Name: generation and assembly of virus-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus
Uploaded: 2021-07-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus at JoVE.com

ويدعم البرامج البحثية في مختبر ليانغ في إيموري المعهد الوطني الأمريكي للعلوم الطبية العامة (NIGMS)، والمعاهد الوطنية للصحة (NIH) تحت رقم الجائزة R01GM130950، وصندوق بدء البحث في كلية الطب بجامعة إيموري. ويعترف صاحب البلاغ بأعضاء مختبر ليانغ للدعم المفيد والمناقشة النقدية.

1. الاستنساخ الجزيئي
ملاحظة: تم استخدام ليجاس الاستنساخ المستقل (LIC) لجعل RSV ثنائي cistronic coexpression بناء البلازميد. LIC هو أسلوب وضعت في أوائل 1990s، والذي يستخدم النشاط إكسو 3'-5 'من بوليمرات الحمض النووي T4 لخلق يتدلى مع التكامل بين ناقلات وإدراج الحمض النووي21،</...

<ol>
	<li>Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+and+replication+of+nonsegmented+negative-strand+RNA+viruses.">Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).</li><li>Lamb, R. A., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields virology. , (2013).</li><li>Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+syncytial+virus:+virology,+reverse+genetics,+and+pathogenesis+of+disease.">Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).</li><li>Fearns, R., Deval, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+antiviral+approaches+for+respiratory+syncytial+virus+and+other+mononegaviruses:+Inhibiting+the+RNA+polymerase.">New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase.</a> Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).</li><li>Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+replication+by+respiratory+syncytial+virus+(RSV)+is+directed+by+the+N,+P,+and+L+proteins;+transcription+also+occurs+under+these+conditions+but+requires+RSV+superinfection+for+efficient+synthesis+of+full-length+mRNA.">RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA.</a> Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).</li><li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+metapneumovirus+polymerase+phosphoprotein+complex.">Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex.</a> Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).</li><li>Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+rabies+virus+polymerase+complex+from+electron+cryo-microscopy.">Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).</li><li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+respiratory+syncytial+virus+RNA+polymerase.">Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase.</a> Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).</li><li>Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+paramyxovirus+polymerase+complex+reveals+a+unique+methyltransferase-CTD+conformation.">Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).</li><li>Gilman, M. S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Respiratory+Syncytial+Virus+Polymerase+Complex.">Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex.</a> Cell. 179 (1), 193-204 (2019).</li><li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+L+Protein+of+Vesicular+Stomatitis+Virus+from+Electron+Cryomicroscopy.">Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy.</a> Cell. 162 (2), 314-327 (2015).</li><li>Jenni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Vesicular+Stomatitis+Virus+L+Protein+in+Complex+with+Its+Phosphoprotein+Cofactor.">Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor.</a> Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).</li><li>Renner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocapsid+assembly+in+pneumoviruses+is+regulated+by+conformational+switching+of+the+N+protein.">Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein.</a> Elife. 5, 12627 (2016).</li><li>Cox, R. M., Plemper, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+organization+of+paramyxovirus+particles.">Structure and organization of paramyxovirus particles.</a> Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).</li><li>Desfosses, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+vesicular+stomatitis+virus+nucleocapsid+into+a+bullet+shape.">Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape.</a> Nature Communications. 4, 1429 (2013).</li><li>Green, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+mechanism+for+RNA+encapsidation+by+negative-strand+RNA+viruses.">Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).</li><li>Jamin, M., Yabukarski, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsegmented+Negative-Sense+RNA+Viruses-Structural+Data+Bring+New+Insights+Into+Nucleocapsid+Assembly.">Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly.</a> Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).</li><li>Wan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+assembly+of+the+Ebola+virus+nucleocapsid.">Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid.</a> Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).</li><li>Mendes, A., Kuhn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphavirus+Nucleocapsid+Packaging+and+Assembly.">Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly.</a> Viruses. 10 (3), (2018).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+trackable+assembly+of+RNA-specific+nucleocapsids+of+the+respiratory+syncytial+virus.">In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).</li><li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+(LIC-PCR).">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).</li><li>Li, C., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation+independent+cloning+irrespective+of+restriction+site+compatibility.">Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility.</a> Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).</li><li>Green, R., Rogers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+chemically+competent+E.+coli.">Transformation of chemically competent E. coli.</a> Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).</li><li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM.">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li><li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Staining+and+Image+Classification+-+Powerful+Tools+in+Modern+Electron+Microscopy.">Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy.</a> Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).</li><li>Aebi, U., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glow+discharge+unit+to+render+electron+microscope+grids+and+other+surfaces+hydrophilic.">A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic.</a> Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).</li><li>Green, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Access+to+RNA+encapsidated+in+the+nucleocapsid+of+vesicular+stomatitis+virus.">Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus.</a> Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).</li><li>Alvarez Paggi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conformational+switch+balances+viral+RNA+accessibility+and+protection+in+a+nucleocapsid+ring+model.">A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).</li><li>Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+vesicular+stomatitis+virus+nucleoprotein-RNA+complex.">Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex.</a> Science. 313 (5785), 357-360 (2006).</li><li>Tawar, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+nucleocapsid-like+nucleoprotein-RNA+complex+of+respiratory+syncytial+virus.">Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus.</a> Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).</li><li>Galloux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+viral+phosphoprotein+binding+site+on+the+surface+of+the+respiratory+syncytial+nucleoprotein.">Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein.</a> Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).</li><li>Milles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembly+of+Measles+Virus+Nucleocapsid-like+Particles:+Kinetics+and+RNA+Sequence+Dependence.">Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence.</a> Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).</li><li>Desfosses, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+cryo-EM+structures+of+RNA-specific+measles+virus+nucleocapsids+provide+mechanistic+insight+into+paramyxoviral+replication.">Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).</li></ol>

