Name: generation and assembly of virus-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus
Uploaded: 2021-07-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus at JoVE.com

Die Forschungsprogramme im Liang-Labor in Emory werden vom US National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), den National Institutes of Health (NIH) unter der Vergabenummer R01GM130950 und dem Research Start-Up Fund der Emory University School of Medicine unterstützt. Der Autor dankt den Mitgliedern des Liang-Labors für hilfreiche Unterstützung und kritische Diskussion.

1. Molekulares Klonen
HINWEIS: Ligase Independent Cloning (LIC) wurde verwendet, um ein RSV bi-cistronic Coexpressionskonstrukt Plasmid herzustellen. LIC ist eine in den frühen 1990er Jahren entwickelte Methode, die die 3'-5' Exo-Aktivität der T4-DNA-Polymerase nutzt, um Überhänge mit Komplementarität zwischen dem Vektor und dem DNA-Insert21,22zu erzeugen. Die Konstrukte wurden unter Verwendung der 2BT-10-Vektor-DNA...

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	<li>Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+and+replication+of+nonsegmented+negative-strand+RNA+viruses.">Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).</li><li>Lamb, R. A., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields virology. , (2013).</li><li>Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+replication+by+respiratory+syncytial+virus+(RSV)+is+directed+by+the+N,+P,+and+L+proteins;+transcription+also+occurs+under+these+conditions+but+requires+RSV+superinfection+for+efficient+synthesis+of+full-length+mRNA.">RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA.</a> Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).</li><li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+metapneumovirus+polymerase+phosphoprotein+complex.">Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex.</a> Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).</li><li>Horwitz, J. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Respiratory+Syncytial+Virus+Polymerase+Complex.">Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex.</a> Cell. 179 (1), 193-204 (2019).</li><li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+L+Protein+of+Vesicular+Stomatitis+Virus+from+Electron+Cryomicroscopy.">Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy.</a> Cell. 162 (2), 314-327 (2015).</li><li>Jenni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Vesicular+Stomatitis+Virus+L+Protein+in+Complex+with+Its+Phosphoprotein+Cofactor.">Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor.</a> Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).</li><li>Renner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocapsid+assembly+in+pneumoviruses+is+regulated+by+conformational+switching+of+the+N+protein.">Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein.</a> Elife. 5, 12627 (2016).</li><li>Cox, R. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM.">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li><li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Staining+and+Image+Classification+-+Powerful+Tools+in+Modern+Electron+Microscopy.">Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy.</a> Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).</li><li>Aebi, U., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glow+discharge+unit+to+render+electron+microscope+grids+and+other+surfaces+hydrophilic.">A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic.</a> Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).</li><li>Green, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Access+to+RNA+encapsidated+in+the+nucleocapsid+of+vesicular+stomatitis+virus.">Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus.</a> Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).</li><li>Alvarez Paggi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conformational+switch+balances+viral+RNA+accessibility+and+protection+in+a+nucleocapsid+ring+model.">A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).</li><li>Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+vesicular+stomatitis+virus+nucleoprotein-RNA+complex.">Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex.</a> Science. 313 (5785), 357-360 (2006).</li><li>Tawar, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+nucleocapsid-like+nucleoprotein-RNA+complex+of+respiratory+syncytial+virus.">Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus.</a> Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).</li><li>Galloux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+viral+phosphoprotein+binding+site+on+the+surface+of+the+respiratory+syncytial+nucleoprotein.">Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein.</a> Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).</li><li>Milles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembly+of+Measles+Virus+Nucleocapsid-like+Particles:+Kinetics+and+RNA+Sequence+Dependence.">Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence.</a> Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).</li><li>Desfosses, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+cryo-EM+structures+of+RNA-specific+measles+virus+nucleocapsids+provide+mechanistic+insight+into+paramyxoviral+replication.">Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).</li></ol>

Die bekannten Nukleokapsid-ähnlichen Partikelstrukturen (NCLP) der nicht segmentierten NNS-RNA-Viren (Negative-Sense) zeigen, dass die zusammengesetzten NCLPs das komplexe N mit wirszellulären RNAs sind, wenn sie in bakteriellen oder eukaryotischen Expressionssystemen überexprimiert werden15,16,17,18,19. Frühere Studien haben versucht, das RNA-freie N mit ...

