta inte lösningspumpen om den aktiva ventilen inte fungerar som den ska.</li>
	<li>Bekräfta på fliken Comms att allt kommunicerar och starta sedan lösningsmedelspumpen vid .1 ml/min, med ett mottryck på ~500 psi (eller 3,4 MPa).</li>
	<li>Starta tryckluftsflödet till matrissprutan genom att ställa in kvävetanken på 30 psi. Justera sedan tryckregulatorn på sprutans framsida till 10 psi och ställ in sprutmunstyckets temperatur efter önskemål. OBS: Om lufttrycket i bön är lägre än 5 psi kommer sprutmunstycket inte att kunna värmas upp för skydd.</li>
	<li>Med ventilen fortfarande i LOAD-läge, använd en spruta för att spola slingan med 7 ml 70% metanol och fyll sedan slingan med 6 ml matris.</li>
	<li>Placera vävnadsrutschbanorna i behållarna i sprutan, tejpa ner båda ändarna för att förhindra rörelse och för att bevara en matrisfri kant för att undvika förorening av metallklämman på MALALDI-målet av matrisen. OBS: Testning av matrisspray på ett tomt mikroskop glider först innan du fortsätter till värdefulla provbilder rekommenderas starkt.</li>
	<li>Kontrollera att flödeshastigheten och temperaturen är stabila för att börja spruta.</li>
	<li>Välj önskad metod förtestad med hjälp av tom glasbild.</li>
	<li>Tryck på Start. Detta ställer in munstyckstemperaturen och justerar pumpflödet så att det matchar den valda metoden. Växla ventilen från load till spray-läge och bekräfta sedan genom att klicka på Fortsätt.</li>
	<li>Låt systemet köras, vilket tar 5-20 min per bild beroende på metoden. Växla ventilen från spray till lastläge och bekräfta sedan genom att klicka på Fortsätt när den är klar.</li>
	<li>Ta bort diabilderna från sprutan, undersök mönstret för matrisbeläggning under mikroskop för att säkerställa ett jämnt lager av fin matriskristall.</li>
	<li>Efter matrisdeposition placerar du diabilderna i metall-MALD-hållaren för omedelbar användning. Om det bara finns en provbild lägger du till en annan tom bild för att fylla de två utrymmena på MALD-hållaren.</li>
	<li>Rengör systemet omedelbart efter användning enligt tillverkarens anvisningar för att förhindra igensättning av sprutmunstycket.</li>
	<li>När provrutschbanan är belagd med matris, fortsätt antingen omedelbart till MALDI-bildinstrumentet eller skicka den med torr is med samma dubbla zipbagpreparat som beskrivs i steg 2.19. OBS: Under nödsituationer som MALDI-instrumentet är inte tillgängligt för omedelbar användning, lagra den belagda glidningen i vakuumskick eller vid -20 °C i upp till 24 timmar, även om försämringen av vissa metaboliter kan inträffa under lagringen, som inte har studerats noggrant.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Watkins, S. M., German, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+and+biochemical+profiling+in+drug+discovery+and+development.">Metabolomics and biochemical profiling in drug discovery and development.</a> Current Opinion in Molecular Therapeutics. 4, 224-228 (2002).</li><li>Fernie, A. R., Trethewey, R. N., Krotzky, A. J., Willmitzer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+profiling:+from+diagnostics+to+systems+biology.">Metabolite profiling: from diagnostics to systems biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 763-769 (2004).</li><li>Theodoridis, G. A., Gika, H. G., Want, E. J., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography-mass+spectrometry+based+global+metabolite+profiling:+a+review.">Liquid chromatography-mass spectrometry based global metabolite profiling: a review.</a> Analytica Chimica Acta. 711, 7-16 (2012).</li><li>Dienel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+and+Imaging+Mass+Spectrometric+Assays+of+Labile+Brain+Metabolites:+Critical+Importance+of+Brain+Harvest+Procedures.">Metabolomic and Imaging Mass Spectrometric Assays of Labile Brain Metabolites: Critical Importance of Brain Harvest Procedures.</a> Neurochemistry Research. 45, 2586-2606 (2020).</li><li>Dienel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+Assays+of+Postmortem+Brain+Extracts:+Pitfalls+in+Extrapolation+of+Concentrations+of+Glucose+and+Amino+Acids+to+Metabolic+Dysregulation+In+Vivo+in+Neurological+Diseases.">Metabolomic Assays of Postmortem Brain Extracts: Pitfalls in Extrapolation of Concentrations of Glucose and Amino Acids to Metabolic Dysregulation In Vivo in Neurological Diseases.</a> Neurochemistry Research. 44, 2239-2260 (2019).</li><li>Wasek, B., Arning, E., Bottiglieri, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+microwave+irradiation+for+quantitative+analysis+of+neurotransmitters+in+the+mouse+brain.">The use of microwave irradiation for quantitative analysis of neurotransmitters in the mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 307, 188-193 (2018).