Name: generation and assembly of virus-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus
Uploaded: 2021-07-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus at JoVE.com

תוכניות המחקר במעבדת ליאנג באמורי נתמכות על ידי המכון הלאומי האמריקאי למדעי הרפואה הכללית (NIGMS), המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) תחת מספר הפרס R01GM130950, וקרן הסטארט-אפ למחקר בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת אמורי. המחבר מכיר בחברי מעבדת ליאנג לתמיכה מועילה ודיון ביקורתי.

1. שיבוט מולקולרי
הערה: שיבוט עצמאי ליגאז (LIC) שימש להכנת RSV דו סיסטרוני דו-קיום לבנות פלסמיד. LIC היא שיטה שפותחה בתחילת שנות התשעים, המשתמשת בפעילות האקסו 3'-5 ' של פולימראז ה- T4 DNA כדי ליצור overhangs עם משלימות בין הווקטור לבין להוסיף DNA21,22. המב?...

<ol>
	<li>Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+and+replication+of+nonsegmented+negative-strand+RNA+viruses.">Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).</li><li>Lamb, R. A., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields virology. , (2013).</li><li>Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+syncytial+virus:+virology,+reverse+genetics,+and+pathogenesis+of+disease.">Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).</li><li>Fearns, R., Deval, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+antiviral+approaches+for+respiratory+syncytial+virus+and+other+mononegaviruses:+Inhibiting+the+RNA+polymerase.">New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase.</a> Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).</li><li>Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+replication+by+respiratory+syncytial+virus+(RSV)+is+directed+by+the+N,+P,+and+L+proteins;+transcription+also+occurs+under+these+conditions+but+requires+RSV+superinfection+for+efficient+synthesis+of+full-length+mRNA.">RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA.</a> Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).</li><li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+metapneumovirus+polymerase+phosphoprotein+complex.">Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex.</a> Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).</li><li>Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+rabies+virus+polymerase+complex+from+electron+cryo-microscopy.">Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).</li><li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+respiratory+syncytial+virus+RNA+polymerase.">Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase.</a> Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).</li><li>Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+paramyxovirus+polymerase+complex+reveals+a+unique+methyltransferase-CTD+conformation.">Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).</li><li>Gilman, M. S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Respiratory+Syncytial+Virus+Polymerase+Complex.">Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex.</a> Cell. 179 (1), 193-204 (2019).</li><li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+L+Protein+of+Vesicular+Stomatitis+Virus+from+Electron+Cryomicroscopy.">Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy.</a> Cell. 162 (2), 314-327 (2015).</li><li>Jenni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Vesicular+Stomatitis+Virus+L+Protein+in+Complex+with+Its+Phosphoprotein+Cofactor.">Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor.</a> Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).</li><li>Renner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocapsid+assembly+in+pneumoviruses+is+regulated+by+conformational+switching+of+the+N+protein.">Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein.</a> Elife. 5, 12627 (2016).</li><li>Cox, R. M., Plemper, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+organization+of+paramyxovirus+particles.">Structure and organization of paramyxovirus particles.</a> Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).</li><li>Desfosses, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+vesicular+stomatitis+virus+nucleocapsid+into+a+bullet+shape.">Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape.</a> Nature Communications. 4, 1429 (2013).</li><li>Green, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+mechanism+for+RNA+encapsidation+by+negative-strand+RNA+viruses.">Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).</li><li>Jamin, M., Yabukarski, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsegmented+Negative-Sense+RNA+Viruses-Structural+Data+Bring+New+Insights+Into+Nucleocapsid+Assembly.">Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly.</a> Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).</li><li>Wan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+assembly+of+the+Ebola+virus+nucleocapsid.">Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid.</a> Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).</li><li>Mendes, A., Kuhn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphavirus+Nucleocapsid+Packaging+and+Assembly.">Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly.</a> Viruses. 10 (3), (2018).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+trackable+assembly+of+RNA-specific+nucleocapsids+of+the+respiratory+syncytial+virus.">In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).</li><li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+(LIC-PCR).">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).</li><li>Li, C., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation+independent+cloning+irrespective+of+restriction+site+compatibility.">Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility.</a> Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).</li><li>Green, R., Rogers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+chemically+competent+E.+coli.">Transformation of chemically competent E. coli.</a> Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).</li><li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM.">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li><li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Staining+and+Image+Classification+-+Powerful+Tools+in+Modern+Electron+Microscopy.">Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy.</a> Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).</li><li>Aebi, U., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glow+discharge+unit+to+render+electron+microscope+grids+and+other+surfaces+hydrophilic.">A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic.</a> Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).</li><li>Green, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Access+to+RNA+encapsidated+in+the+nucleocapsid+of+vesicular+stomatitis+virus.">Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus.</a> Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).</li><li>Alvarez Paggi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conformational+switch+balances+viral+RNA+accessibility+and+protection+in+a+nucleocapsid+ring+model.">A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).</li><li>Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+vesicular+stomatitis+virus+nucleoprotein-RNA+complex.">Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex.</a> Science. 313 (5785), 357-360 (2006).</li><li>Tawar, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+nucleocapsid-like+nucleoprotein-RNA+complex+of+respiratory+syncytial+virus.">Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus.</a> Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).</li><li>Galloux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+viral+phosphoprotein+binding+site+on+the+surface+of+the+respiratory+syncytial+nucleoprotein.">Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein.</a> Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).</li><li>Milles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembly+of+Measles+Virus+Nucleocapsid-like+Particles:+Kinetics+and+RNA+Sequence+Dependence.">Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence.</a> Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).</li><li>Desfosses, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+cryo-EM+structures+of+RNA-specific+measles+virus+nucleocapsids+provide+mechanistic+insight+into+paramyxoviral+replication.">Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).</li></ol>