الجسيمات المعروفة الشبيهة بالنيوكليوكابسيد (NCLP) هياكل غير المقوسة السلبية الشعور (NNS) فيروسات الحمض النووي الريبي تبين أن NCLPs تجميعها هي N معقدة مع الحمض النووي الريبي الخلوي المضيف عندما مفرط في التعبير في أنظمة التعبير البكتيرية أو eukaryotic15,16,<sup class="xref...

غير الفئات السلبية الشعور (NNS) فيروسات الحمض النووي الريبي تشمل العديد من مسببات الأمراض البشرية الهامة، مثل داء الكلب، والإيبولا، وفيروس التزامن التنفسي (RSV)1،2. RSV هو السبب الرئيسي لأمراض الجهاز التنفسي مثل التهاب القصيبات والالتهاب الرئوي في الأطفال الصغار وكبار السن في جميع أنحاء العالم3. حاليا، لا توجد لقاحات فعالة أو علاجات مضادة للفيروسات المتاحة لمنع أو علاج RSV4. كجزء من دورة الحياة، يعمل جينوم RSV كنموذج للنسخ المتماثل من قبل بوليمرات الحمض النووي الريبي التابع ل RSV لإنتاج مستضد، والذي بدوره يعمل كنموذج لتوليد جينوم ذري. يتم كذلك تحلل كل من الجينوم والرنانات المضادة للجينوم بالكامل بواسطة النوى (N) لتشكيل النيوكليوكابسيدات (NCs)3. لأن NCs بمثابة قوالب لكل من النسخ المتماثل والنسخ من قبل بوليمراز RSV، التجمع NC السليم أمر بالغ الأهمية للبوليميراز للوصول إلى قوالب لتخليق الحمض النووي الريبي5. ومن المثير للاهتمام، استنادا إلى التحليلات الهيكلية للبوليميرا الفيروسية NNS، فمن المفترض أن العديد من البروتينات N ينفصم عابرا من NCs للسماح بالوصول إلى البوليميراز وإعادة ربط إلى الجيش الملكي النيبالي بعد تخليق الحمض النووي الريبي6،7،8،9،10،12.
حاليا، وقد أنشئت RSV الحمض النووي الريبي البلمرة المقايسة باستخدام البوليمرات RSV تنقية على قوالب الجيش الملكي النيبالي عارية قصيرة13،14. ومع ذلك، فإن أنشطة البوليميراز RSV لا تصل إلى المستوى الأمثل، كما لوحظ في المنتجات غير المعالجة والإجهاضية التي تولدها بوليمرات RSV عند استخدام قوالب الحمض النووي الريبي العارية. عدم وجود NC مع الحمض النووي الريبي فيروس محددة هو الحاجز الرئيسي لمزيد من الفهم الآلي لتوليف الحمض النووي الريبي RSV. ولذلك، باستخدام قالب الحمض النووي الريبي أصيلة يصبح حاجة ماسة لتعزيز المعرفة الأساسية من تخليق الحمض النووي الريبي RSV. الهياكل المعروفة للجسيمات الشبيهة بالنيوكليوكابسيد (NCLPs) من RSV وغيرها من فيروسات الحمض النووي الريبي NNS تكشف عن أن الحمض النووي الريبي في NCLPs هي إما الحمض النووي الريبي الخلوي العشوائي أو متوسط الحمض النووي الريبي الجينومي الفيروسي15،16،17،18،19. معا، العقبة الرئيسية هي أن N يربط بشكل غير محدد إلى RNAs الخلوية لتشكيل NCLPs عندما يتم التعبير عن N في الخلايا المضيفة.
للتغلب على هذه العقبة، أنشأنا بروتوكولا للحصول على RNA خالية (N0)أولا وتجميع N0 مع الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسية الأصيلة في NCLPs20. مبدأ هذا البروتوكول هو الحصول على كمية كبيرة من N RNA خالية من المؤتلف (N0)من خلال التعبير المشترك N مع مرافق, المجال N-محطة من فوسفوبروتين RSV (PNTD). يمكن تحفيز N0P المنقى وتجميعه في NCLPs عن طريق إضافة أوليغوس الحمض النووي الريبي الخاص ب RSV ، وخلال عملية التجميع ، يتم إزاحة المرافق PNTD عند إضافة أوليغوس الحمض النووي الريبي.
هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول لتوليد وتجميع NCs RSV RNA محددة. في هذا البروتوكول، نقوم بوصف الاستنساخ الجزيئي، وإعداد البروتين، والتجميع في المختبر، والتحقق من صحة التجميع المعقد. ونسلط الضوء على استراتيجية الاستنساخ لتوليد بنى ثنائية السيسترونيك للكراز المشترك للبروتين للاستنساخ الجزيئي. لإعداد البروتين، ونحن نصف إجراءات زراعة الخلايا، واستخراج البروتين، وتنقية مجمع البروتين. ثم نناقش طريقة التجميع في المختبر من NCs RSV RNA محددة. وأخيرا، نستخدم كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) والمجهر الإلكتروني السلبي للبقع (EM) لتوصيف وتصور NCLPs المجمعة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1293px;" width="1293">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Agarose</td>
			<td style="width:302px;">SIgma</td>
			<td style="width:301px;">A9539-500G</td>
			<td style="width:319px;">making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>concentrate the protein sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Ampicillin sodium</td>
			<td style="width:302px;">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td style="width:301px;">5118.111317A</td>
			<td>antibiotic for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">AseI</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">R0526S</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cobalt (High Density) Agarose Beads</td>
			<td style="width:302px;">Gold Bio</td>
			<td>H-310-500</td>
			<td>For purification of His-tag protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Corning LSE Digital Dry Bath Heater</td>
			<td style="width:302px;">CORNING</td>
			<td style="width:301px;">6885-DB</td>
			<td>Heate the sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">dCTP</td>
			<td style="width:302px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:301px;">10217016</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">dGTP</td>
			<td style="width:302px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:301px;">10218014</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Glycerol</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">G5516-4L</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HEPES</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">H3375-100G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HiTrap Q HP</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">GE29-0513-25</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Imidazole</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">I5513-100G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)</td>
			<td style="width:302px;">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td style="width:301px;">1116.071717A</td>
			<td>induce the expression of protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:302px;">VWR</td>
			<td style="width:301px;">47730-598</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor</td>
			<td style="width:302px;">SpectraLab</td>
			<td style="width:301px;">MSX-XL-2020</td>
			<td>sonicator for lysing cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Negative stain grids</td>
			<td style="width:302px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:301px;">CF400-Cu-TH</td>
			<td>For making negative stain grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">New Brunswick Innova 44/44R</td>
			<td style="width:302px;">eppendorf</td>
			<td style="width:301px;">M1282-0000</td>
			<td>Shaker for culturing the cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Nonidet P 40 Substitute</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">74385-1L</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">OneTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">M0480L</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:302px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:301px;">28706</td>
			<td>Purify DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">SSPI-HF</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">R3132S</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td>GE29-0915-96</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td>70099-3</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td style="width:302px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:301px;">36-101-0816</td>
			<td>Centrifuge, highest speed 20,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Trizma hydrochloride</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">T3253-250G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Uranyl Formate</td>
			<td style="width:302px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:301px;">22451</td>
			<td>making negative stain solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and assembly of virus-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus

استخدام قالب الحمض النووي الريبي أصيلة أمر بالغ الأهمية لتعزيز المعرفة الأساسية لتوليف الحمض النووي الريبي الفيروسية التي يمكن أن توجه كل من اكتشاف ميكانيكي وتطوير المقايسة في علم الفيروسات. إن نموذج الحمض النووي الريبي لفيروسات الحمض النووي الريبي غير المخلوقة (NNS) من فيروسات الحمض النووي الريبي (NNS)، مثل فيروس التزامن التنفسي (RSV)، ليس جزيء الحمض النووي الريبي وحده، بل هو مركب الريبونوكليوبروتين (N) المنقوع. على الرغم من أهمية قالب الحمض النووي الريبي الأصيل ، فإن توليد وتجميع مثل هذا المجمع ريبونوكليوبوبروتين لا تزال متطورة وتتطلب توضيحا متعمقا. التحدي الرئيسي هو أن RSV N مفرط التعبير يربط بشكل غير محدد بالرنانات الخلوية لتشكيل جزيئات عشوائية تشبه النيوكليوكابسيد (NCLPs). هنا، أنشأنا بروتوكولا للحصول على N خالية من الحمض النووي الريبي (N0)أولا من خلال المشاركة في التعبير N مع فوسفوبروتين مرافق (P)، ثم تجميع N0 مع أوليغوس الحمض النووي الريبي مع تسلسل الحمض النووي الريبي RSV محددة للحصول على نواة خاصة بالفيروسات (NCs). يوضح هذا البروتوكول كيفية التغلب على صعوبة في إعداد هذا المعقد ribonucleoprotein الفيروسية الصعبة تقليديا.

تنقية بروتين N0P الخالي من الحمض النووي الريبي مع هذا البروتوكول، يمكن الحصول على مركب RSV N0P القابل للذوبان على نطاق واسع. تم التعبير عن الطول الكامل للجزء N و N النهائي من بروتينات P مع 10X His-Tag على بروتين N في الإشريكية القولونية. تم تنقية N0P باستخدام عمود الكوب?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus at JoVE.com

Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

للتحليل الميكانيكي المتعمق للفيروس التزامني التنفسي (RSV) تخليق الحمض النووي الريبي ، نبلغ عن بروتوكول لاستخدام فوسفوبروتين الفوسفورتين المرافق (P) للكوادر الخالية من الحمض النووي الريبي (N0)للتجميع المختبري اللاحق للنيوكليوكابسيدات الخاصة بالفيروس (NCs).