Nicht segmentierte NNS-RNA-Viren (Negative Sense) umfassen viele signifikante menschliche Krankheitserreger wie Tollwut, Ebola und respiratorisches Synzytialvirus (RSV)1,2. RSV ist die Hauptursache für Atemwegserkrankungen wie Bronchiolitis und Lungenentzündung bei kleinen Kindern und älteren Erwachsenen weltweit3. Derzeit stehen keine wirksamen Impfstoffe oder antiviralen Therapien zur Verfügung, um RSV4zu verhindern oder zu behandeln. Als Teil des Lebenszyklus dient das RSV-Genom als Vorlage für die Replikation durch die RSV-RNA-abhängige RNA-Polymerase, um ein Antigenom zu produzieren, das wiederum als Vorlage für die Erzeugung eines Nachkommengenoms dient. Sowohl Genom- als auch Antigenom-RNAs werden vollständig durch das Nukleoprotein (N) verkapselt, um die Nukleokapsiden (NCs) zu bilden3. Da die NCs als Vorlagen für die Replikation und Transkription durch die RSV-Polymerase dienen, ist die richtige NC-Assemblierung entscheidend, damit die Polymerase Zugang zu den Vorlagen für die RNA-Synthese erhält5. Interessanterweise wird aufgrund der Strukturanalysen der NNS-Viruspolymerasen die Hypothese aufgestellt, dass mehrere N-Proteine vorübergehend von den NCs dissoziieren, um den Zugang der Polymerase zu ermöglichen und nach der RNA-Synthese wieder an RNA zu binden6,7,8,9,10,11,12.
Derzeit wurde der RSV-RNA-Polymerisationsassay unter Verwendung von gereinigter RSV-Polymerase auf kurzen nackten RNA-Vorlagen13,14etabliert. Die Aktivitäten der RSV-Polymerase erreichen jedoch nicht optimal, wie bei den nicht-prozessiven und abtreibenden Produkten beobachtet wird, die von der RSV-Polymerase bei der Verwendung nackter RNA-Schablonen erzeugt werden. Das Fehlen von NC mit virusspezifischer RNA ist eine primäre Barriere für das weitere mechanistische Verständnis der RSV-RNA-Synthese. Daher wird die Verwendung einer authentischen RNA-Vorlage zu einem kritischen Bedürfnis, um das grundlegende Wissen über die RSV-RNA-Synthese zu erweitern. Die bekannten Strukturen der nucleocapsid-like particles (NCLPs) von RSV und anderen NNS-RNA-Viren zeigen, dass die RNAs in den NCLPs entweder zufällige zelluläre RNAs oder durchschnittliche virale genomische RNAssind 15,16,17,18,19. Zusammen besteht die Haupthürde darin, dass N unspezifisch an zelluläre RNAs bindet, um NCLPs zu bilden, wenn N in den Wirtszellen überexprimiert wird.
Um diese Hürde zu überwinden, haben wir ein Protokoll erstellt, um zuerst RNA-freie (N0)zu erhalten und N0 mit authentischer viraler genomischer RNA zu NCLPs20zusammenzusetzen. Das Prinzip dieses Protokolls besteht darin, eine große Menge rekombinantes RNA-freies N (N0)zu erhalten, indem N mit einem Chaperon, der N-terminalen Domäne des RSV-Phosphoproteins (PNTD),co-exprimiert wird. Das gereinigteN0P konnte stimuliert und durch Zugabe von RSV-spezifischen RNA-Oligos zu NCLPs zusammengesetzt werden, und während des Assemblierungsprozesses wird das Chaperon PNTD durch die Zugabe von RNA-Oligos verdrängt.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Erzeugung und Densembierung von RSV-RNA-spezifischen NCs. In diesem Protokoll beschreiben wir das molekulare Klonen, die Proteinpräparation, die In-vitro-Assemblierung und die Validierung der komplexen Assemblierung. Wir stellen die Klonierungsstrategie zur Generierung bi-cistronischer Konstrukte für die Proteinkoexpression für das molekulare Klonen vor. Für die Proteinpräparation beschreiben wir die Verfahren der Zellkultur, Proteinextraktion und der Aufreinigung des Proteinkomplexes. Anschließend diskutieren wir die Methode zur in vitro Assemblierung der RSV-RNA-spezifischen NCs. Schließlich verwenden wir Größenausschlusschromatographie (SEC) und negative Färbungselektronenmikroskopie (EM), um die zusammengesetzten NCLPs zu charakterisieren und zu visualisieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1293px;" width="1293">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Agarose</td>
			<td style="width:302px;">SIgma</td>
			<td style="width:301px;">A9539-500G</td>
			<td style="width:319px;">making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>concentrate the protein sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Ampicillin sodium</td>
			<td style="width:302px;">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td style="width:301px;">5118.111317A</td>
			<td>antibiotic for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">AseI</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">R0526S</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cobalt (High Density) Agarose Beads</td>
			<td style="width:302px;">Gold Bio</td>
			<td>H-310-500</td>
			<td>For purification of His-tag protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Corning LSE Digital Dry Bath Heater</td>
			<td style="width:302px;">CORNING</td>
			<td style="width:301px;">6885-DB</td>
			<td>Heate the sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">dCTP</td>
			<td style="width:302px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:301px;">10217016</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">dGTP</td>
			<td style="width:302px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:301px;">10218014</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Glycerol</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">G5516-4L</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HEPES</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">H3375-100G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HiTrap Q HP</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">GE29-0513-25</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Imidazole</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">I5513-100G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)</td>
			<td style="width:302px;">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td style="width:301px;">1116.071717A</td>
			<td>induce the expression of protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:302px;">VWR</td>
			<td style="width:301px;">47730-598</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor</td>
			<td style="width:302px;">SpectraLab</td>
			<td style="width:301px;">MSX-XL-2020</td>
			<td>sonicator for lysing cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Negative stain grids</td>
			<td style="width:302px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:301px;">CF400-Cu-TH</td>
			<td>For making negative stain grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">New Brunswick Innova 44/44R</td>
			<td style="width:302px;">eppendorf</td>
			<td style="width:301px;">M1282-0000</td>
			<td>Shaker for culturing the cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Nonidet P 40 Substitute</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">74385-1L</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">OneTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">M0480L</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:302px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:301px;">28706</td>
			<td>Purify DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">SSPI-HF</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">R3132S</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td>GE29-0915-96</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td>70099-3</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td style="width:302px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:301px;">36-101-0816</td>
			<td>Centrifuge, highest speed 20,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Trizma hydrochloride</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">T3253-250G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Uranyl Formate</td>
			<td style="width:302px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:301px;">22451</td>
			<td>making negative stain solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and assembly of virus-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus

Die Verwendung einer authentischen RNA-Vorlage ist entscheidend, um das grundlegende Wissen über die virale RNA-Synthese zu erweitern, das sowohl die mechanistische Entdeckung als auch die Assay-Entwicklung in der Virologie leiten kann. Die RNA-Vorlage von NNS-RNA-Viren (Nonsegmented Negative Sense) wie dem respiratorischen Synzytialvirus (RSV) ist kein RNA-Molekül allein, sondern ein Nukleoprotein (N) -verkapselter Ribonukleoproteinkomplex. Trotz der Bedeutung der authentischen RNA-Vorlage bleiben die Erzeugung und der Aufbau eines solchen Ribonukleoproteinkomplexes anspruchsvoll und erfordern eine eingehende Aufklärung. Die größte Herausforderung besteht darin, dass das überexprimierte RSV N unspezifisch an zelluläre RNAs bindet, um zufällige nukleokapsidähnliche Partikel (NCLPs) zu bilden. Hier haben wir ein Protokoll etabliert, um RNA-freies N (N0)zu erhalten, indem wir zuerst N mit einem Chaperonphosphoprotein (P) co-exprimieren und dann N0 mit RNA-Oligos mit der RSV-spezifischen RNA-Sequenz zusammensetzen, um virusspezifische Nukleokapside (NCs) zu erhalten. Dieses Protokoll zeigt, wie die Schwierigkeiten bei der Herstellung dieses traditionell herausfordernden viralen Ribonukleoproteinkomplexes überwunden werden können.

