Name: generation and assembly of virus-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus
Uploaded: 2021-07-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus at JoVE.com

Les programmes de recherche du laboratoire Liang à Emory sont soutenus par le National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) des États-Unis, les National Institutes of Health (NIH) sous le numéro de bourse R01GM130950 et le Research Start-Up Fund de l’École de médecine de l’Université Emory. L’auteur remercie les membres du laboratoire Liang pour leur soutien utile et leur discussion critique.

1. Clonage moléculaire
REMARQUE: Le clonage indépendant de ligase (LIC) a été utilisé pour fabriquer un plasmide de construction de coexpression bi-cistronique RSV. LIC est une méthode développée au début des années 1990, qui utilise l’activité Exo 3'-5' de l’ADN polymérase T4 pour créer des surplombs avec complémentarité entre le vecteur et l’insert d’ADN21,22. Les constructions ont été réalis?...

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	<li>Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+and+replication+of+nonsegmented+negative-strand+RNA+viruses.">Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).</li><li>Lamb, R. A., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields virology. , (2013).</li><li>Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+nucleocapsid-like+nucleoprotein-RNA+complex+of+respiratory+syncytial+virus.">Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus.</a> Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).</li><li>Galloux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+viral+phosphoprotein+binding+site+on+the+surface+of+the+respiratory+syncytial+nucleoprotein.">Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein.</a> Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).</li><li>Milles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembly+of+Measles+Virus+Nucleocapsid-like+Particles:+Kinetics+and+RNA+Sequence+Dependence.">Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence.</a> Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).</li><li>Desfosses, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+cryo-EM+structures+of+RNA-specific+measles+virus+nucleocapsids+provide+mechanistic+insight+into+paramyxoviral+replication.">Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).</li></ol>

Les structures connues de particules de type nucléocopside (NCLP) des virus à ARN non segmentés à sens négatif (NNS) montrent que les NCLPs assemblés sont le complexe N avec des ARN cellulaires hôtes lorsqu’ils sont surexprimés dans les systèmes d’expression bactérienne ou eucaryote15,16,17,18,19. Des études antérieures ont tenté d’obtenir l...