توليد وتجميع النوى الخاصة بالفيروسات من الفيروسات المتزامنة التنفسية

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

تستخدم هذه الطريقة الطريقة المختلفة لمعالجة تحديات التعبير عن البروتين الفيروسي المؤتلف باستخدام بروتين فيروسي واحد P'كوصي لبروتين فيروسي آخر N'to الحصول على بروتينات N الخالية من الحمض النووي الريبي. يتم الحصول على البروتين N RSV خالية من الحمض النووي الريبي قبل تجميع الحمض النووي الريبي الفيروس محددة في nucleocapsid في المختبر. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة مع غيرها من الفيروسات غير مجزأة الشعور السلبي RNA.طريقة الاستنساخ الربط المستقل هو تقنية سريعة للحصول على بناء التعبير المشترك. لماذا أو الاختيارية وصمة عار المجهر الإلكتروني هو وسيلة سريعة لفحص تجميع كبيرة في الخلية الخام. نريد أن نقدم لك نصيحتين.أولا، احصل على عائد مرتفع ونتائج قوية لكل خطوة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. ثانيا، إعداد برامج مناسبة للكروماتوغرافيا وممارسة التقاط الشبكات مع ملقط. لبناء ثنائي cistronic من N و P التعبير المشترك, تنمو أربع ثقافات لتر واحد من خلايا سلالة E coli BL21DE3 في المتوسط LB في 37 درجة مئوية.عندما تصل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر إلى 0.6، خفض درجة الحرارة إلى 16 درجة مئوية. بعد ساعة واحدة، حث التعبير عن البروتين عن طريق العلاج مع 0.5 ملليمولار IPTG بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة إنفاق الكريات في 200 ملليلتر من العازلة تحلل.ازح الخلايا عن طريق سونيكيشن لمدة 15 دقيقة، مع ثلاث ثوان على، ثلاث ثوان قبالة البقول. وجمع الlysates عن طريق الطرد المركزي. تحميل supernatant في عمود جاذبية الكوبالت 2.5 في 10 سم، مع ما يقرب من 10 ملليلتر من الخرز.تم إعادة توازنه مسبقا مع 5 إلى 10 وحدات تخزين عمود من المخزن المؤقت للتحلل. وغسل العمود مع خمسة أحجام العمود من المخزن المؤقت B وخمسة مجلدات من التخزين المؤقت C.Use مجلدين من D العازلة لe elute البروتين من الخرز. وتوازن العمود Q مع خمسة وحدات تخزين ملليلتر واحد من المخزن المؤقت QA.استخدم مضخة تعلجية لتحميل العينة المخففة على العمود. قم بإذابة عمود Q المحمل على جهاز HPLC، إلى جانب مخازن QA وQB المؤقتة الطازجة. قم بتشغيل مغسلة المضخة لغسل الماكينة بنجاح باستخدام وحدة تخزين واحدة إلى وحدتي تخزين من مخازن QB و QA.بعد الغسيل الأخير، حدد معدل التدفق إلى ملليلتر واحد في الدقيقة، وحدد الأشعة فوق البنفسجية 1 إلى 280 نانومتر والأشعة فوق البنفسجية 2 إلى 260 نانومتر، باستخدام لوحة بئر عميقة 96 لجمع الكسور. ثم استخدم تطبيق تدرج تدريجي من ثلاثة إلى أربعة أحجام من كل تركيز من عامل elution لe elute البروتينات، بدءا من تركيز 0٪ QB وزيادة النسبة المئوية بنسبة 5٪ في كل مرة. سوف يبروتين N-0 P مجمع في تركيز العازلة 15٪QB.عزل البروتين عن طريق الترشيح هلام، في واحد من 30 سم عمود تنقية نطاق صغير، متوازن مع E.Then العازلة تحليل البروتين الذي يحتوي على كسور من قبل صفحة SDS. بالنسبة لتجميع النيوكليوكابسيد المحدد للفيروس، اخلط واحتضان مجمع N-0 P المنقى مع أوليغو الحمض النووي الريبي بنسبة جزيئية 1:1.5 في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. قبل equilibrate صغيرة النطاق تنقية هلام الترشيح العمود مع E.