Name: generation and assembly of virus-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus
Uploaded: 2021-07-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus at JoVE.com

De onderzoeksprogramma's in het Liang-laboratorium in Emory worden ondersteund door het Us National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health (NIH) onder het toekenningsnummer R01GM130950 en het Research Start-Up Fund van emory University School of Medicine. De auteur erkent de leden van het Liang-laboratorium voor nuttige ondersteuning en kritische discussie.

1. Moleculair klonen
OPMERKING: Ligase Independent Cloning (LIC) werd gebruikt om een RSV bi-cistronic coexpressie constructie plasmide te maken. LIC is een methode ontwikkeld in het begin van de jaren 1990, die de 3'-5' Exo-activiteit van de T4 DNA-polymerase gebruikt om uitsteeksels te creëren met complementariteit tussen de vector en de DNA-insert21,22. De constructies zijn gemaakt met behulp van het 2BT-10 vector DN...

<ol>
	<li>Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+and+replication+of+nonsegmented+negative-strand+RNA+viruses.">Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).</li><li>Lamb, R. A., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields virology. , (2013).</li><li>Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+syncytial+virus:+virology,+reverse+genetics,+and+pathogenesis+of+disease.">Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).</li><li>Fearns, R., Deval, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+antiviral+approaches+for+respiratory+syncytial+virus+and+other+mononegaviruses:+Inhibiting+the+RNA+polymerase.">New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase.</a> Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).</li><li>Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+replication+by+respiratory+syncytial+virus+(RSV)+is+directed+by+the+N,+P,+and+L+proteins;+transcription+also+occurs+under+these+conditions+but+requires+RSV+superinfection+for+efficient+synthesis+of+full-length+mRNA.">RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA.</a> Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).</li><li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+metapneumovirus+polymerase+phosphoprotein+complex.">Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex.</a> Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).</li><li>Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+rabies+virus+polymerase+complex+from+electron+cryo-microscopy.">Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).</li><li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+respiratory+syncytial+virus+RNA+polymerase.">Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase.</a> Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).</li><li>Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+paramyxovirus+polymerase+complex+reveals+a+unique+methyltransferase-CTD+conformation.">Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).</li><li>Gilman, M. S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Respiratory+Syncytial+Virus+Polymerase+Complex.">Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex.</a> Cell. 179 (1), 193-204 (2019).</li><li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+L+Protein+of+Vesicular+Stomatitis+Virus+from+Electron+Cryomicroscopy.">Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy.</a> Cell. 162 (2), 314-327 (2015).</li><li>Jenni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Vesicular+Stomatitis+Virus+L+Protein+in+Complex+with+Its+Phosphoprotein+Cofactor.">Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor.</a> Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).</li><li>Renner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocapsid+assembly+in+pneumoviruses+is+regulated+by+conformational+switching+of+the+N+protein.">Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein.</a> Elife. 5, 12627 (2016).</li><li>Cox, R. M., Plemper, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+organization+of+paramyxovirus+particles.">Structure and organization of paramyxovirus particles.</a> Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).</li><li>Desfosses, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+vesicular+stomatitis+virus+nucleocapsid+into+a+bullet+shape.">Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape.</a> Nature Communications. 4, 1429 (2013).</li><li>Green, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+mechanism+for+RNA+encapsidation+by+negative-strand+RNA+viruses.">Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).</li><li>Jamin, M., Yabukarski, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsegmented+Negative-Sense+RNA+Viruses-Structural+Data+Bring+New+Insights+Into+Nucleocapsid+Assembly.">Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly.</a> Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).</li><li>Wan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+assembly+of+the+Ebola+virus+nucleocapsid.">Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid.</a> Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).</li><li>Mendes, A., Kuhn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphavirus+Nucleocapsid+Packaging+and+Assembly.">Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly.</a> Viruses. 10 (3), (2018).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+trackable+assembly+of+RNA-specific+nucleocapsids+of+the+respiratory+syncytial+virus.">In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).</li><li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+(LIC-PCR).">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).</li><li>Li, C., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation+independent+cloning+irrespective+of+restriction+site+compatibility.">Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility.</a> Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).</li><li>Green, R., Rogers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+chemically+competent+E.+coli.">Transformation of chemically competent E. coli.</a> Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).</li><li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM.">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li><li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Staining+and+Image+Classification+-+Powerful+Tools+in+Modern+Electron+Microscopy.">Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy.</a> Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).</li><li>Aebi, U., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glow+discharge+unit+to+render+electron+microscope+grids+and+other+surfaces+hydrophilic.">A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic.</a> Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).</li><li>Green, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Access+to+RNA+encapsidated+in+the+nucleocapsid+of+vesicular+stomatitis+virus.">Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus.</a> Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).</li><li>Alvarez Paggi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conformational+switch+balances+viral+RNA+accessibility+and+protection+in+a+nucleocapsid+ring+model.">A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).</li><li>Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+vesicular+stomatitis+virus+nucleoprotein-RNA+complex.">Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex.</a> Science. 313 (5785), 357-360 (2006).</li><li>Tawar, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+nucleocapsid-like+nucleoprotein-RNA+complex+of+respiratory+syncytial+virus.">Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus.</a> Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).</li><li>Galloux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+viral+phosphoprotein+binding+site+on+the+surface+of+the+respiratory+syncytial+nucleoprotein.">Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein.</a> Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).</li><li>Milles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembly+of+Measles+Virus+Nucleocapsid-like+Particles:+Kinetics+and+RNA+Sequence+Dependence.">Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence.</a> Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).</li><li>Desfosses, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+cryo-EM+structures+of+RNA-specific+measles+virus+nucleocapsids+provide+mechanistic+insight+into+paramyxoviral+replication.">Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).</li></ol>