Les virus à ARN à sens négatif (NNS) non segmentés comprennent de nombreux agents pathogènes humains importants, tels que la rage, Ebola et le virus respiratoire syncytial (RSV)1,2. Le RSV est la principale cause de maladies respiratoires telles que la bronchiolite et la pneumonie chez les jeunes enfants et les adultes plus âgés dans le monde3. À l’heure actuelle, il n’existe aucun vaccin ou traitement antiviral efficace pour prévenir ou traiter le RSV4. Dans le cadre du cycle de vie, le génome du RSV sert de modèle pour la réplication par l’ARN polymérase dépendante de l’ARN du RSV pour produire un antigénique, qui à son tour agit comme modèle pour générer un génome de progéniture. Les ARN du génome et de l’antigène sont entièrement encapsulés par la nucléoprotéine (N) pour former les nucléocapsides (NCs)3. Étant donné que les NCs servent de modèles pour la réplication et la transcription par la polymérase RSV, un assemblage NC approprié est crucial pour que la polymérase accède aux modèles pour la synthèse de l’ARN5. Fait intéressant, sur la base des analyses structurelles des polymérases virales NNS, on émet l’hypothèse que plusieurs protéines N se dissocient transitoirement des NCs pour permettre l’accès de la polymérase et se rebinent à l’ARN après la synthèse de l’ARN6,7,8,9,10,11,12.
Actuellement, le test de polymérisation de l’ARN RSV a été établi en utilisant de la polymérase RSV purifiée sur de courts modèles d’ARN nu13,14. Cependant, les activités de la polymérase RSV n’atteignent pas optimales, comme observé dans les produits non processifs et abortifs générés par la polymérase RSV lors de l’utilisation de modèles d’ARN nu. L’absence de NC avec l’ARN spécifique au virus est un obstacle principal à la compréhension mécaniste de la synthèse de l’ARN du RSV. Par conséquent, l’utilisation d’un modèle d’ARN authentique devient un besoin critique pour faire progresser les connaissances fondamentales de la synthèse de l’ARN du RSV. Les structures connues des particules de type nucléoscopique (NCLPs) provenant du RSV et d’autres virus à ARN NNS révèlent que les ARN dans les NCLPs sont soit des ARN cellulaires aléatoires, soit des ARN génomiques viraux moyens15,16,17,18,19. Ensemble, le principal obstacle est que N se lie non spécifiquement aux ARN cellulaires pour former des NCLPs lorsque N est surexprimé dans les cellules hôtes.
Pour surmonter cet obstacle, nous avons établi un protocole pour obtenir d’abord sans ARN(N0)et assemblerN0 avec de l’ARN génomique viral authentique en NCLPs20. Le principe de ce protocole est d’obtenir une grande quantité de N(N0)sans ARN recombinant en co-exprimant N avec un chaperon, le domaine N-terminal de la phosphoprotéine RSV (PNTD). Le N0P purifié pourrait être stimulé et assemblé en NCLPs en ajoutant des oligos d’ARN spécifiques au RSV, et pendant le processus d’assemblage, le chaperon PNTD est déplacé lors de l’ajout d’oligos d’ARN.
Ici, nous détaillons un protocole pour la génération et l’assemblage de CN spécifiques à l’ARN RSV. Dans ce protocole, nous décrivons le clonage moléculaire, la préparation de protéine, l’assemblage in vitro, et la validation de l’assemblage complexe. Nous mettons en évidence la stratégie de clonage pour générer des constructions bi-cistroniques pour la coexpression de protéines pour le clonage moléculaire. Pour la préparation des protéines, nous décrivons les procédures de culture cellulaire, d’extraction des protéines et de purification du complexe protéique. Ensuite, nous discutons de la méthode d’assemblage in vitro des CN spécifiques à l’ARN RSV. Enfin, nous utilisons la chromatographie d’exclusion de taille (SEC) et la microscopie électronique à taches négatives (EM) pour caractériser et visualiser les NCLPs assemblés.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1293px;" width="1293">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Agarose</td>
			<td style="width:302px;">SIgma</td>
			<td style="width:301px;">A9539-500G</td>
			<td style="width:319px;">making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>concentrate the protein sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Ampicillin sodium</td>
			<td style="width:302px;">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td style="width:301px;">5118.111317A</td>
			<td>antibiotic for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">AseI</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">R0526S</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cobalt (High Density) Agarose Beads</td>
			<td style="width:302px;">Gold Bio</td>
			<td>H-310-500</td>
			<td>For purification of His-tag protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Corning LSE Digital Dry Bath Heater</td>
			<td style="width:302px;">CORNING</td>
			<td style="width:301px;">6885-DB</td>
			<td>Heate the sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">dCTP</td>
			<td style="width:302px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:301px;">10217016</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">dGTP</td>
			<td style="width:302px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:301px;">10218014</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Glycerol</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">G5516-4L</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HEPES</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">H3375-100G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HiTrap Q HP</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">GE29-0513-25</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Imidazole</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">I5513-100G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)</td>
			<td style="width:302px;">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td style="width:301px;">1116.071717A</td>
			<td>induce the expression of protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:302px;">VWR</td>
			<td style="width:301px;">47730-598</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor</td>
			<td style="width:302px;">SpectraLab</td>
			<td style="width:301px;">MSX-XL-2020</td>
			<td>sonicator for lysing cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Negative stain grids</td>
			<td style="width:302px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:301px;">CF400-Cu-TH</td>
			<td>For making negative stain grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">New Brunswick Innova 44/44R</td>
			<td style="width:302px;">eppendorf</td>
			<td style="width:301px;">M1282-0000</td>
			<td>Shaker for culturing the cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Nonidet P 40 Substitute</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">74385-1L</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">OneTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">M0480L</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:302px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:301px;">28706</td>
			<td>Purify DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">SSPI-HF</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">R3132S</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td>GE29-0915-96</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td>70099-3</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td style="width:302px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:301px;">36-101-0816</td>
			<td>Centrifuge, highest speed 20,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Trizma hydrochloride</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">T3253-250G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Uranyl Formate</td>
			<td style="width:302px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:301px;">22451</td>
			<td>making negative stain solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and assembly of virus-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus

L’utilisation d’un modèle d’ARN authentique est essentielle pour faire progresser les connaissances fondamentales sur la synthèse de l’ARN viral qui peuvent guider à la fois la découverte mécaniste et le développement d’essais en virologie. Le modèle d’ARN des virus à ARN non segmentés à sens négatif (NNS), tels que le virus respiratoire syncytial (RSV), n’est pas une molécule d’ARN seule, mais plutôt un complexe de ribonucléoprotéines encapsulées de nucléoprotéines (N). Malgré l’importance du modèle d’ARN authentique, la génération et l’assemblage d’un tel complexe ribonucléoprotéique restent sophistiqués et nécessitent une élucidation en profondeur. Le principal défi est que le RSV N surexprimé se lie non spécifiquement aux ARN cellulaires pour former des particules aléatoires de type nucléocoside (NCLPs). Ici, nous avons établi un protocole pour obtenir N sans ARN(N0)d’abord en co-exprimant N avec une phosphoprotéine chaperon (P), puis en assemblantN0 avec des oligos d’ARN avec la séquence d’ARN spécifique au RSV pour obtenir des nucléopsides spécifiques au virus (NCs). Ce protocole montre comment surmonter la difficulté dans la préparation de ce complexe viral traditionnellement provocant de ribonucleoprotein.

Purification de la protéine N0P sans ARN Avec ce protocole, un complexe hétérodimérique soluble RSVN0P à grande échelle peut être obtenu. Toute la longueur de la partie terminale N et N des protéines P a été co-exprimée avec 10X His-Tag sur la protéine N dans E. coli. N0P a été purifié utilisant une colonne de cobalt, un échange d’ions, et une chromatographie d’exclusion de taille. N0P contient à la fois le terminal N et N termi...

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Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

Pour l’analyse mécaniste approfondie de la synthèse respiratoire syncytiale d’ARN du virus (RSV), nous rapportons un protocole d’utilisation de la phosphoprotéine chaperon (P) pour la coexpression de la nucléoprotéine ARN-libre (N0)pour l’assemblage in vitro suivant des nucléocapsides virus-spécifiques (NCs).

Génération et assemblage de nucléoopsides spécifiques au virus du virus respiratoire syncytial