</li><li>Andres, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+workflow+for+mass+spectrometry-based+metabolomics+analysis+of+the+heart.">Improved workflow for mass spectrometry-based metabolomics analysis of the heart.</a> Journal of Biological Chemistry. 295, 2676-2686 (2020).</li><li>Lu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+Measurement:+Pitfalls+to+Avoid+and+Practices+to+Follow.">Metabolite Measurement: Pitfalls to Avoid and Practices to Follow.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).</li><li>Norris, J. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+tissue+specimens+by+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+imaging+mass+spectrometry+in+biological+and+clinical+research.">Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research.</a> Chemical Reviews. 113, 2309-2342 (2013).</li><li>Miura, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahighly+sensitive+in+situ+metabolomic+imaging+for+visualizing+spatiotemporal+metabolic+behaviors.">Ultrahighly sensitive in situ metabolomic imaging for visualizing spatiotemporal metabolic behaviors.</a> Analytical Chemistry. 82, 9789-9796 (2010).</li><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+high-throughput+metabolomics+using+ultrahigh-field+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry.">Towards high-throughput metabolomics using ultrahigh-field Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> Metabolomics. 4, 128-140 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+MS+imaging+of+metabolites+with+a+N-(1-naphthyl)+ethylenediamine+dihydrochloride+matrix+and+its+application+to+colorectal+cancer+liver+metastasis.">MALDI-TOF MS imaging of metabolites with a N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride matrix and its application to colorectal cancer liver metastasis.</a> Analytical Chemistry. 87, 422-430 (2015).</li><li>Sladkova, K., Houska, J., Havel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+desorption+ionization+of+red+phosphorus+clusters+and+their+use+for+mass+calibration+in+time-of-flight+mass+spectrometry.">Laser desorption ionization of red phosphorus clusters and their use for mass calibration in time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communication in Mass Spectrometry. 19, 3114-3118 (2019).</li><li>Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+tissue+analysis+using+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry:+practical+aspects+of+sample+preparation.">Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation.</a> Journal of Mass Spectrometry. 38, 699-708 (2003).</li><li>Greco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+proteomics.">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical proteomics.</a> Expert Review of Proteomics. 15, 683-696 (2018).</li><li>Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+mass+spectrometry:+an+emerging+technology+for+microbial+identification+and+diagnosis.">MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 791 (2015).</li><li>Hankin, J. A., Murphy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+MALDI+IMS+intensity+and+measured+quantity+of+selected+phospholipids+in+rat+brain+sections.">Relationship between MALDI IMS intensity and measured quantity of selected phospholipids in rat brain sections.</a> Analytical Chemistry. 82 (20), 8476-8484 (2010).</li><li>Prentice, B. M., Chumbley, C. W., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+Quantification+of+Rifampicin+by+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry+Using+Multiple+TOF/TOF+Events+in+a+Single+Laser+Shot.">Absolute Quantification of Rifampicin by MALDI Imaging Mass Spectrometry Using Multiple TOF/TOF Events in a Single Laser Shot.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (1), 136-144 (2017).</li><li>Quanico, J., Franck, J., Wisztorski, M., Salzet, M., Fournier, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+MALDI+Mass+Spectrometry+Imaging+and+Parafilm-Assisted+Microdissection-Based+LC-MS/MS+Workflows+in+the+Study+of+the+Brain.">Combined MALDI Mass Spectrometry Imaging and Parafilm-Assisted Microdissection-Based LC-MS/MS Workflows in the Study of the Brain.</a> Methods in Molecular Biology. 1598, 269-283 (2017).</li><li>Trim, P. J., Snel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+MALDI+MS+imaging:+Current+technologies+and+future+challenges.">Small molecule MALDI MS imaging: Current technologies and future challenges.</a> Methods. 104, 127-141 (2016).</li></ol>

Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

MALDI-Imaging (MALDI-MSI) är en etikettfri bildteknik som gör det möjligt för forskare att undersöka fördelningen av olika biomolekyler och deras modifieringar i vävnad, patologins molekylära grund. Kombinerad användning av MALDI-MSI med traditionella LC-MS-metoder för vävnadsanalys ger samma molekylära djup som traditionella Omics-arbetsflöden men som också behåller det rumsliga förhållandet mellan dessa signaler inom mobilnätet. Provberedningen är det mest kritiska steget i MALDI MSI och står för variationen i de slutliga avläsningarna av metabolomikstudier som utförs i olikalaboratorier 4. Här tillhandahåller vi ett omfattande men praktiskt protokoll för att standardisera provberedningen för metabolomisk profilering med hjälp av MALDI MSI, i hopp om att det gynnar ett brett forskarsamhälle att implementera MALDI MSI i sin nuvarande och framtida forskning från grundbiologi till translationella studier.
Man måste alltid komma ihåg alla försiktighetsåtgärder för att minimera förändringar i molekylära profiler (både överflöd och rumslig fördelning) under provberedningar och undvika kontaminering. För det första, minimera tiden mellan djurdödshjälp och vävnadsskörd, såsom frusen på plats eller uppvärmd av mikrovågsfixering för att inaktivera enzymer i hjärnan för att minska ansvaret för postmortem ischemi4,5,6. För det andra är provet är avgörande. Otillräcklig frysning kommer att orsaka nedbrytning och förlust av metaboliterna, medan överfrysning leder till vävnadsfragmentering under kryosectioning. Frystiden bör alltid testas först enligt tidigare rapporterade studier, och studien av utvecklingsmushjärnan som presenteras i detta dokument ger referenspunkterna för gnagare hjärnvävnad. För det tredje kommer det att krävas lämplig praxis för att skära av biologiska vävnader och överföra deras sektioner till ITO-bilderna. Det är viktigt att notera att när du använder borsten för att plocka upp avsnittet från scenen bör borsten användas försiktigt. Låt borsten endast komma i kontakt med vävnadsdelens kanter för att minska risken för kontaminering och fragmentering av sektioner. Platta till avsnittet på bilden så mycket som möjligt, detta förhindrar curling av avsnittet under fingeruppvärmning. För det fjärde, när du monterar på ITO-bilden, se till att hela sektionen är väl ansluten till ITO-bilden eftersom olika delar av vävnaden kan kräva olika tid för fingeruppvärmning. Till exempel kräver hjärntumörvävnad längre uppvärmningstid än normal hjärnvävnad. En dålig montering kan leda till lossning och fragmentering av vävnaden under MALDI-MS skanning. Tänk på att fingeruppvärmningen kan möjliggöra enzymaction och metabolism som orsakar artefaktiska förändringar av metaboliter. För det femte spelar en fin och enhetlig nedfall av MALDI-matrisen en viktig roll för att uppnå korrekt rumslig information och stark MALDI-MS-signal. Det rekommenderas att testa matrisbesprutningen på en tom diabild och observera kristallmönstret under ett mikroskop för att verifiera korrekt täckning innan du fortsätter till beläggningen av ädelprovsrutschbana. Och slutligen, eftersom en enskild forskare utför vävnadsskörden och glidpreparatet i olika hastigheter, skulle det vara idealiskt att ha en person att hantera provberedningen för provet i samma kohort, för att minimera variationen.