وإزالة أي هطول الأمطار عن طريق الطرد المركزي.تحميل supernatant، إلى حجم استبعاد العمود الكروماتوغرافيا. وقارن حجم استبعاد الصور الكروماتوغرافيا للبروتين إلى التجمع الجيش الملكي النيبالي، والبروتين وحده السيطرة على العينات، والجمع بين نسب نقاء الحمض النووي، لتحديد القمم التي هي الحمض النووي الريبي N تجميعها، N-0 P والجيش الملكي النيبالي الحرة. لتجميع مجمع ن الجيش الملكي النيبالي، وجمع كل من ن RNA كسور الذروة، وإجراء استخراج الحمض النووي الريبي، وتشغيل هلام صفحة اليوريا للتحقق مرتين من طول الحمض النووي الريبي محددة.لإعداد شبكة بقع سلبية للفحص المجهري الإلكتروني السلبي للبقع، استخدم لوحة حرارية لتسخين 5 مل من الماء المقطر المزدوج إلى الغليان وإضافة 37.5 ملليغرام منفورمات الأورانيل إلى الماء للحصول على محلول تلطيخ 0.75٪ من الأورانيل. نقل الحل إلى رقائق الألومنيوم المغطاة الكأس. وإضافة أربعة ميكرولترات من 10 هيدروكسيد الصوديوم المول.بعد 15 دقيقة من التحريك المحمي من الضوء، قم بتصفية المحلول من خلال فلتر 0.22 ميكرون في أنبوب اختبار. لجعل شبكات المجهر الإلكتروني المغلفة بالكربون مستمرة هيدروفيلية، ضع الشبكات في غرفة متصلة بإمدادات الطاقة وتطبيق الأيونات المشحونة سلبا على الشبكات. قطع وأضعاف اثنين من قبل اثنين بوصة شريط بارا فيلم.إضافة اثنين من 40 ميكرولتر قطرات من الماء المقطر إلى نهاية واحدة من الشريط. واثنين من 40 ميكرولتر قطرات من 0.75٪ محلول تلطيخ أورانيل formate إلى الطرف الآخر. إضافة ثلاثة ميكرولترات من عينة البروتين إلى كل شبكة.بعد دقيقة واحدة، قم بحجب الشبكات ضد ورق النشاف واغمس الشبكات مرتين في قطرات الماء المقطر. ومرة واحدة في أول قطرة محلول تلطيخ. ثم تزج الشبكة في قطرات محلول تلطيخ الثاني لمدة 30 ثانية، قبل النشاف الشبكات ضد ورقة النشاف لإزالة أي حل وصمة عار الزائدة والسماح للشبكات لتجف الهواء قبل التصوير.باستخدام هذا البروتوكول، يمكن الحصول على فيروس ثنائي التزامن اللانمطي القابل للذوبان على نطاق واسع N0 P المعقدة. في الإشريكية القولونية E، يتم التعبير عن الطول الكامل لأجزاء N وN-terminal من بروتينات P مع 10 X علامتها على بروتين N. استنادا إلى نسبة نقاء حمض النيوكليك امتصاص الأشعة فوق البنفسجية، N0 P تحتوي على كل من طول كامل N و N-TERMINAL P، ولكن لا تحتوي على الحمض النووي الريبي الخلوية.ويمكن بعد ذلك تحفيز N0 P المنقى وتجميعها في نواة مثل الجسيمات على شبكات المجهر الإلكتروني عن طريق الحضانة مع أوليغوس الحمض النووي الريبي محددة كما هو موضح. عند تنقية البروتين تجنب فقاعات الهواء أثناء تنقية العمود وتمييع العينة مع العازلة QA لضبط درجة الحموضة وتركيز الملح قبل تحميل العينة على العمود. الحرص على عقد شبكات المجهر الإلكتروني على الحافة الخارجية لتجنب تلويث الشبكات.وهذا سوف يساعدنا على تحديد غير إيجابية RSV الجينوم التعبئة الأسئلة، سواء كان ذلك اليد اليسرى أو اليد اليمنى هيكل هلي. بعد تلك الإجراءات وأصيلة قالب الجيش الملكي النيبالي ل RSV بوليمراز نشاط المقايسة يمكن القيام به. ويمكن استخدام هذا RSV الفيروسية nucleocapsid محددة لتحليل عالية الدقة كريو EM.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