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

Cette méthode utilise les différentes manières de s’attaquer aux défis d’expression des protéines virales recombinantes en utilisant une protéine virale P’as chaperon pour une autre protéine virale N’pour obtenir des protéines N sans ARN. La protéine RSV N sans ARN est obtenue avant l’assemblage de l’ARN spécifique du virus en nucléopside in vitro. La méthode peut également être utilisée avec d’autres virus à ARN sensoriel négatif non segmentés.La méthode de clonage indépendante de la ligature est une technique rapide pour acquérir des constructions de co-expression. Pourquoi ou électifs microscope électronique de coloration est une méthode rapide pour vérifier grand assemblage dans la cellule brute. Nous voulons vous donner deux conseils.Tout d’abord, obtenez un rendement élevé et des résultats solides pour chaque étape avant de passer à l’étape suivante. Deuxièmement, cherchez des programmes appropriés pour la chromatographie et entraînez-vous à ramasser des grilles avec des pinces. Pour la construction bi-cistronique de la co-expression N et P, cultiver quatre cultures d’un litre de cellules de souche E coli BL21DE3 dans un milieu LB à 37 degrés Celsius.Lorsque la densité optique à 600 nanomètres atteint 0,6, abaissez la température à 16 degrés Celsius. Après une heure, induisez l’expression des protéines par traitement avec 0,5 millimolaire IPTG pendant la nuit. Le lendemain matin, prélever les cellules par centrifugation et ressusciter les pastilles dans 200 millilitres de tampon de lyse.lyser les cellules par sonication pendant 15 minutes, avec trois secondes sur, trois secondes sur les impulsions. Et recueillir les lysats par centrifugation. Chargez le surnageant dans une colonne gravitaire de cobalt de 2,5 par 10 centimètres, avec environ 10 millilitres de perles.Pré-équilibré avec 5 à 10 volumes de colonne de tampon de lyse. Et lavez la colonne avec cinq volumes de colonne de tampon B et cinq volumes de tampon C.Utilisez deux volumes de tampon D pour éluer la protéine des perles. Et équilibrer la colonne Q avec cinq volumes d’un millilitre de tampon QA.Utilisez une pompe péristaltique pour charger l’échantillon dilué sur la colonne. Faites fondre la colonne Q chargée sur la machine HPLC, ainsi que de nouveaux tampons QA et QB. Exécutez le lavage de la pompe pour laver avec succès la machine avec un à deux volumes de tampons QB et QA.Après le dernier lavage, réglez le débit à un millilitre par minute et réglez UV1 à 280 nanomètres et UV2 à 260 nanomètres, en utilisant une plaque de puits profonde de 96 pour collecter les fractions. Ensuite, utilisez une application de gradient par étapes de trois à quatre volumes de chaque concentration d’agent d’élution pour éluer les protéines, en commençant à une concentration de QB de 0% et en augmentant le pourcentage de 5% à chaque fois. Le complexe protéique N-0 P éluera à la concentration tampon de 15% QB.Isoler la protéine par filtration sur gel, dans une colonne de purification à petite échelle d’un par 30 centimètres, équilibrée avec le tampon E.Puis analyser les fractions contenant des protéines par page SDS. Pour l’assemblage nucléopside spécifique au virus, mélanger et incuber le complexe N-0 P purifié avec un oligo-ARN à un rapport moléculaire de 1:1,5 à température ambiante pendant une heure. Pré-équilibrer une colonne de filtration de gel de purification à petite échelle avec le tampon E.Et éliminer toute précipitation par centrifugation.Chargez le surnageant, à la colonne de chromatographie d’exclusion de taille. Et comparez les images de chromatographie d’exclusion de taille de la protéine à l’assemblage ARN, et les échantillons de contrôle de protéine seule, en combinant les rapports de pureté des acides nucléiques, pour identifier quels pics sont l’ARN N assemblé, N-0 P et l’ARN libre. Pour assembler un complexe d’ARN N, collectez toutes les fractions de crête de l’ARN N, effectuez une extraction de l’ARN et exécutez un gel de page d’urée pour vérifier la longueur de l’ARN spécifique.Pour préparer une grille de coloration négative pour la microscopie électronique à coloration négative, utilisez une plaque chauffante pour chauffer 5 mL d’eau double distillée à ébullition et ajoutez 37,5 milligrammes de formate d’uranyle à l’eau pour obtenir une solution de coloration au formate d’uranyle à 0,75%. Transférer la solution dans un bécher recouvert de papier d’aluminium. Et ajoutez quatre microlitres d’hydroxyde de sodium 10 molaires.Après 15 minutes d’agitation à l’abri de la lumière, filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 micron dans un tube à essai. Pour rendre les grilles de microscopie électronique à revêtement continu de carbone hydrophiles, placez les grilles dans une chambre connectée à une alimentation électrique et appliquez des ions chargés négativement sur les grilles. Coupez et pliez une bande de parafilm de deux par deux pouces.Ajouter deux gouttes d’eau distillée de 40 microlitres à une extrémité de la bande. Et deux gouttes de 40 microlitres de solution de coloration à 0,75% uranyl formate à l’autre extrémité. Ajouter trois microlitres d’échantillon de protéines à chaque grille.Après une minute, bloquez les grilles contre le papier buvard et trempez les grilles deux fois dans les gouttelettes d’eau distillée. Et une fois dans la première gouttelette de solution de coloration. Ensuite, plongez la grille dans la deuxième gouttelette de solution de coloration pendant 30 secondes, avant de éponger les grilles contre le papier buvard pour éliminer tout excès de solution de coloration et permettre aux grilles de sécher à l’air avant l’imagerie.Utilisant ce protocole, un complexe syncytial soluble de virus N0 P de virus respiratoire dimeric soluble à grande échelle peut être obtenu. Dans E coli, toute la longueur des portions N et N-terminales des protéines P est co-exprimée avec une étiquette 10 X His sur la protéine N. Basé sur le rapport de pureté d’acide nucléique d’absorbance UV, N0 P a contenu la pleine longueur N et le N-terminal P, mais n’a pas contenu l’ARN cellulaire.Le N0 P purifié pourrait alors être stimulé et assemblé en nucléospides comme des particules sur des grilles de microscopie électronique via l’incubation avec des oligos d’ARN spécifiques comme démontré. Lors de la purification de la protéine, évitez les bulles d’air pendant la purification de la colonne et diluez l’échantillon avec un tampon QA pour ajuster le pH et la concentration en sel avant de charger l’échantillon sur la colonne. Prenez soin de maintenir les grilles de microscopie électronique sur le bord extérieur pour éviter de contaminer les grilles.Cela nous aidera à déterminer les questions non positives d’emballage du génome du RSV, qu’il s’agisse d’une structure hélicoïdale gaucher ou droitière. En suivant ces procédures et authentiquement, un modèle d’ARN pour le test d’activité de la polymérase RSV peut être effectué. Et cette nucléopside virale spécifique au RSV peut être utilisée pour l’analyse cryo EM haute résolution.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Examiner Assemblée protéasome avec recombinant Archaeal Protéasomes et dénaturant PAGE: le cas pour une approche combinée

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Recherche

Biochimie

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