Aufreinigung des RNA-freienN0P-Proteins Mit diesem Protokoll kann ein großräumiger löslicher heterodimerer RSV N0P-Komplex erhalten werden. Die volle Länge des N- und N-terminalen Teils der P-Proteine wurde mit 10X His-Tag auf dem N-Protein in E. colico-exprimiert. N0P wurde mit einer Kobaltsäule, Ionenaustausch und Größenausschlusschromatographie gereinigt. N0P enthält sowohl das N- als auch das N-Terminal P in voller Länge, enthielt jedoc...

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Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

Für eine eingehende mechanistische Analyse der RNA-Synthese des respiratorischen Synzytialvirus (RSV) berichten wir über ein Protokoll zur Verwendung des Chaperonphosphoproteins (P) zur Koexpression des RNA-freien Nukleoproteins (N0)für die anschließende in vitro-Assemblierung der virusspezifischen Nukleokapside (NCs).

Generierung und Aufbau virusspezifischer Nukleokapsiden des respiratorischen Synzytialvirus

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

Diese Methode nutzt die verschiedenen Möglichkeiten, um die rekombinanten viralen Proteinexpressionsherausforderungen mit einem viralen Protein P'as Chaperon für ein anderes virales Protein N'zu bewältigen, um RNA-freie N-Proteine zu erhalten. Das RNA-freie RSV-N-Protein wird erhalten, bevor die virusspezifische RNA in vitro zu Nukleokapsid zusammengesetzt wird. Die Methode kann auch mit anderen nicht segmentierten RNA-Viren mit negativem Sinn verwendet werden.Die ligationsunabhängige Klonmethode ist eine schnelle Technik zum Erwerb von Co-Expressionskonstrukten. Warum oder Wahlfächer Fleckelektronenmikroskop ist eine schnelle Methode zur Überprüfung großer Assemble in Rohzellen. Wir möchten Ihnen zwei Tipps geben.Erhalten Sie zunächst eine hohe Ausbeute und solide Ergebnisse für jeden Schritt, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Zweitens, richten Sie geeignete Programme für die Chromatographie ein und üben Sie, Gitter mit einer Zette aufzunehmen. Für die bi-cistronische Konstruktion der N- und P-Koexpression werden vier Ein-Liter-Kulturen von E coli BL21DE3-Stammzellen in LB-Medium bei 37 Grad Celsius züchtet.Wenn die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,6 erreicht, senken Sie die Temperatur auf 16 Grad Celsius. Nach einer Stunde Proteinexpression durch Behandlung mit 0,5 Millimolar IPTG über Nacht induzieren. Am nächsten Morgen sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren die Pellets in 200 Milliliter Lysepuffer.Lyse der Zellen durch Beschallung für 15 Minuten, mit drei Sekunden an, drei Sekunden aus Impulsen. Und sammeln Sie die Lysate durch Zentrifugation. Laden Sie den Überstand in eine 2,5 x 10 Zentimeter große Kobalt-Schwerkraftsäule mit etwa 10 Millilitern Perlen.Vorgleichgewichtig mit 5 bis 10 Säulenvolumina Lysepuffer. Und waschen Sie die Säule mit fünf Säulenvolumina Puffer B und fünf Volumina Puffer C.Verwenden Sie zwei Volumen Puffer D, um das Protein aus den Perlen zu eluieren. Und gleicht die Q-Spalte mit fünf einem Milliliter Volumen QA-Puffer aus.Verwenden Sie eine Peristaltikpumpe, um die verdünnte Probe auf die Säule zu laden. Schmelzen Sie die geladene Q-Säule zusammen mit frischen QA- und QB-Puffern auf die HPLC-Maschine. Führen Sie die Pumpenwäsche aus, um die Maschine erfolgreich mit ein bis zwei Volumen QB- und QA-Puffern zu waschen.Stellen Sie nach der letzten Wäsche die Durchflussrate auf einen Milliliter pro Minute ein und stellen Sie UV1 auf 280 Nanometer und UV2 auf 260 Nanometer ein, wobei Sie eine 96-Tiefenbrunnenplatte verwenden, um die Fraktionen zu sammeln. Verwenden Sie dann eine schrittweise Gradientenapplikation von drei bis vier Volumina jeder Konzentration des Elutionsmittels, um die Proteine zu eluieren, beginnend bei einer QB-Konzentration von 0% und erhöhen Sie den Prozentsatz jedes Mal um 5%. Der N-0 P-Proteinkomplex eluiert bei der 15%igen QB-Pufferkonzentration.Isolieren Sie das Protein durch Gelfiltration in einer ein mal 30 Zentimeter kleinen Reinigungssäule, die mit Puffer E ausgeglichen