De bekende nucleocapsid-achtige deeltjesstructuren (NCLP) van de niet-gesegmenteerde RNA-virussen met negatieve zin (NNS) tonen aan dat de geassembleerde NCLPs de complexe N met host cellulaire RNA 's zijn wanneer ze overexpressie vertonen in bacteriële of eukaryotische expressiesystemen15,16,17,18,19. Eerdere studies hebben geprobeerd om de RNA-vrije N te kr...

Niet-gesegmenteerde RNA-virussen (NNS) met een negatief gevoel omvatten veel significante menselijke pathogenen, zoals rabiës, ebola en respiratoir syncytieel virus (RSV)1,2. RSV is de belangrijkste oorzaak van aandoeningen van de luchtwegen zoals bronchiolitis en longontsteking bij jonge kinderen en oudere volwassenen wereldwijd3. Momenteel zijn er geen effectieve vaccins of antivirale therapieën beschikbaar om RSV4te voorkomen of te behandelen. Als onderdeel van de levenscyclus dient het RSV-genoom als sjabloon voor replicatie door het RSV RNA-afhankelijke RNA-polymerase om een antigenoom te produceren, dat op zijn beurt fungeert als de sjabloon om een nageslachtgenoom te genereren. Zowel genoom als antigenoom RNA's worden volledig ingekapseld door het nucleoproteïne (N) om de nucleocapsiden (NCs) te vormen3. Omdat de NCs dienen als sjablonen voor zowel replicatie als transcriptie door de RSV-polymerase, is een goede NC-assemblage cruciaal voor de polymerase om toegang te krijgen tot de sjablonen voorRNA-synthese 5. Interessant is dat op basis van de structurele analyses van de NNS virale polymerases wordt verondersteld dat verschillende N-eiwitten zich tijdelijk distantiëren van de NCs om de toegang tot het polymerase mogelijk te maken en na de RNA-synthese6, 7,8,9,10,11,12toegang te geven tot RNA .
Momenteel is de RSV RNA-polymerisatietest vastgesteld met behulp van gezuiverde RSV-polymerase op korte naakte RNA-sjablonen13,14. De activiteiten van de RSV-polymerase bereiken echter niet optimaal, zoals waargenomen in de niet-processieve en abortieve producten die door de RSV-polymerase worden gegenereerd bij het gebruik van naakte RNA-sjablonen. Het ontbreken van NC met virusspecifiek RNA is een primaire barrière voor het verdere mechanistische begrip van de RSV RNA-synthese. Daarom wordt het gebruik van een authentieke RNA-sjabloon een essentiële noodzaak om de fundamentele kennis van RSV RNA-synthese te bevorderen. De bekende structuren van de nucleocapsid-achtige deeltjes (NCLPs) van RSV en andere NNS RNA-virussen onthullen dat de RNA 's in de NCLPs ofwel willekeurige cellulaire RNA 's zijn ofwel gemiddelde virale genomische RNA 's15,16,17,18,19. Samen is de belangrijkste hindernis dat N niet specifiek aan cellulaire RNA's bindt om NCLPs te vormen wanneer N wordt overexpressed in de gastheercellen.
Om deze hindernis te overwinnen, hebben we eerst een protocol opgesteld om RNA-vrij (N0) te verkrijgen en N0 met authentiek viraal genomisch RNA in NCLPs20te assembleren. Het principe van dit protocol is het verkrijgen van een grote hoeveelheid recombinante RNA-vrije N (N0) door N samen met een chaperonne uit te drukken, het N-terminale domein van RSV-fosfoproteïne (PNTD). De gezuiverde N0P kan worden gestimuleerd en geassembleerd in NCLPs door RSV-specifieke RNA-oligo's toe te voegen, en tijdens het assemblageproces wordt de chaperonne PNTD verplaatst bij de toevoeging van RNA-oligo's.
Hier beschrijven we een protocol voor het genereren en assembleren van RSV RNA-specifieke NCs. In dit protocol beschrijven we het moleculair klonen, eiwitpreparaat, in vitro assemblage en validatie van de complexe assemblage. We benadrukken de kloonstrategie om bi-cistronic constructies te genereren voor eiwitcoexpressie voor moleculair klonen. Voor eiwitbereiding beschrijven we de procedures van celkweek, eiwitextractie en de zuivering van het eiwitcomplex. Vervolgens bespreken we de methode voor in vitro assemblage van de RSV RNA-specifieke NC's. Ten slotte gebruiken we grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) en negatieve vlekelektronenmicroscopie (EM) om de geassembleerde NCLPs te karakteriseren en te visualiseren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1293px;" width="1293">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Agarose</td>