I protokollet ovan anges standardförfaranden som kan anpassas efter behoven hos vissa experiment. Till exempel kan en kryosektionerande gel OCT, som normalt används vid kryosektionering av provet, användas ytterligare som ett monteringslim till vävnadschucken (som i studien som beskrivs ovan). Tidigare studier har visat att polymerkomponenten i OCT orsakar stark jonsuppression14. Inbäddning av provet kan dock vara oundvikligt i de fall där vävnaden är för bräcklig för att skäras utan ytterligare stöd från en polymergel. För att bekämpa signaldämpning i dessa fall kan vävnaderna behöva tvättas med seriell tvättning i 70% etanol och 95% etanol för att avlägsna återstående OCT för påvisande av proteiner eller lipider, medan tvättning inte rekommenderas för påvisande av små molekylära metaboliter9.
MALDI MSI har blivit allt mer relevant i både forskningslaboratoriet och klinisk praktik. Till exempel har MALDI MSI nyligen visat sig användbart i studier av proteomik för att karakterisera fenotypisk funktionell status hos en organism15, och för att fungera som ett medel för mikrobiell identifiering och diagnos av efterföljande sjukdom16. Medan MALDI MSI stöder ett brett spektrum av applikationer, finns det vissa begränsningar förknippade med att enbart förlita sig på denna teknik, särskilt när det gäller att skilja mellan liknande arter eller metaboliter och identifiering av specifika mål. En annan utmaning är kvantifieringen av metabolitkoncentrationen enligt MALDI MSI-signaler. Det antas ofta att jonöverskott i MALDI MSI-spektra och den rumsliga fördelningen (eller relativa överflöd) av motsvarande molekylära arter över dissekerade vävnader är väl korrelerade. Man bör dock alltid komma ihåg att förhållandet mellan jonintensitet och mängden motsvarande molekylära arter kompliceras av många faktorer, inklusive, men inte begränsat till, effekter av jonsuppression, förändringar i vävnadsstruktur och jonmolekylreaktioner17. Tekniker som använder interna standarder kan implementeras för absolut kvantifiering (μmol/g vävnad) i MALDI-MSI18. Dessa två utmaningar hanteras vanligtvis med det kombinerade arbetsflödet för MALDI MSI med flytande kromatografi tandem MS(LC-MS/MS) tekniker, varigenom mald-MS möjliggör kartläggning av den region av intresse, som senare utsätts för mikroextraktion och LC-MS/MS för att ge mer information för att identifiera metaboliten19.
MS-baserade avbildningsmetoder har utvecklats under de senaste åren som ett alternativ modalitet till tidigare tekniker för avbildning av små molekylmetaboliter. Med utvecklingen och den växande populariteten hos MALDI MSI förväntas MALDI-avbildning bli ett nytt standardverktyg för visualisering av små molekyler. Avbildning av lipid och endogena små molekyler (t.ex. signalsubstanser och metaboliter) i det biologiska sammanhanget, samt avbildning av xenobiotika för utveckling av nya farmaceutiska medel är av särskilt intresse. Dessa tre områden förväntas ha snabba framsteg med tillämpning av MALDI MSI inom en snar framtid20.