ist.Analysieren Sie dann die proteinhaltigen Fraktionen nach SDS-Seite. Für die virusspezifische Nukleokapsidanordnung mischen und inkubieren Sie den gereinigten N-0 P-Komplex mit RNA-Oligo im Verhältnis 1:1,5 Molekül bei Raumtemperatur für eine Stunde. Vorgleichung einer kleinen Reinigungsgelfiltrationssäule mit Puffer E. Und Entfernen Sie alle Fällungen durch Zentrifugation.Laden Sie den Überstand in die Größenausschlusschromatographiesäule. Und vergleichen Sie die Größenausschlusschromatographiebilder des Proteins mit der RNA-Assemblierung und den Protein-allein-Kontrollproben, indem sie die Nukleinsäure-Reinheitsverhältnisse kombinieren, um zu identifizieren, welche Peaks die zusammengesetzte N-RNA, N-0 P und freie RNA sind. Um einen N-RNA-Komplex zusammenzustellen, sammeln Sie alle N-RNA-Peak-Fraktionen, führen Sie eine RNA-Extraktion durch und führen Sie ein Harnstoff-Seitengel aus, um die Länge der spezifischen RNA zu überprüfen.Um ein negatives Fleckengitter für die negative Fleckenelektronenmikroskopie vorzubereiten, verwenden Sie eine Wärmeplatte, um 5 ml doppelt destilliertes Wasser zum Kochen zu erhitzen, und fügen Sie dem Wasser 37,5 Milligramm Uranylformiat hinzu, um eine 0,75% Uranylformiat-Färbelösung zu erhalten. Geben Sie die Lösung in ein mit Aluminiumfolie überzogenes Becherglas. Und fügen Sie vier Mikroliter von 10 molaren Natriumhydroxid hinzu.Nach 15 Minuten vor Licht geschütztem Rühren die Lösung durch einen 0,22-Mikron-Filter in ein Reagenzglas filtrieren. Um die kontinuierlichen kohlenstoffbeschichteten Elektronenmikroskopiegitter hydrophil zu machen, legen Sie die Gitter in eine Kammer, die an eine Stromversorgung angeschlossen ist, und wenden Negativ geladene Ionen auf die Gitter an. Schneiden und falten Sie einen zwei mal zwei Zoll großen Parafilmstreifen.Fügen Sie zwei 40-Mikroliter-Tropfen destilliertes Wasser an ein Ende des Streifens hinzu. Und zwei 40-Mikroliter-Tropfen mit 0,75% Uranylformiat-Färbelösung am anderen Ende. Fügen Sie drei Mikroliter Proteinprobe zu jedem Gitter hinzu.Nach einer Minute die Gitter gegen Löschpapier blockieren und die Gitter zweimal in die destillierten Wassertröpfchen tauchen. Und einmal in der ersten Färbelösung Tröpfchen. Tauchen Sie dann das Gitter für 30 Sekunden in das zweite Färbelösungströpfchen, bevor Sie die Gitter gegen Löschpapier löschen, um überschüssige Fleckenlösung zu entfernen und die Gitter vor der Bildgebung an der Luft trocknen zu lassen.Mit diesem Protokoll kann ein großräumiger löslicher heterodimerer respiratorischer Synzytialvirus-N0-P-Komplex erhalten werden. In E coli wird die gesamte Länge der N- und N-terminalen Teile der P-Proteine mit einem 10 X His-Tag auf dem N-Protein co-exprimiert. Basierend auf dem Nukleinsäurereinheitsverhältnis der UV-Absorption enthielt N0 P sowohl das N- als auch das N-terminale P in voller Länge, enthielt jedoch keine zelluläre RNA.Das gereinigte N0 P konnte dann stimuliert und zu Nukleokapsid-ähnlichen Partikeln auf elektronenmikroskopischen Gittern durch Inkubation mit spezifischen RNA-Oligos zusammengesetzt werden, wie gezeigt. Vermeiden Sie bei der Reinigung des Proteins Luftblasen während der Säulenreinigung und verdünnen Sie die Probe mit QA-Puffer, um den pH-Wert und die Salzkonzentration einzustellen, bevor Sie die Probe auf die Säule laden. Achten Sie darauf, die Elektronenmikroskopiegitter am äußeren Rand zu halten, um eine Kontamination der Gitter zu vermeiden.Dies wird uns helfen, die nicht-positiven RSV-Genompackungsfragen zu bestimmen, unabhängig davon, ob es sich um eine linkshändige oder rechtshändige helikale Struktur handelt. Nach diesen Verfahren und authentisch kann eine RNA-Vorlage für den RSV-Polymerase-Aktivitätsassay durchgeführt werden. Und dieses RSV-virusspezifische Nukleokapsid kann für die hochauflösende Kryo-EM-Analyse verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Untersuchen Assemblierungsintermediate mit rekombinantem Archaeal Proteasomen und nicht denaturierenden PAGE: Die Argumente für einen kombinierten Ansatz