			<td style="width:302px;">SIgma</td>
			<td style="width:301px;">A9539-500G</td>
			<td style="width:319px;">making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>concentrate the protein sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Ampicillin sodium</td>
			<td style="width:302px;">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td style="width:301px;">5118.111317A</td>
			<td>antibiotic for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">AseI</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">R0526S</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cobalt (High Density) Agarose Beads</td>
			<td style="width:302px;">Gold Bio</td>
			<td>H-310-500</td>
			<td>For purification of His-tag protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Corning LSE Digital Dry Bath Heater</td>
			<td style="width:302px;">CORNING</td>
			<td style="width:301px;">6885-DB</td>
			<td>Heate the sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">dCTP</td>
			<td style="width:302px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:301px;">10217016</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">dGTP</td>
			<td style="width:302px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:301px;">10218014</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Glycerol</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">G5516-4L</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HEPES</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">H3375-100G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HiTrap Q HP</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">GE29-0513-25</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Imidazole</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">I5513-100G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)</td>
			<td style="width:302px;">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td style="width:301px;">1116.071717A</td>
			<td>induce the expression of protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:302px;">VWR</td>
			<td style="width:301px;">47730-598</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor</td>
			<td style="width:302px;">SpectraLab</td>
			<td style="width:301px;">MSX-XL-2020</td>
			<td>sonicator for lysing cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Negative stain grids</td>
			<td style="width:302px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:301px;">CF400-Cu-TH</td>
			<td>For making negative stain grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">New Brunswick Innova 44/44R</td>
			<td style="width:302px;">eppendorf</td>
			<td style="width:301px;">M1282-0000</td>
			<td>Shaker for culturing the cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Nonidet P 40 Substitute</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">74385-1L</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">OneTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">M0480L</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:302px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:301px;">28706</td>
			<td>Purify DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">SSPI-HF</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">R3132S</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td>GE29-0915-96</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td>70099-3</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td style="width:302px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:301px;">36-101-0816</td>
			<td>Centrifuge, highest speed 20,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Trizma hydrochloride</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">T3253-250G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Uranyl Formate</td>
			<td style="width:302px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:301px;">22451</td>
			<td>making negative stain solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and assembly of virus-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus

Het gebruik van een authentieke RNA-sjabloon is van cruciaal belang om de fundamentele kennis van virale RNA-synthese te bevorderen die zowel mechanistische ontdekking als testontwikkeling in virologie kan begeleiden. De RNA-sjabloon van niet-gesegmenteerde RNA-virussen (NNS) met negatieve zin, zoals het respiratoire syncytiële virus (RSV), is niet alleen een RNA-molecuul, maar eerder een nucleoproteïne (N) ingekapseld ribonucleoproteïnecomplex. Ondanks het belang van het authentieke RNA-sjabloon, blijft het genereren en assembleren van een dergelijk ribonucleoproteïnecomplex verfijnd en vereist het diepgaande opheldering. De belangrijkste uitdaging is dat de overexpressed RSV N niet specifiek bindt aan cellulaire RNA's om willekeurige nucleocapsid-achtige deeltjes (NCLPs) te vormen. Hier hebben we een protocol opgesteld om RNA-vrije N (N0) eerst te verkrijgen door N samen met een chaperonnefofoproteïne (P) uit te drukken en vervolgens N0 met RNA-oligo's samen te stellen met de RSV-specifieke RNA-sequentie om virusspecifieke nucleocapsiden (NCs) te verkrijgen. Dit protocol laat zien hoe de moeilijkheid bij de voorbereiding van dit traditioneel uitdagende virale ribonucleoproteïnecomplex kan worden overwonnen.

Zuivering van RNA-vrij N0P eiwit Met dit protocol kan een grootschalig oplosbaar heterodiameer RSV N0P complex worden verkregen. De volledige lengte van N- en N-terminaal deel van P-eiwitten werd samen met 10X His-Tag op het N-eiwit in E. coliuitgedrukt . N0P werd gezuiverd met behulp van een kobaltkolom, ionenuitwisseling en grootte-uitsluitingschromatografie. N0P bevat zowel de volledige N- als N-terminal P, maar bevatte geen cellulair RNA op basi...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus at JoVE.com

Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

Voor een diepgaande mechanistische analyse van de RNA-synthese van het respiratoire syncytiële virus (RSV) rapporteren we een protocol voor het gebruik van de chaperonnefofoproteïne (P) voor coexpressie van het RNA-vrije nucleoproteïne (N0) voor de daaropvolgende in vitro assemblage van de virusspecifieke nucleocapsiden (NCs).

Generatie en assemblage van virusspecifieke nucleocapsiden van het respiratoire syncytiële virus