המבנים הידועים דמויי nucleocapsid חלקיקים (NCLP) של וירוסי RNA שליליים (NNS) ללא סגמנטים מראים כי NCLPs התאספו הם N מורכב עם RNAs הסלולר המארח כאשר overexpressed במערכות ביטוי חיידקי או אוקריוטי15,16,17,18,19. מחקרים קודמים ניסו ל...

וירוסי RNA שליליים (NNS) שאינם מוגנים כוללים פתוגנים אנושיים משמעותיים רבים, כגון כלבת, אבולה ווירוס סינסיטיאלי נשימתי (RSV)1,2. RSV הוא הגורם המוביל למחלות בדרכי הנשימה כגון ברונכיוליטיס ודלקת ריאות אצל ילדים צעירים ומבוגרים ברחבי העולם3. נכון לעכשיו, אין חיסונים יעילים או טיפולים אנטי ויראליים זמינים כדי למנוע או לטפל RSV4. כחלק ממחזור החיים, הגנום RSV משמש כתבנית לשכפול על ידי פולימראז RNA תלוי RSV לייצר אנטיגנום, אשר בתורו פועל כתבנית כדי ליצור גנום צאצאים. הן הגנום והן האנטיגנום RNAs הם עטופים לחלוטין על ידי נוקלאופרוטין (N) כדי ליצור את nucleocapsids (NCs)3. מכיוון שה- NCs משמשים כתבניות הן עבור שכפול והן עבור שעתוק על-ידי פולימראז RSV, הרכבת NC נכונה חיונית עבור הפולימראז כדי לקבל גישה לתבניות עבור סינתזת RNA5. מעניין, בהתבסס על ניתוחים מבניים של פולימראז נגיפי NNS, הוא שיערו כי מספר חלבוני N להתיר באופן חולף מן NCs כדי לאפשר את הגישה של פולימראז rebind ל- RNA לאחר סינתזת RNA6,7,8,9,10,11,12.
נכון לעכשיו, מבחני פולמור RNA RSV הוקמה באמצעות פולימראז RSV מטוהר על תבניות RNA עירום קצר13,14. עם זאת, הפעילויות של פולימראז RSV אינן מגיעות אופטימלית, כפי שנצפה במוצרים שאינם מעובדים וביטול שנוצר על ידי פולימראז RSV בעת שימוש בתבניות RNA עירום. חוסר NC עם RNA ספציפי לנגיף הוא מחסום עיקרי להבנה מכנית נוספת של סינתזת RNA RSV. לכן, שימוש בתבנית RNA אותנטית הופך לצורך קריטי כדי לקדם את הידע הבסיסי של סינתזת RNA RSV. המבנים הידועים של חלקיקים דמויי nucleocapsid (NCLPs) מ RSV ווירוסי RNA NNS אחרים מגלים כי RNAs ב- NCLPs הם או RNAs הסלולר אקראי או ממוצע RNAs גנומי ויראלי15,16,17,18,19. יחד, המשוכה העיקרית היא ש- N נקשר באופן לא ספציפי ל- RNAs סלולריים כדי ליצור NCLP כאשר N מתרשם יתר על ה- 0 בתאים המארחים.
כדי להתגבר על משוכה זו, הקמנו פרוטוקול כדי להשיג RNA חינם (N0)הראשון להרכיב N0 עם RNA גנומי ויראלי אותנטי לתוך NCLPs20. העיקרון של פרוטוקול זה הוא להשיג כמות גדולה של N ללא רנ"א רקומביננטי (N0)על ידי שיתוף להביע N עם מלווה, תחום N-מסוף של RSV פוספופרוטאין (PNTD). N0P מטוהר יכול להיות מגורה והרכיב לתוך NCLPs על ידי הוספת אוליגוס RNA ספציפי RSV, ובמהלך תהליך ההרכבה, המלווה PNTD נעקר על תוספת של אוליגוס RNA.
כאן, אנו מפרטים פרוטוקול עבור הדור וההרכבה של NCs ספציפיים RNA RSV. בפרוטוקול זה אנו מתארים את השיבוט המולקולרי, הכנת החלבון, הרכבת במבחנה ואימות ההרכבה המורכבת. אנו מדגישים את אסטרטגיית השיבוט כדי ליצור מבנים דו-סיסטרוניים לדו-קיום חלבונים לשיבוט מולקולרי. להכנת חלבונים, אנו מתארים את ההליכים של תרבית התא, מיצוי החלבון וטיהור קומפלקס החלבון. לאחר מכן אנו דנים בשיטה להרכבה במבחנה של NCs ספציפיים RNA RSV. לבסוף, אנו משתמשים כרומטוגרפיה אי-הכללת גודל (SEC) ומיקרוסקופ אלקטרוני כתם שלילי (EM) כדי לאפיין לדמיין ותמחה את NCLPs התאספו.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1293px;" width="1293">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Agarose</td>
			<td style="width:302px;">SIgma</td>
			<td style="width:301px;">A9539-500G</td>
			<td style="width:319px;">making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>concentrate the protein sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Ampicillin sodium</td>
			<td style="width:302px;">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td style="width:301px;">5118.111317A</td>
			<td>antibiotic for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">AseI</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">R0526S</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cobalt (High Density) Agarose Beads</td>
			<td style="width:302px;">Gold Bio</td>
			<td>H-310-500</td>
			<td>For purification of His-tag protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Corning LSE Digital Dry Bath Heater</td>
			<td style="width:302px;">CORNING</td>
			<td style="width:301px;">6885-DB</td>
			<td>Heate the sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">dCTP</td>
			<td style="width:302px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:301px;">10217016</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">dGTP</td>
			<td style="width:302px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:301px;">10218014</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Glycerol</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">G5516-4L</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HEPES</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">H3375-100G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HiTrap Q HP</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">GE29-0513-25</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Imidazole</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">I5513-100G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)</td>
			<td style="width:302px;">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td style="width:301px;">1116.071717A</td>
			<td>induce the expression of protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:302px;">VWR</td>
			<td style="width:301px;">47730-598</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor</td>
			<td style="width:302px;">SpectraLab</td>
			<td style="width:301px;">MSX-XL-2020</td>
			<td>sonicator for lysing cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Negative stain grids</td>
			<td style="width:302px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:301px;">CF400-Cu-TH</td>
			<td>For making negative stain grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">New Brunswick Innova 44/44R</td>
			<td style="width:302px;">eppendorf</td>
			<td style="width:301px;">M1282-0000</td>
			<td>Shaker for culturing the cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Nonidet P 40 Substitute</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">74385-1L</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">OneTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">M0480L</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:302px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:301px;">28706</td>
			<td>Purify DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">SSPI-HF</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">R3132S</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td>GE29-0915-96</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td>70099-3</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td style="width:302px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:301px;">36-101-0816</td>
			<td>Centrifuge, highest speed 20,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Trizma hydrochloride</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">T3253-250G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Uranyl Formate</td>
			<td style="width:302px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:301px;">22451</td>
			<td>making negative stain solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and assembly of virus-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus

השימוש בתבנית RNA אותנטית הוא קריטי כדי לקדם את הידע הבסיסי של סינתזת RNA ויראלית שיכולה להנחות הן גילוי מכני והן פיתוח מבחנים בוירולוגיה. תבנית ה- RNA של וירוסי RNA שליליים (NNS) שאינם מוגנים, כגון הנגיף הסינסיטיאלי הנשימתי (RSV), אינה מולקולת RNA בלבד אלא קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין עטוף נוקלאופרטאין (N). למרות החשיבות של תבנית RNA אותנטית, הדור וההרכבה של קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין כזה נשארים מתוחכמים ודורשים הבהרת עומק. האתגר העיקרי הוא כי N RSV overexpressed נקשר באופן לא ספציפי RNAs הסלולר כדי ליצור חלקיקים אקראיים דמויי nucleocapsid (NCLPs). כאן, הקמנו פרוטוקול כדי להשיג N ללא RNA (N0)תחילה על ידי שיתוף הבעה N עם phosphoprotein מלווה (P), ולאחר מכן הרכבת N0 עם אוליגוס RNA עם רצף RNA ספציפי RSV כדי להשיג נוקליקופסידים ספציפיים לנגיף (NCs). פרוטוקול זה מראה כיצד להתגבר על הקושי בהכנת מתחם ריבונוקלאופרוטאין ויראלי מאתגר באופן מסורתי.

טיהור חלבון N0P נטול RNA עם פרוטוקול זה, ניתן להשיג קומפלקס RSV N0P הטרודימרי מסיס בקנה מידה גדול. האורך המלא של חלק N ו- N מסוף של חלבוני P באו לידי ביטוי במשותף עם 10X His-Tag על חלבון N ב E. coli. N 0 Pטוהרבאמצעות כרומטוגרפיה של אי-הכללת קובלט, חילופי יון וגודל. N0P מכיל ה...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus at JoVE.com

Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

לניתוח מכני מעמיק של סינתזת RNA של הנגיף הסינסיטיאלי הנשימתי (RSV), אנו מדווחים על פרוטוקול של ניצול הפוספופרוטאין המלווה (P) לצורך דו-קיום של הנוקליאופרוטאין (N0)נטול ה- RNA להרכבה במבחנה של הגרעינים הספציפיים לנגיף (NCs).