Metaboliter, intermediärer eller slutprodukter från metabolismen, inklusive nukleotider, aminosyror eller organiska syror, lipider, är nyckelkomponenter till biologiska funktioner och processer. Metabolomik, studien av metaboliter, möjliggör utforskning av deras biokemiska interaktioner och förståelsen av deras roller i samband med grundläggande, translationell och klinisk forskning. Metaboliter är starkt förknippade med fenotyper av organismer och ger information om biokemiska aktiviteter som uppstår under cellulär metabolism1. Därför, förutom genomik och proteomik, har metabolomik dykt upp som ett viktigt verktyg för att förstå både fysiologiska och patologiska förhållanden. Till exempel används metabolomik för att belysa mekanismerna bakom befintliga läkemedel samt deras tolerans. I läkemedelsutveckling är xenobiotisk metabolism användbar för att bedöma aktiviteten eller toxiciteten hos metaboliter över arter, vilket senare innebär att stödja personlig medicin2. Trots den breda tillämpningen av metabolomik kan avbildning av metaboliter vara utmanande på grund av metaboliters kemiska reaktivitet, strukturell heterogenitet och brett koncentrationsområde3. Koncentrationerna av labila metaboliter inklusive högenergiföreningar, glukos, laktat, glykolytisk, pentoshuntväg och TCA-cykel intermediärer, fosfolipider, signalsubstanser, signalföreningar, kan dock förändras inom någrasekunderoch utvecklas över minuter när vävnadsenzymer är aktiva under vävnadsskördsförfaranden, såsom postmortem ischemi vidhjärnskörd 4,5,6 . För att säkerställa korrekt metabolomikdatainsamling är lämplig och noggrann provberedning kritisk7,8. Nuvarande etablerade plattformar för mätning av metaboliter inkluderar NMR, enzymanalyser och masspektrometri (inklusive vätske- och gaskromatografi), varav den sista diskuteras vidare nedan.
MALDI-MSI är en toppmodern teknik som möjliggör analys av komplexa prover genom detektion av enskilda molekylära arter. MALDI MSI ger fördelen av att snabbt och reproducerbart kunna mäta olika molekylära föreningar i biologiska prover. Masspektrometriavbildning möjliggör vidare produktion av bilder som representerar vävnadsbiologi baserat på dess sammansatta metaboliter, och gör det samtidigt som den rumsliga fördelningen av metaboliterna iprovet 9bevaras. Maldis förmåga att upptäcka analyter i ett prov utan användning av antikroppsmärkning, strukturella modifieringar eller andra specialiserade reagenser, såsom de som används vid immunostaining, i kombination med dess förmåga att övervaka hundratals molekyler inom ett enda experiment, utgör bara några av de fördelar som MS imaging ger när det gäller metabolisk profilering10, 11. I artikel 11 i eu 2. Förutom vanlig matris som 2,5-dihydroxybensosyra (DHB) och 9-aminoacridine (9-AA), nyligen upptäckt ny matris N -(1-Naphthyl) Etylendiamin Dihydrochloride (NEDC), som är väl lämpad för analyser av olika låg molekylvikt metaboliter, har ytterligare förbättrat tillämpningen av MALDI MSI vid metabolisk profilering12.
Trots den breda tillämpningen av MALDI MSI förhindrar instrumentets höga kostnader och komplexiteten i försöksförfarandet dess bredare genomförande i enskilda forskningslaboratorier. Därför stöds de flesta av MALDI MSI-studierna genom gemensamma kärnfaciliteter. Provberedningen, inklusive glidberedning och matrisbeläggning, är det mest kritiska steget i MALDI MSI. Glidpreparatet utförs dock normalt i enskilda forskares laboratorium, vilket skapar potentiella variationer i senare MALDI MSI-förvärv. Här strävar vi efter att tillhandahålla ett detaljerat protokoll för provberedning av biologiska prover innan vi fortsätter till MALDI MSI-mätningar och använda en metabolomisk profilering av utvecklingsmushjärnan som exempel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Andwin Scientific&#160;Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-111-2302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex speed MALDI-TOF MS system</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>MALDI-TOF MS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Syringe with Luer-Lok Tips</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer General Use Syringe Needles</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Daltonics&#160;GLASS SLIDES MALDI IMAGNG</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>NC0380464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics&#160;</td>
			<td></td>
			<td>AC219095000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epson Perfection V600 Photo Scanner</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Perfection V600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;5-Place Slide Mailer</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Digital Auto-Range Multimeter</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>01-241-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexImaging v3.0</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>Bruker MS imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>MMX04751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Water</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>W5-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTX M5 Sprayer</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td></td>
			<td>Automatic heated matrix sprayer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#160;Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC&#160;Ziploc Freezer Bag</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-111-3769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N -(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride (NEDC)</td>
			<td>Millipore Sigma Aldrich</td>
			<td>222488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCiLS Lab (2015b)</td>
			<td>SCiLS Lab</td>
			<td></td>
			<td>Advanced MALDI MSI data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;CryoStar NX50 Cryostat</td>
			<td>Fisher Thermo Scientific</td>
			<td>95-713-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-642-7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for metabolic profiling using maldi mass spectrometry imaging