دراسة الجمعية proteasome ومع المؤتلف Archaeal جسيم بروتيني وNondenaturing الصفحة: حالة لنهج موحد

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

والعزلة وقياسات الجهاز التنفسي من الميتوكوندريا من التمويل نبات

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

جيل مونومر Exon1 هونتينجتين الأصلية، وليس تمييز وييفات استخدام استراتيجية انصهار السومو

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

التعامل مع الخلايا الحية لبناء الجمعية الخلوية 3D مستقرة دون سقالة اصطناعية

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project

كيفية تثبيت البروتين: تحول الشاشات الاستقرار الحراري لفحوصات والتفاضلي نانو فلوريميتري في المشروع الفيروس العاشر

The Horizon2020 Virus-X project was established in 2015 to explore the virosphere of selected extreme biotopes and discover novel viral proteins. To ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

الهجين واضح/الأزرق الكهربائي الأصلي للفصل وتحليل المجمعات التنفسية الميتوكوندريا السلسلة الفائقة

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy

الهياكل على المستوى الجزيئي بين الوجهين من البوليمرات والجزيئات الحيوية التي تم الكشف عنها عن طريق التحليل الطيفي الاهتزازي لجيل التردد الكلي

As a second-order nonlinear optical spectroscopy, sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy has widely been used in investigating various ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

في الوقت الحقيقي ، وشبه التلقائي قياس الفلورسنت من الدرجة الهوائية السائل سطح المجري الجوي للخلايا الاساسيه الإنسان الظهاريه

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

تطوير التصوير عالي الدقة لتجميعات الفيروسات في السائل والجليد

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...