יצירה והרכבה של נוקלאוקפסידים ספציפיים לווירוסים של הנגיף הסינכרוני הנשימתי

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

שיטה זו מנצלת את הדרך השונה להתמודד עם אתגרי ביטוי החלבון הנגיפי הרקומביננטי באמצעות חלבון ויראלי אחד P'as chaperone עבור חלבון ויראלי אחר N'כדי להשיג חלבוני N ללא RNA. חלבון RSV N ללא RNA מתקבל לפני הרכבת ה- RNA הספציפי לנגיף לגרעין במבחנה. השיטה יכולה לשמש גם עם וירוסי RNA אחרים שאינם מפולחים תחושה שלילית.שיטת השיבוט הבלתי תלויה של הקשירה היא טכניקה מהירה לרכישת מבני ביטוי משותף. למה או electives מיקרוסקופ אלקטרונים כתם היא שיטה מהירה לבדיקת הרכבה גדולה בתא גלם. אנחנו רוצים לתת לך שני טיפים.ראשית, קבל תשואה גבוהה ותוצאות מוצקות עבור כל שלב לפני שתעבור לשלב הבא. שנית, להגדיר תוכניות מתאימות כרומטוגרפיה ולתרגל להרים רשתות עם מלקחיים. לבנייה דו-סיסטרונית של הביטוי המשותף N ו- P, לגדל ארבע תרביות ליטר אחד של E coli BL21DE3 תאי זן במדיום LB ב 37 מעלות צלזיוס.כאשר הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר מגיע 0.6, להוריד את הטמפרטורה ל 16 מעלות צלזיוס. לאחר שעה אחת, לגרום ביטוי חלבון על ידי טיפול עם 0.5 מילימולאר IPTG לילה. למחרת בבוקר, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ו resuspend כדורי ב 200 מיליליטר של מאגר תמוגה.lyse התאים על ידי sonication במשך 15 דקות, עם שלוש שניות על, שלוש שניות את הפעימות. ולאסוף את lysates על ידי צנטריפוגה. לטעון את supernatant לתוך 2.5 על ידי 10 ס"מ קובלט עמוד הכבידה, עם כ 10 מיליליטר של חרוזים.שווה ערך מראש עם 5 עד 10 עמודות של מאגר תמוגה. ולשטוף את העמודה עם חמישה כרכים עמודות של חוצץ B וחמישה כרכים של חוצץ C.Use שני כרכים של חיץ D כדי elute החלבון מן החרוזים. ולהשוות את עמודת Q עם חמישה כרכים מיליליטר אחד של מאגר QA.השתמש במשאבה פריסטלית כדי לטעון את המדגם המדולל על העמודה. הפשר את עמודת ה- Q שנטענה למכונת HPLC, יחד עם מאגרי QA ו- QB טריים. הפעל את שטיפת המשאבה כדי לשטוף בהצלחה את המכונה עם נפח אחד עד שני כרכים של מאגרי QB ו- QA.לאחר הכביסה האחרונה, להגדיר את קצב הזרימה מיליליטר אחד לדקה, ולהגדיר UV1 כדי 280 ננומטר ו UV2 כדי 260 ננומטר, באמצעות צלחת באר עמוקה 96 כדי לאסוף את השברים. לאחר מכן השתמש ביישום הדרגתי צעד של שלושה עד ארבעה כרכים של כל ריכוז של סוכן elution כדי elute את החלבונים, החל ריכוז 0%QB ולהגדיל את האחוז על ידי 5%בכל פעם. קומפלקס החלבון N-0 P יהיה elute בריכוז חיץ 15%QB.לבודד את החלבון על ידי סינון ג'ל, בעמודת טיהור בקנה מידה קטן של 30 ס"מ, שווה עם חיץ E.Then לנתח את החלבון המכיל שברים על ידי דף SDS. עבור הרכבה nucleocapsid ספציפי וירוס, לערבב ולהדגיר את קומפלקס N-0 P מטוהר עם אוליגו RNA ביחס מולקולרי 1:1.5 בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. מראש לשוויון עמודת סינון ג'ל טיהור בקנה מידה קטן עם חיץ E.