Metabolomik, studien för att identifiera och kvantifiera små molekyler och metaboliter som finns i ett experimentellt prov, har dykt upp som ett viktigt verktyg för att undersöka de biologiska aktiviteterna under utveckling och sjukdomar. Metabolomikmetoder används i stor utsträckning i studien av cancer, näring/kost, diabetes och andra fysiologiska och patologiska tillstånd som involverar metaboliska processer. Ett fördelaktigt verktyg som hjälper till med metabolomisk profilering som förespråkas i detta dokument är matrisassisterad laserdesorption/joniseringsmasspektrometriavbildning (MALDI MSI). Dess förmåga att upptäcka metaboliter på plats utan märkning, strukturella modifieringar eller andra specialiserade reagenser, såsom de som används vid immunstainering, gör MALDI MSI till ett unikt verktyg för att främja metoder som är relevanta inom metabolomik. En lämplig provberedningsprocess är avgörande för att ge optimala resultat och kommer att vara i fokus för detta dokument.

Det representativa experimentet utfördes enligt arbetsflödet i figur 1. De utvecklingsmässiga C57BL wildtype mus hjärnorna av postnatal dag 1, 21, 60 (vuxen) skördades som beskrivs ovan enligt CUNY IACUC riktlinjer och var snap frysta i 2, 5 och 7 min, respektive, på en aluminium båt flytande på flytande kväve. De frysta vävnaderna var cryosectioned på 10 μm tjocklek avsnitt vid −15 °C inställd för både provhuvud och kammaren. Vävnads cryosections överfördes sedan försiktigt till den förkylda ledande sidan av ITO-belagda glas diabilder för MALD-bildbehandling. Monterade cryosections på ITO bilder var uttorkade i vakuum i 45 min vid rumstemperatur, följt av matris nedfall med hjälp av automatisk matris spruta. Matrix NEDC användes för att detektera metaboliter, och en matrislösning på 10 mg/ml i metanol/vatten (70/30, v/v) deponerades med en flödeshastighet på 0,1 ml/min och en munstyckestemperatur på 75 °C under 12 cykler med 5 torkning mellan varje cykel. En spruthastighet på 1300 mm/min, spåravstånd på 2 mm, N2 gastryck på 10 psi och flödeshastighet på 3 L/min och munstyckeshöjd på 40 mm användes.
MALDI masspektra förvärvades i negativt jonläge av MALDI-instrumentet (TOF) MSI. 0,5-1 μL röd fosfor (Pn-kluster med n = 1 - 90) emulsion i metanol deponerades på ITO-diabilderna, bredvid de monterade vävnaderna, och användes för att kalibrera instrumentet i massområdet 100-1000 m/z genom att tillämpa kvadratisk kalibreringskurva13. Laser spot diametrarna var fokuserade på "Medium" modulerad strålprofil för 50 μm rasterbredd. Spektra inom massområdet från m/z 50 till 1000 förvärvades vid en 1000 Hz för 500 skott. Masspektra data registrerades, och avbildningen analyserades ytterligare med hjälp av avancerad MALDI MSI data analys programvara. Jonbilder genererades med RMS-normalisering (Root-Mean Square) vid en lagerplatsbredd på ±0,25 Da.
Resultaten i figur 2 visar utdatabilder från MALDI MSI-dataanalysprogramvara av m/z-spektra som valts ut från varje 100 Dalton-intervall, vilket tydligt visar verktyget för identifiering av spektra från små molekylmetaboliter till lipider med hög molekylvikt. Varje rad visar respektive jonvärmekartor som innehåller både rumslig och spektralinformation om en viss metabolitart i tre vävnader som samlats in vid postnatal dag 1, 21 och 60. För varje representativ m/z kan analys av regional fördelning och jonförekomst användas för att jämföra relativa mängder motsvarande arter mellan olika åldrar. En styrka i MALDI MSI-metoden är förmågan att urskilja särdragen hos vissa arter som identifierats av m/z till utvecklingsmässiga milstolpar eller specifika anatomiska strukturer. Vissa metaboliter observeras berikas i P1-nyfödda (m/z 320,1), berikade hos P60 vuxna (m/z 846,5), eller jämnt fördelade över åldrar (m/z 480,3); Andra molekylära