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

Deze methode maakt gebruik van de verschillende manieren om de recombinante virale eiwitexpressie-uitdagingen aan te pakken met behulp van een viraal eiwit P'als chaperonne voor een ander viraal eiwit N'om RNA-vrije N-eiwitten te verkrijgen. Het RNA-vrije RSV N-eiwit wordt verkregen voordat het virusspecifieke RNA in nucleocapsid in vitro wordt geassemblaged. De methode kan ook worden gebruikt met andere niet-gesegmenteerde negatieve zin RNA virussen.De ligatie onafhankelijke kloonmethode is een snelle techniek voor het verwerven van co-expressie constructies. Waarom of electieven vlek elektronenmicroscoop is een snelle methode voor het controleren van grote assembleren in ruwe cel. We willen je twee tips geven.Krijg eerst een hoge opbrengst en solide resultaten voor elke stap voordat u naar de volgende stap gaat. Ten tweede, stel de juiste programma's in voor chromatografie en oefen het oppakken van rasters met een tang. Voor bi-cistronic constructie van de N en P co-expressie, kweek vier een liter culturen van E coli BL21DE3 stamcellen in LB medium bij 37 graden Celsius.Wanneer de optische dichtheid op 600 nanometer 0,6 bereikt, verlaagt u de temperatuur tot 16 graden Celsius. Induceer na een uur eiwitexpressie door behandeling met 0,5 millimol IPTG 's nachts. Verzamel de volgende ochtend de cellen door centrifugeren en resuspend de pellets in 200 milliliter lysisbuffer.lyse de cellen door sonicatie gedurende 15 minuten, met drie seconden aan, drie seconden uit pulsen. En verzamel de lysaten door centrifugeren. Laad het supernatant in een kobaltzwaartekolom van 2,5 bij 10 centimeter, met ongeveer 10 milliliter kralen.Vooraf geëquilibreerd met 5 tot 10 kolomvolumes lysisbuffer. En was de kolom met vijf kolomvolumes van buffer B en vijf volumes buffer C.Gebruik twee volumes buffer D om het eiwit uit de kralen te elute. En equilibreer de Q-kolom met vijf hoeveelheden QA-buffer van één milliliter.Gebruik een peristaltische pomp om het verdunde monster op de kolom te laden. Smelt de geladen Q-kolom op de HPLC-machine, samen met nieuwe QA- en QB-buffers. Voer de pompwas uit om de machine met succes te wassen met één tot twee volumes QB- en QA-buffers.Stel na de laatste wasbeurt het debiet in op één milliliter per minuut en stel UV1 in op 280 nanometer en UV2 op 260 nanometer, met behulp van een 96 diepe putplaat om de fracties te verzamelen. Gebruik vervolgens een stapsgewijze gradiënttoepassing van drie tot vier volumes van elke concentratie elutiemiddel om de eiwitten te eluteren, beginnend bij een QB-concentratie van 0% en het percentage elke keer met 5% verhogen. Het N-0 P eiwitcomplex zal bij de 15%QB bufferconcentratie elute.Isoleer het eiwit door gelfiltratie, in een kleinschalige zuiveringskolom van één bij 30 centimeter, geëquilibreerd met buffer E.Analyseer vervolgens het eiwit dat fracties bevat per SDS-pagina. Voor virusspecifieke nucleocapsid assemblage, meng en incubeer het gezuiverde N-0 P complex met RNA oligo in een moleculaire verhouding van 1:1,5 bij kamertemperatuur gedurende een uur. Voor-equilibrate een kleinschalige zuivering gel filtratie kolom met buffer E.And verwijder eventuele neerslag door centrifugeren.Laad het supernatant in de kolom grootte-uitsluitingschromatografie. En vergelijk de grootte uitsluiting chromatografie beelden van het eiwit met RNA assemblage, en eiwit alleen controle monsters, het combineren van de nucleïnezuur zuiverheidsverhoudingen, om te bepalen welke pieken zijn de geassembleerde N RNA, N-0 P en vrije RNA. Om een N RNA-complex samen te stellen, verzamelt u alle N RNA-piekfracties, voert u een RNA-extractie uit en voert u een ureumpaginagel uit om de lengte van het specifieke RNA te controleren.Om een negatief vlekraster voor negatieve vlek elektronenmicroscopie te bereiden, gebruik een warmteplaat om 5 ml dubbel gedestilleerd water te verwarmen tot koken en voeg 37,5 milligram uranylformaat toe aan het water om een 0,75% uranyl formate kleuroplossing te verkrijgen. Breng de oplossing over op een met aluminiumfolie bedekt bekerglas. En voeg vier microliters van 10 molaire natriumhydroxide toe.Na 15 minuten roeren beschermd tegen licht, filtert u de