ולהסיר כל משקעים על ידי צנטריפוגה.טען את העל-טבעי, לעמודת הכרומטוגרפיה של אי-הכללת הגודל. ולהשוות את תמונות הכרומטוגרפיה של הדרת הגודל של החלבון להרכבת RNA, ודגימות בקרה של חלבונים בלבד, המשלבות את יחסי טוהר חומצת הגרעין, כדי לזהות אילו פסגות הן N RNA, N-0 P ו- RNA חינם. כדי להרכיב קומפלקס N RNA, לאסוף את כל שברי השיא N RNA, לבצע מיצוי RNA, ולהפעיל ג'ל דף אוריאה כדי לבדוק שוב את אורך RNA הספציפי.כדי להכין רשת כתמים שלילית עבור מיקרוסקופ אלקטרונים כתם שלילי, השתמש בצלחת חום כדי לחמם 5 מ"ל של מים מזוקקים כפולים לרתיחה ולהוסיף 37.5 מיליגרם של אורניל formate למים כדי להשיג 0.75% אורניל תמיסת הכתמת אסיר. מעבירים את הפתרון לכיסוי רדיד אלומיניום. ולהוסיף ארבעה מיקרוליטרים של 10 נתרן הידרוקסידי טוחן.לאחר 15 דקות של ערבוב מוגן מפני אור, לסנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 מיקרון לתוך מבחנה. כדי להפוך את רשתות מיקרוסקופ אלקטרונים מצופות פחמן רציפות הידרופילית, למקם את הרשתות בתא מחובר לאספקת חשמל ולהחיל יונים טעונים שלילית על הרשתות. חותכים ומקפלים רצועת פארפילם בגודל 2 על 2 אינץ'.מוסיפים שתי טיפות 40 מיקרוליטר של מים מזוקקים לקצה אחד של הרצועה. ושתי טיפות 40 מיקרוליטר של 0.75% אורניל לפתרון מכתים את הקצה השני. הוסף שלושה מיקרוליטרים של דגימת חלבון לכל רשת.לאחר דקה אחת, לחסום את הרשתות נגד נייר סופג לטבול את הרשתות פעמיים טיפות מים מזוקקים. ופעם אחת בטיפת פתרון הכתמים הראשונה. ואז לטבול את הרשת טיפת פתרון הכתם השני במשך 30 שניות, לפני סופג את הרשתות נגד נייר סופג כדי להסיר כל פתרון כתם עודף ומאפשר לרשתות להתייבש באוויר לפני ההדמיה.באמצעות פרוטוקול זה, בקנה מידה גדול מסיס הטרו דימרי וירוס סינקטיאל N0 P קומפלקס ניתן להשיג. ב- E coli, האורך המלא של חלקים N ו- N-מסוף של חלבוני P באים לידי ביטוי במשותף עם 10 X התג שלו על חלבון N. בהתבסס על יחס טוהר חומצת גרעין ספיגת UV, N0 P הכיל הן N באורך מלא N ו- N-מסוף P, אך לא הכיל RNA הסלולר.N0 P מטוהר אז יכול להיות מגורה ומורכב לתוך nucleocapsid כמו חלקיקים על רשתות מיקרוסקופיה אלקטרונים באמצעות דגירה עם אוליגוס RNA ספציפי כפי שהוכח. בעת טיהור החלבון למנוע בועות אוויר במהלך טיהור העמודה לדלל את המדגם עם מאגר QA כדי להתאים את ה- pH ואת ריכוז המלח לפני טעינת המדגם על העמודה. יש להקפיד להחזיק את רשתות מיקרוסקופ אלקטרונים בקצה החיצוני, כדי למנוע זיהום הרשתות.זה יעזור לנו לקבוע את שאלות אריזת הגנום RSV לא חיובי, אם זה שמאלי או מבנה סלילי ימני. בעקבות הליכים אלה ותבנית RNA אותנטית עבור בדיקת פעילות פולימראז RSV ניתן לבצע. וזה RSV ויראלי ספציפי nucleocapsid יכול לשמש לניתוח CRYO EM ברזולוציה גבוהה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