arter är särskilt berikade i grå materia (m/z 117.1; 524.3; 765.1), vit materia (m/z 673.4; 846.5) eller CSF/ventriklar (m/z 239.0) (Figur 2A). Rumslig fördelning av representativa metaboliter inklusive hypoxantin (m/z 135.0), N-Acetyl-L-asparaginsyra (m/z 174.0), Arachidonic syra (m/z 303.2) och flera lipider såsom lysofosfatidyletanolamin LPE (18:1) (m/z 478.3), LPE(2)0:4) (m/z 500.3), LPE (22:6) (m/z 524.3), fosfatidyletanolamin PE (44:10) (m/z 838.5), Fosfatidylinositol PI(38:4) (m/z 885.6) visas också (Figur 2B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62008/62008fig01.jpg"> Figur 1. Arbetsflöde för MALDI- flygtid (TOF) masspektrometriavbildning. Den snäppfrysta vävnaden kryrosectioned i kryostat och monteras på ITO slide. → Bilden med vävnadssektioner är belagd med ett fint lager matris med automatisk matrisspruta. → samlas in av MALDI-TOF MSI-instrumentet vid en raster på 20-200um. → Data analyseras och bilderna genereras med hjälp av avancerad MALDI MSI-dataanalysprogramvara. Skalbar: 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62008/62008fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62008/62008fig2v2.jpg"> Figur 2. Representativ utgång med utvalda m/z-spektra från masspektrometri förvärvad vid 50 μm lateral upplösning. A)En värmekarta visar den rumsliga fördelningen av specifika metabolitarter som valts ut var 100:e Dalton m/z-intervall under de tre utvecklingsmässiga milstolpar som identifierats vid P1, P21 och P60. B)Rumslig fördelning av representativa metaboliter vid P1, P21 och P60, inklusive hypoxantin, N-acetyl-L-asparaginsyra, arachidonsyra och olika lipidarter såsom lysofosfatidyletanolamin (LPE), fosfatidyletanolamin (PE), fosfatidylinositol (PI). Skalbar, 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62008/62008fig2v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging at JoVE.com

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Målet med detta protokoll är att ge detaljerad vägledning om provberedningen när man planerar för experiment med MALDI MSI för att maximera metabolisk och molekylär detektion i biologiska prover.

Provberedning för metabolisk profilering med MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI Provberedning: Ultra tunt lager Metod

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Profilering av metyltransferaser och andra S-Adenosyl- L-Homocystein-bindande proteiner av Capture Compound masspektrometri (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange & MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amid Hydrogen / Deuterium Exchange och MALDI-TOF-masspektometri Analys av Pak2 Aktivering

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Profilering Tiol Redox Proteome Användning Isotope spektrometri Taggning Mäss

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Ett protokoll för identifiering av protein-proteininteraktioner Baserat på<sup&gt; 15</sup&gt; N metabolisk märkning, immunoutfällning, kvantitativa masspektrometri och Affinity modulering

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

En ny metod för jämförande analys av multiproteinkomplex baserat på<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolic Märkning och kvantitativ masspektrometri

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

MALDI-Masspektrometrisk Imaging för undersökning av metaboliter i<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; rotknölar

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Provberedning för Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Cellulär redoxprofilering med hög innehållsmikroskopi

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Provberedning och avbildning av Exosomes av transmissionselektronmikroskopi

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...