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Forschung

Biochemie

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation und Atemwege Messungen der Mitochondrien von Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Erzeugung von nativen, unmarkierten Huntingtin Exon1 Monomer und Fibrillen mit einem SUMO-Fusion-Strategie

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Bearbeiten von lebenden Zellen, stabile zelluläre 3D-Baugruppe ohne künstlichen Gerüst zu bauen

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project

Wie Protein zu stabilisieren: Stabilität-Bildschirme für thermische Verschiebung Assays und Nano-Differential Scanning Fluorimetry in den Virus-X-Projekt

The Horizon2020 Virus-X project was established in 2015 to explore the virosphere of selected extreme biotopes and discover novel viral proteins. To ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Hybrid Clear/Blaue Elektrophorese für die Trennung und Analyse von Mitochondrialen Respiratory Chain Supercomplexen

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy

Grenzflächenphysikalische Strukturen von Polymeren und Biomakromolekülen, die über sum frequency generation Vibrational Spectroscopy aufgedeckt werden

As a second-order nonlinear optical spectroscopy, sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy has widely been used in investigating various ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-Time, halbautomatisierte Fluoreszenzmessung der Luftbogenoberfläche Liquid pH der primären menschlichen Luftweg-Epithelzellen

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Weiterentwicklung der hochauflösenden Bildgebung von Virusanordnungen in Flüssigkeit und Eis

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...