בחינת העצרת הפרוטאזום עם רקומביננטי Archaeal הפרוטאזומים ועמוד Nondenaturing: The Case for גישה משולבת

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

בידוד, מדידות הנשימה של המיטוכונדריה מ תודרנית לבנה

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

דור של Huntingtin Exon1 טבעית, לא מתויגות מונומר, הסיבים משתמש באסטרטגיה פיוז'ן סומו

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

מניפולציה מתאים חיים לבנות יציב הרכבה הסלולר 3D ללא לגרדום מלאכותי

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project

איך לייצב את חלבון: מסכי יציבות תרמית משמרת מבחני ו ננו דיפרנציאלית סריקה Fluorimetry בפרוייקט וירוס-X

The Horizon2020 Virus-X project was established in 2015 to explore the virosphere of selected extreme biotopes and discover novel viral proteins. To ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

אלקטרופורזה היברידית ברורה/כחולה עבור הפרדה וניתוח של שרשרת נשימה מיטוכונדריאלי מערכות-העל

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy

מבנים ברמת הפנים המולקולריים של פולימרים וBiomacromolecules מתגלים דרך תדר סיכום הדור ספקטרוסקופיה ויברtional

As a second-order nonlinear optical spectroscopy, sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy has widely been used in investigating various ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

בזמן אמת, חצי אוטומטי מדידה פלורסנט של משטח נתיב האוויר הנוזלי של ה-pH העיקרי של תאים אפיתל דרכי האוויר האנושי

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

קידום הדמיה ברזולוציה גבוהה של מכלולי וירוסים בנוזלים ובקרח

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...