oplossing door een 0,22 micron filter in een reageerbuis. Om de continue koolstof gecoate elektronenmicroscopieroosters hydrofiel te maken, plaatst u de roosters in een kamer die is aangesloten op een voeding en past u negatief geladen ionen toe op de roosters. Knip en vouw een twee bij twee inch parafilm strip.Voeg twee druppels gedestilleerd water van 40 microliter toe aan het ene uiteinde van de strip. En twee 40 microliter druppels van 0,75% uranyl formate kleuroplossing aan de andere kant. Voeg drie microliters eiwitmonster toe aan elk raster.Blokkeer na één minuut de roosters tegen opblazend papier en dompel de roosters twee keer in de gedestilleerde waterdruppels. En eenmaal in de eerste kleuringsoplossing druppel. Dompel vervolgens het rooster gedurende 30 seconden onder in de druppel van de tweede kleuringsoplossing, voordat u de roosters tegen vloeipapier blaast om overtollige vlekkenoplossing te verwijderen en de roosters aan de lucht te laten drogen voordat ze worden gebeelddrukt.Met behulp van dit protocol kan een grootschalig oplosbaar hetero dimerisch respiratoir syncytieel virus N0 P-complex worden verkregen. In E coli wordt de volledige lengte van N- en N-terminale porties van de P-eiwitten samen uitgedrukt met een 10 X Zijn tag op het N-eiwit. Op basis van de UV-absorptie nucleïnezuurzuiverheidsverhouding bevatte N0 P zowel de volledige lengte N- als N-terminal P, maar bevatte geen cellulair RNA.De gezuiverde N0 P kan vervolgens worden gestimuleerd en geassembleerd tot nucleocapsid-achtige deeltjes op elektronenmicroscopieroosters via incubatie met specifieke RNA-oligo's zoals aangetoond. Vermijd bij het zuiveren van het eiwit luchtbellen tijdens de kolomzuivering en verdun het monster met QA-buffer om de pH- en zoutconcentratie aan te passen voordat u het monster op de kolom laadt. Zorg ervoor dat u de elektronenmicroscopieroosters aan de buitenrand vasthoudt om te voorkomen dat de roosters vervuilen.Dit zal ons helpen om de niet-positieve RSV genoomverpakkingsvragen te bepalen, of het nu linkshandig of rechtshandige spiraalvormige structuur is. Volgens deze procedures en authentiek kan een RNA-sjabloon voor de RSV-polymeraseactiviteitstest worden uitgevoerd. En deze RSV virale specifieke nucleocapsid kan worden gebruikt voor de hoge resolutie cryo EM analyse.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Het onderzoeken van Proteasome Montage met Recombinant Archaea Proteasomen en denaturerende PAGE: The Case voor een gecombineerde aanpak

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolatie en respiratoire metingen van Mitochondria van Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Generatie van eigen, niet-gecodeerde Huntingtin Exon1 monomeer en fibrillen met behulp van een SUMO Fusion strategie

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Manipuleren van levende cellen om te bouwen van stabiele 3D cellulaire vergadering zonder kunstmatige steiger

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project

Hoe te stabiliseren van eiwit: stabiliteit schermen voor thermische verschuiven Assays en Nano Differential Scanning fluorimetrie in het Virus-X-Project

The Horizon2020 Virus-X project was established in 2015 to explore the virosphere of selected extreme biotopes and discover novel viral proteins. To ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Hybride duidelijke/blauwe inheemse elektroforese voor de scheiding en de analyse van mitochondrial Ademhalingsketen supercomplexen

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy

Interfaciale moleculaire-niveau structuren van polymeren en biomacromoleculen onthuld via Sum frequentie generatie Vibrationele spectroscopie

As a second-order nonlinear optical spectroscopy, sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy has widely been used in investigating various ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-time, semi-geautomatiseerde fluorescerende meting van de luchtweg oppervlak vloeibare pH van primaire menselijke luchtweg epitheelcellen

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Geavanceerde beeldvorming met hoge resolutie van virusassemblages in vloeistof en ijs

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...